DNA分子标记技术研究进展

DNA分子标记技术研究进展遗传标记在遗传学的建立和发展过程中有着举足轻重的作用，随着遗传学的进一步发展和分子生物学的异军突起，遗传标记先后相应地经历了形态标记、细胞学标记、生化标记和DNA分子标记四个发展阶段。

前三种标记都是以基因表达的结果为基础的，是对基因的间接反映；而DNA分子标记则是DNA水平遗传变异的直接反映，它具有能对各个发育时期的个体、各个组织、器官甚至细胞作出“中性”以及操作简便等特点。

正是这些特点，奠定了它极其广泛的应用基础。

DNA分子标记本质上是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异特DNA片段[1]。

DNA分子标记大多以电泳谱带的形式表现生物个体之间DNA差异，通常也称为DNA的指纹图谱。

在过去10多年中，分子标记技术得到了突飞猛进的发展，至今已有几十种分子标记技术相继出现，并在基因库构建、基因克隆、基因组作图、基因定位、作物遗传育种、植物亲缘关系鉴别等各个研究领域得到了广泛的应用。

1．第一代分子标记1.1 RFLP标记技术1980年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ，RFLP)可以作为遗传标记，开创了直接应用DNA多态性的新阶段，是最早应用的分子标记技术[2]。

RFLP是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小，反映DNA分子上不同酶切位点的分布情况，因此DNA序列上的微小变化，甚至1个核苷酸的变化，也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生，导致酶切片段长度的变化。

RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点，结果稳定可靠，重复性好，特别适应于构建遗传连锁图。

但是，在进行RFLP分析时，需要该位点的DNA片段做探针，用放射性同位素及核酸杂交技术，既不安全又不易自动化。

另外，RFLP对DNA多态性检出的灵敏度不高，RFLP连锁图上还有很多大的空间区[3]。

1.2 RAPD标记技术为了克服RFLP技术上的缺点，Williams等[4]于1990年建立了随机扩增多态DNA(Randomamplified polymorphic DNA ，RAPD)技术，由于其独特的检测DNA多态性的方式使得RAPD技术很快渗透于基因研究的各个领域。

RAPD是建立于PCR基础之上的分子标记技术，基本原理是利用一个随机引物(8～10个碱基)通过PCR反应非定点地扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA多态性研究[5]。

对任一特定引物而言，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。

与RFLP相比，RAPD技术简单，检测速度快，DNA用量少，实验设备简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构，合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，而且不需要同位素，安全性好。

当然，RAPD技术受许多因素影响，实验的稳定性和重复性差[6]，首先是显性遗传，不能识别杂合子位点，这使得遗传分析相对复杂[7]，在基因定位、作连锁遗传图时，会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性下降;其次，RAPD对反应条件相当敏感，包括模板浓度、Mg2+浓度，所以实验的重复性差[8]。

1.3 AFLP标记技术扩增片段长度多态技术(AFLP)，又名限制片段选择扩增技术(Selective restriction fragment amplifi2cation ，SRFA)，于1993年由荷兰KEYGENE公司的Zabean和Vos等发明[9]，并已申请专利。

AFLP是近年来迅速发展起来的一种分子标记技术，它将基因组DNA用成对的限制性内切酶双酶切后产生的片段用接头(与酶切位点互补)连接起来，并通过5′端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA片段，从而形成指纹图谱的分子标记技术。

AFLP指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传。

它兼具RAPD与RFLP的优点，有较高的稳定性，用少量的选择性引物能在较短时间内检测到大量位点，并且每对引物所检测到的多个位点都或多或少地随机分布在多条染色体上，各染色体上AFLP标记的数目与染色体长度呈正相关(r =0.501)，而一对引物获得的标记涉及的染色体数与标记数呈正相关(r =0.826)。

因此，通过少量效率高的引物组合，可获得覆盖整个基因组的AFLP标记[10]。

目前，AFLP作为一种高效的指纹技术，已在遗传育种研究中发挥它的优势[11]。

不过也有研究认为，AFLP对基因组纯度和反应条件要求较高[12]，另外用于遗传作图时，少数的标记与图谱紧密度有出入。

此外，在RAPD和RFLP技术基础上建立了SCAR(Sequence characterizedamplified regio ，序列特异性扩增区域)、CA(Cleaved ampli2fied polymorphic sequence ，酶切扩增多态序列)和DAF(DNA amplified fingerprints ，DNA扩增指纹)等标记技术[13]。

这些技术的出现，进一步丰富、完善了第1代分子标记技术，增加了人们对DNA多态性的研究手段。

2．第二代分子标记2.1 R标记技术在真核生物基因组中存在许多非编码的重复序列，如重复单位长度在15～65个核苷酸的小卫星DNA(Minisatellite DNA)，重复单位长度在2～6个核苷酸的微卫星DNA(Microsatellite DNA)。

