SRAP和ISSR分子标记研究进展
ISSR、RAPD和SRAP分子标记技术在姬松茸菌株鉴定上的应用比较
Ｒ Ｄ、４条 ＩＳ ＡＰ Ｓ Ｒ和 ２对 Ｓ ＡＰ引 物 适 合 姬 松 茸 菌 株 鉴 定 分 析 ，３种 标 记 方 法 均 将 １ Ｒ ６个 菌 株 分 为 ３大 类 群 ，
Ａ Ｏ ｌ １ Ａ Ｏ ３ １类 ，Ａ００ Ｏ ｌ＋ 和 Ｏ１ 为 ０ ９单 独 为 １ ，其 余 菌 株 为 １ 。３种 分 子 标 记 法 对 姬 松 茸 菌 株 鉴别 的结 果 存 类 类
Ａｂ ｔ ａ ｔ ｉ ｔ ｅ ｉｆｒ ｎ ｔ ａｎ ｆ Ａｇ ｒ ｃ ｓ ｂａ ｅ ｕ ｉ ｒ ｎ ｌ ｚ ｄ ｕ ｉ ｇ Ｉ Ｓ ｓｒ ｃ ：Ｓ ｘ ｅ ｎ ｄｆｅ ｅ ｔ ｓ ｒ ｉ ｓ ｏ ａ ｉ ｕ ｌ ｚ ｉ Ｍ ｒｌ ｗｅ ｅ ａ ａｙ ｅ ｓｎ Ｓ Ｒ， ＲＡＰ ａ ｄ Ｓ ｌ Ｄ ｎ ＲＡＰ ＰＣＲ ． ａ ｌ ｉａ ｉｎ ｕ ｉ ｇ ８ ＲＡＰ ｐ ｉ ｒ ．４ Ｉ Ｓ ｒ ｒ ｎ ＲＡＰ ｐ ｉ ｒ ｐ ｉｓ ｓ ｐ ｒ ｔ ｄ ｔ ｅ ｓ ｒ ｉ ｓ ｉ ｔ ｈ ｅ ｍｐ ｉ ｃ ｔ ｓｎ ｆ ｏ Ｄ ｒｍｅ ｓ Ｓ Ｒ ｐ ｉ ｍｅ ｓ ａ ｄ ２ Ｓ ｒ ｍｅ ａ ｒ ｅ ａ ａ ｅ ｈ ｔａ ｎ ｎ ｏ ｔ ｒ ｅ ｇ ｏ ｐ ． Ｏｎ ｆｔ ｅ ｃ ｎ ｉｔ ｄ ｏ ０ ＋ １ ａ ｄ Ａ０ １ ，ａ ｏ ｈ ｒ Ａ０ ０ ｒｕ ｓ ｅ ｏ ｈ ｍ ｏ ｓｓ ｅ ｆＡ０ １ １ ｎ ０ ３ ｎ ｔ ｅ ０ ９，ａ ｄ ｔ ｅ ｔ ｉｄ ｇ ｏ ｐ ｔ ｅ ｒ ｍａｎ ｅ ｓ Ｔｈ ｎ ｈ ｈｒ ｒ ｕ ｈ ｅ ｉｄ ｒ． ｅ
在 着 一 定 差 别 。Ｓ Ｐ反 应 的遗 传 信 息 较 丰 富 ，比 ＩＳ ＲＡ Ｓ Ｒ、ＲＡ Ｄ 检 测 到 更 大 的遗 传 差 异 ；ＲＡ Ｄ 引 物 扩 增 到 的 Ｐ Ｐ 多态性条带数较多 。
分子标记SRAP实验报告
分子标记SRAP实验报告1. 引言分子标记是现代生物技术研究中的关键方法之一。
它可以通过扩增特定的DNA 序列，从而在种群遗传学、进化生物学、基因定位等方面提供有力的支持。
SRAP （Sequence Related Amplified Polymorphism）是一种新颖的分子标记技术，通过对相邻序列的扩增产物进行光谱分析，实现对DNA的多态性研究。
本实验旨在探究SRAP技术的可行性和应用价值。
2. 材料与方法2.1 实验材料- 植物样本：从绿色植物中收集新鲜叶片样本，保持样本的完整性和活性。
- 试剂：Tris-HCl缓冲液、EDTA、SDS、DTT、RNA酶A、异丙醇、等温酶I、DNA聚合酶、dNTP作为PCR反应的试剂。
- 仪器设备：离心机、PCR仪、凝胶电泳装置。
2.2 实验步骤1. DNA提取：将植物样本加入到400 μl Tris-HCl缓冲液中，加入100 μl 2% CTAB和10 μl 20 mg/ml RNA酶A，反复翻转均匀混合。
在65C水浴中孵育35分钟，加入1 ml 等温酶I和20 μl 10% SDS，并在37C水浴中孵育30分钟。
加入50 μl DTT，轻轻倒放翻转均匀后，在65C水浴中孵育30分钟。
加入500 μl 24:1等温酶I: P/C（φ=1）混合液，轻轻倒置混合。
沉淀离心，上清液移至新离心管，并加入等体积的异丙醇，轻轻翻转混合。
2. PCR扩增：将DNA样品加入PCR反应管中，配制成PCR反应液。
设置合适的PCR反应条件，进行PCR扩增。
3. 凝胶电泳：制备1%琼脂糖凝胶，并将PCR产物和DNA分子量标记物一同加入凝胶槽中。
进行电泳，观察扩增片段的大小和形态。
4. 光谱分析：将电泳结果照相，并进行光谱分析。
记录每个扩增片段的出现频率和多态性信息。
3. 结果与讨论通过以上步骤，我们成功获取了植物样本的DNA，并进行了SRAP-PCR扩增。
在凝胶电泳结果中，观察到了多个扩增片段，且大小和形态各异。
