SSR分子标记的开发技术研究进展
基于SSR分子标记技术的长豇豆种子纯度快速鉴定技术
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SSR分子标记鉴定两系杂交水稻“荃两优2118”的种子纯度
SSR分子标记鉴定两系杂交水稻“荃两优2118”的种子纯度水稻是我国主要的粮食作物之一，具有重要的经济和社会意义。
两系杂交水稻因其优势逐渐受到人们的关注和重视。
而种子的纯度是影响水稻产量和品质的重要因素之一。
本次研究利用SSR分子标记技术来鉴定两系杂交水稻“荃两优2118”的种子纯度，为提高水稻产量和优质水稻的培育提供技术支持。
一、研究背景种子纯度是影响农作物产量和质量的重要因素之一。
在水稻生产中，种子纯度的高低直接影响着水稻的产量和品质。
传统的种子纯度检测方法主要依赖于对种子形态特征的观察和人工筛选，存在识别精度不高、工作效率低等问题。
而SSR分子标记技术则能够通过对种子的DNA特征进行分析鉴定，具有鉴定精度高、快速、准确等优点，因此被广泛应用于作物品种鉴定和种子纯度检测等方面。
二、材料与方法本次研究选取了两系杂交水稻“荃两优2118”的种子作为研究材料，利用SSR分子标记技术对其进行种子纯度检测。
具体的研究方法包括：1. 提取种子DNA：利用CTAB法从“荃两优2118”水稻种子中提取DNA；2. SSR引物筛选：选取具有多态性的SSR引物用于种子纯度检测；3. PCR扩增：通过PCR技术扩增出SSR位点上的DNA片段；4. 电泳分析：对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析SSR位点上的DNA片段。
三、结果与分析经过SSR分子标记技术鉴定，“荃两优2118”的种子纯度达到了90%以上。
具体结果如下：通过SSR引物筛选，共筛选出10对具有多态性的SSR引物。
然后，利用这10对引物对“荃两优2118”的种子进行PCR扩增，得到了多个SSR位点上的DNA片段。
通过电泳分析发现，“荃两优2118”的种子中SSR位点上的DNA片段均呈现出良好的多态性和清晰的条带，证明了种子的纯度较高。
四、结论与展望通过本次研究，利用SSR分子标记技术成功鉴定了两系杂交水稻“荃两优2118”的种子纯度，为水稻种子的纯度检测提供了一种快速、准确的方法。
辣椒EST-SSR标记的开发与应用的开题报告
辣椒EST-SSR标记的开发与应用的开题报告一、研究背景随着生态环境的恶化和气候变化的加剧，粮食生产的保障已成为世界各国面临的主要问题之一。
作为全球最大的农业生产国之一，中国在农业科技领域的研究一直处于全球领先水平。
然而，中国的农业生产中也存在一些问题，如农作物病虫害的防治难度加大、民间品种资源损失严重等。
而众所周知的是，中国的辣椒产业领先于全球，而辣椒病虫害也是该行业经常面临的挑战，因此，如何提高辣椒的耐病性、抗虫性、抗旱性等方面的农艺性状，成为提高辣椒品质、产量和农业可持续发展的重要途径。
基因编辑技术由于其可针对性强、效率高等优点，成为植物品种改良的研究热点之一。
带有正负选择标记的基因编辑技术可以直接实现目标基因的精确编辑，但同时还需设计适当的筛选方法来选择目标编辑体细胞中的突变基因。
基因标记技术可以通过标记特定的基因位点，从而实现对基因编辑体细胞的选育，提高编辑概率和筛选效率。
目前已有许多植物中的EST-SSR标记被开发出来，并应用于育种、基因图谱构建等方面。
因此，本研究拟对辣椒品种进行EST-SSR标记的开发，以实现辣椒优良品种的精确选育和育种技术的提高。
二、研究目的和内容本研究旨在开发辣椒EST-SSR标记，并应用该标记于辣椒品种的育种工作中，以实现辣椒的高效精准选育。
具体研究内容包括：1、建立辣椒品种的EST数据库和SSR标记库。
2、筛选和确定基因编辑所需的EST-SSR标记。
3、利用EST-SSR标记对辣椒品种进行育种。
4、评估育种效果和提高育种策略。
三、研究方法和流程1、实验材料本研究选取常用的辣椒品种作为实验材料，同时，选取适合EST-SSR标记开发的干旱逆境条件作为筛选条件。
2、建立EST数据库和SSR标记库采用转录组测序技术，对辣椒花、果皮等组织进行转录组测序，获得以Illumina HiSeq 2000平台生成的EST序列数据，并利用BLAST （version 2.2）软件将获得的序列比对到公共数据库中，从而建立辣椒品种的EST数据库。
ssr分子标记技术存在问题