小卫星和微卫星DNA分布于整个基因组的不同位点。

由于重复单位的大小和序列不同以及拷贝数不同，从而构成丰富的长度多态性。

Moore等于1991年结合PCR技术创立了R(Simple sequence repeat，简单重复序列)标记技术。

R也称微卫星DNA，是一类由几个(多为1～5个)碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列，其中最常见的是双核苷酸重复，即(CA)n和(TG)n ，每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10～60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。

不同遗传材料重复次数不同，导致了R 长度的高度变异性，这一变异性正是R标记产生的基础。

R标记的基本原理是根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段。

由于核心序列重复数目不同，因而扩增出不同长度的PCR产物，这是检测DNA多态性的一种有效方法。

微卫星序列在群体中通常具有很高的多态性，而且一般为共显性，因此是一类很好的分子标记。

2.2 IR 标记技术IR即内部简单重复序列，是一种新兴的分子标记技术。

1994年Zietkiewicz等对R技术进行了发展，建立了加锚微卫星寡核苷(Anchored-microsatell ite-oligonucleotides)技术[14]。

他们用加锚定的微卫星寡核苷酸作引物，即在R的5′端或3′端加上2～4个随机选择的核苷酸，这可引起特定位点退火，从而导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。

这类标记又被称为IR(Inter simple sequence repeat)、AR(Ancho red simple sequence repeats)[15]或AMP PC R[16]。

在所用的两翼引物中，可以一个是AR引物，另一个是随机引物。

如果一个是5′端加锚的AR引物，另一个是随机引物，则被称为RAMP技术[17]。

3.第三代分子标记3.1 标记技术单核苷酸多态性(Single nucleotidepolymorphism，)被称为第3代DNA分子标记，是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异，这种差异包括单个碱基的缺失或插入[18]，更常见的是单个核苷酸的替换，且常发生在嘌呤碱基(A与G)和嘧啶碱基(C与T)之间。

标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异，被认为是应用前景最好的遗传标记。

目前，已有2000多个标记定位于人类染色体上，在拟南芥上也已发展出236个标记。

在这些标记中大约有30%包含限制性位点的多态性。

检测的最佳方法是DNA芯片技术，最新报道的微芯片电泳(Microchip electrophoresis)，可以高速度地检测临床样品的，它比毛细管电泳和板电泳的速度可分别提高10 和50倍[19]。

与第1代的RFLP及第2代的R标记的不同有2个方面:其一，不再以DNA片段的长度变化作为检测手段，而直接以序列变异作为标记;其二，标记分析完全摒弃了经典的凝胶电泳，代之以最新的DNA芯片技术。

3.2 EST标记技术表达序列标签(Expreed sequence Tag ，EST)是美国国立卫生研(National Ititutes of Health ，NIH)的生物学家Venter于1991年提出的[20]。

随着人类基因组计划的开展，EST技术首先被广泛应用于寻找人类新基因，绘制人类基因组图谱，识别基因组序列编码区等研究领域，之后又被广泛应用于植物基因组研究[21]。

EST是指在来源于不同组织的cDNA文库中随机挑选克隆、测序，得到部分cDNA序列，一个EST对应于某一种mRNA的cDNA克隆的一段序列，长度一般为150～500，只含有基因编码区域。

EST可代表生物体某种组织某一时间的一个表达基因，所以被称之为“表达序列标鉴”;而EST的数目则显示出其代表的基因表达的拷贝数，一个基因的表达次数越多，其相应的cDNA克隆越多，所以通过对cDNA克隆的测序分析可以了解基因的表达丰度[22]。

目前构建cDNA文库一般都使用试剂盒，方法成熟，而且飞速发展的DNA测序技术，也使得进一步降低大规模DNA序列测定成本成为可能[23]。

4．几种新型分子标记4.1 RGAs标记(Resistance Gene Analogs，抗病基因类似物)RGAs是用基于抗病基因保守序列设计的引物扩增基因组得到的抗病基因类似序列的新型的分子标记。

尽管基因间整个序列的同源性不足于用RFL P 杂交检测，但抗病基因中存在的这些保守区域为在其它植物中进行PCR 扩增和分离RGAs 提供了机会[24]。

4.2 RMAPD 标记(random microsatellite amp lify polymorp hic DNA ，随机微卫星扩增多态)利用RAPD引物和微卫星上游或下游引物结合，对基因组DNA 进行扩增，探索更有效的揭示所有微卫星及其他DNA遗传多态性的方法，以期获得研究DNA多态性的新的分子标记方法。

因该方法同时利用随机引物和微卫星引物进行扩增，暂时定名为随机微卫星扩增多态DN A[25]。