利用ISSR及SRAP分子标记研究菜用大黄与药用大黄的亲缘关系
利用ISSR及SRAP分子标记研究菜用大黄与药用大黄的亲缘关系菜用大黄(Rheum rhaponticum L.)属于多年生草本植物,其叶柄粗壮多汁,富含纤维素A、维生素C、钙、磷以及琥珀酸等营养物质,是理想的保健蔬菜,在欧洲、北美和大洋洲地区大面积用于商业栽培。
十七世纪,中国药用大黄被引进至欧洲后经过长期的自然进化演变为菜用大黄,然而关于菜用大黄与药用大黄亲缘关系未见报道。
本研究对22份大黄品种(6份菜用大黄和16份药用大黄)进行了种子形态学观测和ISSR及SRAP分子标记分析。
通过菜用大黄ISSR-PCR反应体系的优化及验证、ISSR及SRAP标记引物的筛选、亲缘关系分析等研究,对菜用大黄和药用大黄的亲缘关系进行了研究,并初步揭示菜用大黄的起源,为课题组今后的育种工作提供重要的理论依据。
主要研究结果如下:(1)建立了菜用大黄ISSR-PCR最佳反应体系。
即10×PCR Buffer2.5μL,模板DNA125ng,Mg2+2.5mmol/L,dNTPs 0.35mmol/L,引物0.5μmol/L,Taq DNA聚合酶0.04U/μL,反应体系的总体积为25μL。
(2)通过对22个大黄品种的种子长度、宽度、翅宽和千粒重四个形态指标进行测量,利用SAS v9.2软件进行聚类分析。
结果显示当最大距离为3.5时,可以将22份材料划分为4类,其中RT品种的种子在四个指标上明显与其他品种存在较大的差异。
(3)利用菜用大黄品种R34和药用大黄品种SC分别对100条ISSR引物和182对SRAP引物组合进行筛选,共获得多态性好,谱带清晰,结果重复性高的ISSR引物13条、SRAP引物组合32对。
ISSR-PCR扩增共获得74个等位基因位点,其中59个是多态性位点;SRAP-PCR扩增共计获得227个条带,其中206条具有多态性。
结果表明这两种分子标记均能提供丰富的遗传信息,均可用于大黄遗传多样性分析。
伊丽莎白安格斯三角梅转录组的SSR、SNP和InDel特征分析
伊丽莎白安格斯三角梅转录组的SSR、SNP 和InDel特征分析作者：孙利娜林茂黄旭光陈尔杨舒婷王华新龚建英来源：《南方农业学报》2024年第03期摘要：【目的】基于轉录组测序数据分析伊丽莎白安格斯三角梅SSR、SNP和InDel位点特征，为开发三角梅分子标记、选育无刺或少刺品种、品种鉴定及亲缘关系分析提供理论依据。
【方法】以伊丽莎白安格斯三角梅3个时期的枝刺和茎段为材料，对其进行转录组测序，采用Trinity对获得的高质量测序数据进行序列组装，利用MISA和GATK3对 SSR、SNP 和InDel进行特征分析。
【结果】18个样本转录组测序平均获得45905982 bp Raw data，质控过滤后获得 45640193 bp Clean data，拼接后获得312812条转录本和144512条Unigenes，有54516个SSR位点分布于40820条Unige- nes上，发生频率为28.25%，平均分布距离为2.67 kb，包含1个以上SSR位点的Unigenes 10269条，占Unigenes总数的 4.25%。
在重复基元类型中，单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复数量占优势，其中单核苷酸重复数量最多（39904 个，占比73.20%），其次为二核苷酸重复（8169个，占比14.98%）和三核苷酸重复（5899个，占比10.82%），五核苷酸重复最少（31个，占比0.06%）。
单核苷酸～六核苷酸重复类型共检测到98种重复基元，出现频率为0.01%～25.71%，其中出现频率最高的基元为A/T （37151个），占SSR位点总数的68.15%。
SSR各类型重复基元的重复次数集中在5～23次， SSR序列的长度10～60 bp，平均长度为20.38 bp。