ssr分子标记技术存在问题SSR（Single-Strand Conformation Polymorphism Analysis）分子标记技术是一种常用的分子生物学工具，用于检测DNA或RNA的序列变异。
然而，虽然SSR分子标记技术在许多领域都有着广泛的应用，但它也存在一些问题需要解决。
本文将探讨SSR分子标记技术存在的问题，并提出一些解决方案。
第一部分：介绍SSR分子标记技术首先，让我们简单介绍一下SSR分子标记技术。
SSR是指简单重复序列（Simple Sequence Repeats），也被称为微卫星序列，它是DNA 或RNA分子中短序列的重复单元。
SSR分子标记技术可以通过PCR扩增和凝胶电泳等方法来分析样品中这些重复序列的长度变异，从而研究基因型和表型之间的关系。
第二部分：SSR分子标记技术存在的问题然而，尽管SSR分子标记技术在基因型鉴定、种群遗传结构分析和品种选育等方面表现出了良好的应用前景，但它也存在以下几个问题：1. 数据分析复杂：SSR分子标记技术获得的数据通常需要进行复杂的分析，包括基因频率、遗传多样性等统计学参数的计算。
这对于非专业人士来说可能是一个挑战。
2. 缺乏标准化操作流程：不同实验室或研究机构之间使用的SSR分子标记技术操作流程可能存在差异，导致结果的可比性不高。
3. 多态性程度低：由于SSR分子标记技术只能分析简单重复序列，因此它对于复杂基因组的分析有一定局限性。
在某些物种中，SSR位点的多态性程度较低，导致分辨率不高。
第三部分：解决方案尽管SSR分子标记技术存在问题，但我们可以通过以下途径来解决这些问题：1. 开发简化的数据分析工具：研究人员可以开发易于使用且功能强大的数据分析工具，以简化SSR分子标记技术数据的处理过程，并提供可视化和统计学参数计算等功能。
2. 建立标准化的操作流程：国际间的合作可以制定和推广SSR分子标记技术的标准化操作流程，确保不同实验室或研究机构之间获得的结果具有可比性。
SSR分子标记技术简述
SSR标记
SSR 标记是当今流行的分子标记技术之 一。尽管 SSR 分布于基 因组的不同位置，但其两端多是保守 的单拷贝序列，因此可以根 据两端的序列设计一对特异引 物，通过 PCR 技术将其扩增出来， 利用电泳分析技术获得长 度多态性， 即 SSR 标记。
SSR分子标记的优势
SSR在真核生物基因组中分布广
SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应 扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩 增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决 定基因型并计算等位基因频率。
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多态性丰富
其产物进行测序胶电泳分离时单碱基分辨率 高、遗传信息量大
SSR通常为显性标记，呈孟德尔式遗传
具有很好的稳定性和多态性 DNA用量少 技术要求低，成本低廉 PCR扩增的可重复性高
SSR标记的劣势
开发和合成新的SSR引物投入高、难度大 现有的SSR标记数量有限，不能标记所有的功 能基因 SSR多态性的检测和应用很大程度上依赖PCR 扩增的效果 SSR座位突变率高，对变异反应非常敏感等等
SSR标记的原理Байду номын сангаас
微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星 数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同， 因而造成多个位点的多态性。如果能够将这些变异揭示出来，就 能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性，基于这 一想法，人们发展起了SSR标记。
由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保 守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片 段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工 合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出 来。由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个 体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这 一多态性称为简单序列重复长度多态性(SSLP)，每一扩 增位点就代表了这一位点的一对等位基因。由于SSR重 复数目变化很大，所以SSR标记能揭示比RFLP高得多 的多态性，这就是SSR标记的原理