共检测到231248个SNP位点和99580个InDel位点，其中SNP位点平均分布距离为1.59 kb，InDel位点平均分布距离为0.68 kb，且均以含1个位点的Unigenes数量最多，Unigenes数量随 SNP和InDel位点数量的增加而逐渐减少。
ISSR和SRAP标记技术在葫芦科植物种质资源研究中的应用
一
１ ３一
Ｊ ＯＵ Ｒ Ｌ ＯＦ ＣＨ ＮＡ ＡＮＧＪＡＮ Ｖ Ｉ Ｇ ＥＧＥ ＡＢ Ｅ Ｔ Ｌ Ｓ
Ｄ Ｉ ０３ ６ ／ｉ ｎ１０ — ５ ７２ １ ． ． ３ Ｏ ： ．８ ５ｊｓ ．０ １ ３ ４ ．０ ２０ ０ １ ．ｓ ２０
ＩＳ Ｓ Ｒ和 Ｓ Ａ 标记技术在葫芦科植物 ＲＰ 种质资源研究中的应用
出 １ ８条 带 纹 ， 中多 态 性 带 １４条 ． 态 比率 为 ８ 其 ３ 多 ７ ％。康 建坂 等嗍 用 ＩＳ １ 运 Ｓ Ｒ分 子标 记对 ４ ８个 苦 瓜
好 、 态性 高 、 多 无需 知 道 Ｓ Ｒ靶 标 序列 信息 、 复性 Ｓ 重
好 、 操作 、 捷方 便 、 易 快 成本 低等 诸 多优 点 。不 足之 处 在 于不 同引物 及不 同材料 间 Ｐ Ｒ扩 增 反 应最 佳 Ｃ
记方 法 。 １１ ＩＳ ． Ｓ Ｒ分 子标记
ｐｉ ｈｓ ｍ）都 是基 于 Ｐ Ｒ标记 系统 的一 种新 型 的显性 Ｃ
基 金项 目 ： 州 省教 育厅 自然 科 学研 究 项 目（０ ７ ８ ） 贵 ２００２ ，
国家 自然 科 学基金 项 目（９ ７ ９ ３ ３ ７ ００ ） 蹇 黎 （９ ８ ）女 ， 教授 ， 士 ， 究方 向 为 生物 化 学 与 １７ 一 ， 副 博 研
样 品 的遗 传 多样 性 进 行研 究 ，４个 ＩＳ 引物 共 扩 １ ＳＲ 增 出 １ １条 带 纹 ， 中多 态性 谱 带 为 ｌ ３条 ， 态 ８ 其 １ 多
性 比率 为 ６ ．２ ０３ ％。张 爱萍 等［ 用 Ｓ Ａ ９ １ 采 Ｒ Ｐ技 术对 西
条 件可 能 不尽 相 同 ，很 难 区分 显性 纯杂 合 基 因型 。
分子生态学课程论文：分子标记在食用菌研究中的应用
分子标记在食用菌研究中的应用摘要：分子标记技术的应用日趋广泛, 在食用菌研究中具有重要的利用价值。
本文对DNA 分子标记RAPD、SRAP、ISSR、SCAR等方法的原理、特点和其在食用菌遗传多样性鉴定方面的研究进展进行了重点阐述。
关键词：RAPD、SRAP、ISSR、SCAR、食用菌分子标记的概念有广义和狭义之分。
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。
狭义的分子标记仅仅是指DNA标记，是能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段，是DNA水平遗传多态性的直接反映，一般所称的分子标记即被界定在此范围之内[1]。
与遗传标记的其他三种类型——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA 分子标记具有其独特的优越性，它是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传变异的直接的反映，并不受生物生长发育环境和基因表达与否的影响。
大多数分子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组DNA变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；遗传稳定，对生物体的影响表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简便。
这些特性为生物标记的广泛应用性奠定了基础[2-3]。
随着分子生物学的发展，DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。
而DNA分子标记技术在食用菌研究中，主要应用于遗传育种、菌种的分类与鉴定、物种亲缘关系的鉴别、遗传多样性分析、基因定位和克隆等研究中。
本文综述了几种DNA分子标记的原理、特点及其在食用菌研究中的应用。
1 随机扩增多态DNA（RAPD）RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，即随机扩增多态DNA）是1990 年由Willams[4]和Welsh[5]两个研究小组几乎同时建立和发展的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子遗传标记技术。
无患子种质资源多样性与亲缘关系的ISSR和SRAP分析
简单 重 复 序 列 区间 （ ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ — ｓ ｉ ｍｐ ｌ ｅ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ｒ ｅ ｐ ｅ ａ ｔ ，Ｉ Ｓ Ｓ Ｒ） 是 １ ９ ９ ４年 由 Ｚ ｉ ｅ ｔ ｋ ｅ ｉ ｗ ｉ ｔ ｃ ｚ 创 建 的一 种
皂树 ，为无 患子 科无 患子 属落 叶乔 木树 种 ，广泛 分 布 我 国东部 、南 部至 西南 各省 区 ， 日本 、朝 鲜 、越 南 、老 挝 、柬埔 寨 、缅甸 、泰 国 、马来 西 亚 、尼 泊
果 皮 含 有 四环 三 萜 类 大 戟 烷 型 （ Ｔ ｉ ｒ ｕ ｃ ａ ｌ ｌ ａ ｎ ｅ ｔ ｙ ｐ ｅ ） 和达玛 烷 型 （ Ｄ ａ ｍｍ ａ ｒ ａ ｎ ｅ ｔ ｙ ｐ ｅ ） 等 多 种 皂 苷 ， 可作 为天 然活性 物 质用 于洗 涤和 洗发 香波 及各 种洁 肤护 肤化妆 品 中 ，具 有 抗 皮 真 菌和念 珠 菌等 抗 菌 、 止痒 、治 疗脚 癣 和 轮 癣 等 功 效 ，是 当 前 日用 化 工业 中非 常 引人关 注 的绿 色洗涤 生 物化工 原 料 ，市 场前 景广 阔 。 目前 ，人 工 种植 的无 患子 大多 使用 天 然种 源 的实生 苗 ，良种 选 育 尚处于 起步 阶段 。辜 夕 蓉 对来 自于 四川 和 云南 ５个 地方 的无 患子 种源 的
南 、四川 等 地 的 １ ６份 无 患 子 材 料 ，通 过 探讨 不 同
产地 无 患子 种源 间 的遗传 差异 和亲 缘关 系 ，旨在 为 科 学实 现远 缘杂 交或 远亲 杂交 提供 理论 依据 。
１ 材料 与 方 法
１ ． １ 供 试 材 料
源 ，为 无患 子 的栽后 产量 和 品质打 下基 础 。邵 文豪 等 卜 通过 对不 同产 地无 患子 果皮 皂 苷含 量 的测 定 分 析和 收集 无患 子 自然分 布 区 内不 同种源 、家 系种
SRAP 分子标记及其应用
SRAP分子标记及其应用张安世,邢智峰,刘永英,张为民(焦作师范高等专科学校生物系,河南焦作454001)摘要相关序列多态性(SRAP)是近年来发展起来的一种新型分子标记系统,具有简便、稳定、中等产率、高共显性、易于测序等优点。
它利用独特的引物设计对O RF s进行扩增,正、反引物分别与外显子和内含子(或启动子)区域配对,因不同物种、不同个体的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性。
SRA P-P CR扩增程序采用复性变温法,前5个循环复性温度为35℃,后35个循环为50℃。
目前SRA P已在植物图谱构建、遗传多样性评价、基因定位和比较基因组学等方面成功应用。
关键词SRA P;分子标记;O R F s;P CR中图分类号Q75文献标识码 A 文章编号0517-6611(2007)09-02562-021974年G rod z ik er创立了RF LP技术,B o ts te in等[1]首先利用此项技术于1980年构建了人类遗传连锁图谱,从此开创了分子标记技术的新纪元。
目前,已经建立的DN A分子标记技术有十多种,常用的有限制性片断长度多态性(R FL P)、随机扩增多态性(RA PD)、内部简单重复序列(IS SR)、扩增片断长度多态性(AF LP)、微卫星DN A又称简单重复序列(S SR)、简单序列长度多态性(S S LP)、酶切扩增多态性序列(CA P S)、单核苷酸多态性(SN P)、相关序列扩增多态性(S RA P)等,它们已在动、植物和微生物等学科中得到了广泛的应用,并取得了令人瞩目的进展。
其中SRA P是一种基于PCR的新型标记,由美国加州大学作物系L i等[2]于2001年在研究芸薹作物时开发出来的。
它独特的引物设计使其可检测基因的可阅读框(OR F)区域,是一种无需任何序列信息即可直接PCR 扩增的新型分子标记技术,它既克服了RA PD重复性差的缺点,又克服了A FL P技术复杂、成本昂贵的缺点,以其操作简便迅速、成本低、可靠性好、重复性高、易于测序等特点迅速被各国分子生物学家所接受。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
SRAP与ISSR分子标记的研究进展摘要：SRAP与ISSR等分子标记技术已广泛应用到科研工作中。
本文简单的介绍SRAP与ISSR的原理、功能、应用以及对使用分子标记技术揭示生物菌的作用机理进行了展望。
DNA分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它能直接反映基因组DNA间的差异，是继形态学标记、细胞学标记及生化标记之后，近年来广泛应用的一种新的遗传标记。
近年来,随着DNA 标记技术的研究日渐成熟,其应用也日益广泛。
目前,各种分子遗传标记技术在科研中的应用已深入开展，为种质资源的鉴定、基因的定位与克隆、数量性状位点的遗传分析、遗传多样性评估、物种起源和分子标记辅助育种等遗传研究提供了有价值的工具。
目前常用的分子标记有RFLP、AFLP、RAPD、SSR、ISSR 、SRAP等。
1 SRAP分子标记的发展与应用1.1 SRAP分子标记的发展SRAP(Sequence-Related Amplified Polymorphism)即相关序列扩增多态性是一种基于PCR 的新型标记，由美国加州大学作物系Li和Quiros博士提出的序列相关扩增多态性(sequence-related amplifiedpolymorphism, SRAP)。
SRAP 技术是与RAPD 技术相似的一种标记技术，即SRAP 可用一对引物，但所用的引物是在SSR 的基础上设计的。
SRAP 标记原理是利用基因外显子里G、C 含量丰富，而启动子和内含子里A、T含量丰富的特点设计两套引物，对开放阅读框架进行扩增。
SRAP 技术是一种无需任何序列信息即可直接PCR 扩增的新型分子标记技术。
SRAP分子标记技术具有重复性强、简便、易于分离条带和测序、中等产量高、高共显性、便于克隆测序目标片段等特点,目前SRAP 标记已在植物遗传多样性检测、遗传图谱构建、重要基因定位、品种鉴定和种子纯度检测上得到了广泛应用，而在真菌界的应用相对较少。
2.2 SRAP 分子标记的应用国内学者利用该技术对疫霉菌Phytophthora infestans、炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、锈菌Puccinia striiformis、紫杉内生真菌等进行了遗传多样性分析，获得了理想的结果。
Sun 等和Fernando 等认为SRAP标记比RAPD标记稳定，且其多态性可与AFLP 标记相媲美。
Fu 等认为在研究香菇多样性时SRAP 比ISSR 获得的信息更全面。
郭大龙、冯志红等[1]分别建立和优化了部分柿属植物与西葫芦SRAP-PCR反应体系。
刘丽娟将该技术应用于黄瓜、甘蓝、辣椒等蔬菜作物的遗传多样性分析；张俊伟、张宇、周春娥、李江华等分别对梅、苜宿、糯玉米、大豆、野生狗牙根等进行了SRAP的遗传多样性分析,结果表明,该技术适合于植物的遗传分化研究,聚类结果几乎与传统分类结果一致。
目前该技术在真菌中的研究还主要集中于食用菌,有关植物病原菌，生防菌的SRAP分析还非常有限,王守现、付立忠、张静、LIZHONGFU等[2]分别就鸡腿燕、香链、双孢磨燕与杏鲍燕的SRAP遗传多样性进行了分析研究,结果表明,SRAP分子标记技术多态性明显,能够客观反映出全部供试材料的遗传关系。
蒋冬花、陈碧云酵母菌与核盘菌进行了SRAP遗传多样性分析。
贾定洪(2011年)[3]利用SRAP分子标记对23个金针燕菌株进行分析,试验筛选出7对SRAP引物,经过聚类分析,遗传相似系数为0.143-1.000,遗传差异较大,与形态学的分类相符。
袁微微（2013年）利用SRAP分子标记对镰刀菌的遗传多样性进行分析，证明了镰刀菌种间分化明显,种内存在较高的同源性。
周永进、马鸿翔、余桂红等[13]利用SRAP分子标记技术对两种赤霉病菌Fusarium asiaticum 与Fusarium graminearum 特异性分子标记，从而快速准确的区分两种赤霉病菌。
羊杏平、刘广、侯喜林等[14]对35 份西瓜核心种质进行了抗枯萎病鉴定，再采用SRAP 分子标记技术对35 份核心种质进行多态性分析，检测到1 个与抗病性显著关联的SRAP位点，为西瓜抗病新品种选育和分子标记辅助育种奠定了分子基础。
赵艳琴、吴元华等建立了烟草靶斑病菌 SRAP-PCR 反应体系，并对引物进行了筛选，明确烟草靶斑病菌的遗传本质，为该病害的防治提供理论依据。
另外，SRAP 标记引物通用性强，不需要预知物种的序列信息就可应用。
但不同研究对象的SRAP 标记对引物具有选择性，如炭疽菌SRAP 筛选出的适宜引物不适用于水稻茄丝核菌的SRAP 标记。
刘立军、刘志恒等在试验中发现，优化SRAP 反应的退火温度是决定试验成败的关键因素之一。
降低SRAP 第1次退火温度，提高第2 次退火温度，有利于获得较好的SRAP 扩增效果。
由于真菌基因组比植物的小，扩增出来的条带相对少些，减少了统计工作量，并降低了SRAP 标记的统计难度。
因此，SRAP 分子标记技术在真菌的遗传研究中有着广阔的应用前景。
2 ISSR分子标记发展与应用2.1 ISSR分子标记的发展ISSR(inter-simple sequence repeat)即简单重复序列间区扩增,是一种建立在PCR反应基础上的DNA分子标记,属微卫星标记类。
它由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等于1994 年在SSR(简单重复序列标记技术)基础上提出，用锚定的微卫星DNA为引物,即在SSR序列的3'端或5'端加上2~4个随机核苷酸,在PCR反应中,锚定引物可以引起特定位点退火,导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增,然后通过电泳技术分析其多样性结果。
由于SSR一般是以短的(1~6bp)基元组成的较低程度的串联重复,在基因组的许多位点都有分布,占据基因组的绝大部分,并且进化变异速度快, 因而ISSR可检测到基因组中许多位点的变异，较其它标记方法多态性更好。
ISSR 分子标记具有 PCR产物可提供比 RAPD、SSR 和 RFLP 更为丰富的多态性，试验重复性好等优点。
因此以成功应用于动植物、微生物的遗传多样性分析、亲缘关系研究、品种和种质资源的快速鉴、遗传图谱的构、基因定位和辅助选择育种。
2 2.2 ISSR 技术的应用近年来ISSR 开始应用于植物遗传分析的各个方面, 如品种定、遗传关系及遗传多样性、基因标签、植物基因作图、指纹图谱的建立等方面的研究。
2.2.1 品种鉴定及分类作物的性状大多属数量性状, 由多基因控制, 易受环境条件影响。
利用传统形态学鉴定方法区分品种时间长, 费用高, 难度较大。
现有的鉴定方法中, 同工酶和蛋白质电泳可检测的位点少, 蛋白质类型不多, 多态性水平低, 对同一作物不同品种不能进行有效的区分。
RFLP 技术繁琐, 对操作人员、设备要求高; RAPD 可靠性较差, 难以在品种鉴定中广泛应用。
ISSR 多态性水平高, 易于分析, 不受环境影响, 在品种鉴定中显示出巨大的应用潜力。
ISSR 引物为重复序列,由于重复序列在基因组中是变异最快的成分, 不受或很少受到自然选择的影响, 故其变异保留下来, 所以重复序列区域的多态性远高于基因区域的多态性, 这是ISSR 标记多态性较高的原因所在。
利用ISSR 绘制品种(系)的指纹图谱, 作为品种(系)的特征性状建立种质资源档案库, 可用于鉴别品种(系)。
由于ISSR 容易检测出DNA 多态性, 所以ISSR 分析已广泛应用于各类作物的品种(系)间的鉴别和分类。
余爱丽等(2002)利用ISSR 标记技术对甘蔗及其近缘属进行了分类。
Potter 等仅用1 个ISSR 引物即可区分15 个核桃品种。
用2 个ISSR 引物组合可鉴定31 个品种, 只有2 个品种需要3 个引物才能区分。
Arnau 等用1 个ISSR 引物即可区分30 个草莓变异植株。
Luisa 使用的ISSR 引物的任何1 个均可区分24 个梨品种。
因此, ISSR 技术是一种可靠、快捷的分子标记技术, 可用于大规模DNA 指纹分析。
Fang 等用ISSR 标记区分亲缘关系很近的柑橘品种。
Prevost 等仅用了4 个ISSR 引物就将30 多个马铃薯品种区分开来。
2.2.2 亲缘关系ISSR 技术也可用于种群内、种群间和物种间的研究。
邱英雄等[6]利用ISSR- PCR 方法对杨梅的7 个品种和2 个无性系后代进行了基因组多态性分析, 选用11 个引物扩增出116 个DNA 片段, 其中48个片段呈现多态性, 占总扩增片段的41.4%, 并通过聚类分析将杨梅7 个品种和2 个无性系后代分为3 类, 引物ISSR16 和ISSR20 相结合能够区分杨梅的全部品种和无性系后代, 依据扩增结果进行遗传距离分析, 构建了分子树状图。
Gulsen 等[8]的研究表明, 枸橼对于柠檬基因组形成有相当大的贡献。
Fang等[9]用10 个ISSR 引物分析了柑橘35 个种之间的亲缘关系, 将这35 个种分为5 个类群, 由ISSR 标记所得到的分类结果和前人研究结果一致。
何予卿等[10](2000)利用ISSR 分子标记对37 份栽培稻和野生稻的亲缘关系进行了分析, 结果栽培稻与野生稻的亲缘关系体现出栽培稻是由普通野生稻分化而来, 而普通野生稻是从南向北逐渐分化的。
Luis 等通过对28 个李品种的AFLP 和ISSR 分析表明, 这两种标记所得到的李品种亲缘关系的聚类图很相似。
Huang 等用ISSR 和4 个叶绿体DNA 非编码区的性位点变异来研究40 个甘薯属样品的遗传多样性和种内关系, 测试的15 个ISSR 引物在所有的样品中共产生了2 071 个片段, 平均每个样品扩增出了52 条带。
这些ISSR 扩增片段在所研究的40 个样品中具有较高的多态性(62.2%)。
ISSR 技术可检测到甘薯属样本中较多的遗传变异, 同时对比ISSR 技术与核基因DNA 限制性分析对甘薯属样品的检测结果表明, ISSR 技术分析种间和种内的遗传关系。
2.2.3 遗传多样性分析Terzopoulos P J 等从 11 条 ISSR 引物中筛选出 4 条引物对20 个地中海型蚕豆品种进行 ISSR 分析，扩增出的 192 条谱带中 190 条为多态性条带，表明其有高水平的遗传变异，且建议将地中海型蚕豆分为至少 2 个不同类型的种质资源库。
Behera T K 等利用 15 个 ISSR 标记和 29 个 RAPD 标记对 38 个印度苦瓜品种进行遗传多样性分析，结果表明 ISSR 引物扩增的条带多态性（74.7%）多于 RAPD（36.5%），但对种质的多样性评估基本一致。