SSR分子标记
SSR座位突变率高，对变异反应非常敏感等等。
SSR分子标记的步骤
第一步：DNA 提取： 第二步：PCR :
PCR体系（15微升）：45纳克模板DNA 2.25微摩尔/升引物 11.5毫摩尔/升 氯化镁 各625微摩尔/升 4种dNTP 10X PCR缓冲液 1.5U Taq DNA 聚合酶 PCR反应程序 ： 变性94 摄氏度 3min 30次循环：94摄氏度 25s ，50-60摄氏度 25s ，72摄氏度 45s 最后72摄氏度延伸 10min
根据两端序列的保守性，设计引物；进行PCR， 电泳分离，染色显带以检测、分析微卫星序列多 态性；并确定基因排布序列及表型，最终达到成 功鉴定的目的。 简而言之，就是通过对样本DNA多态性的分析， 从而来得到样本DNA序列以及在遗传性状上的调 控和差异。
SSR标记原理示意图
SSR分子标记的优势
SSR标记
SSR标记是一种通过直接分析遗传物质的多态性来鉴别生物内 在的核苷酸排布及其外在状态表现规律的技术
SSR分子标记的分子学基础
微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰 富，而且常常是随机分布于核DNA中。在植 物中通过对拟南芥、玉米、水稻、小麦等的 研究表明微卫星在植物中也很丰富，均匀分 布于整个植物基因组中，但不同植物中微卫 星出现的频率变化是非常大的 常见的二核苷酸重复单位：（AC)n、 （GA)n、（AT)n 常见的三核苷酸重复单位： （AAG)n、 （AAT)n
SSR分子标记
Taq 酶
模板DNA 72 ℃ 模板DNA dNTP 引物 dNTP
引物
Buffer
Buffer
PCR反应体系
Primer1 Primer2 10×buffer DNTP Taq酶 DDH2O 模板DNA 0.15μl 0.15μl 1μl 0.8μl 0.15μl 5.75μl 2μl
实验仪器
微量移液器
八孔道取液器
离心机
PCR仪
1、DNA的提取（CATB法）
植株材料 裂解液 异丙醇沉淀
研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
2.PCR
2.1 SSR引物设计 根据CMD已公布的序列来设计相对SSR引 物。
2.2 PCR
TaqDNA聚合酶
Taq 酶 模板DNA 94oC 模板DNA dNTP 5min dNTP 引物 Buffer 引物 Buffer 循环30次
使用成本 耗费时间
2~30μg
高 慢
1~100ng
低 快
50-100ng ☆
低☆ 快☆
2~50ng
低 快
100ng
中 中等
可靠性
高
中等
高☆
高
高
三、原理与方法
根据两端序列的保守性，设计引物；进行PCR， 电泳分离，染色显带以检测、分析微卫星序列多 态性；并确定基因排布序列及表型，最终达到成 功鉴定的目的。 简而言之，就是通过对样本DNA多态性的分析， 从而来得到样本DNA序列以及在遗传性状上的调 控和差异。
中文名称 限制性片段长度多 态性 序列标签位点 随机扩增多态性 DNA 扩增片断长度多态 性 简单序列重复 单核苷酸多态性
SSR分子标记
细胞通讯和信息传导
杨一 细胞通讯是指在生物体内细胞与细胞之间的联络、 识别以及相互作用称细胞通讯。 信息 传递是指通过受体将外来信号刺激传至胞内， 产生一系列新的信息分子和有规律的生化级联 反应，最终对细胞和整个生物体的生理功能进行调控的过程，称为受体介导的信息传递。 1. 细胞复杂的信息传导在生物学中有重大的意义： ① 细胞间的信息传递性是维持机体正常机能的基本机制之一 细胞是生物体结构和功能单位， 是生命活动的基本单位， 生命活动绝大部分生化反应是 在胞内进行的。大约在 15 亿年以前，结构简单的原核细胞演化成结构复杂的真核细胞，以 多个真核细胞为基础构成了高等的、复杂的、多细胞的生物有机体。多细胞生物学特点是细 胞产生了特化，同时又能协作，使众多细胞联合成一个协调的整体。多细胞机体内细胞间的 信息传递是维持机体正常机能的基本生物学机制之一。高等生化清楚可辨的特化细胞 200 多种，这些特化细胞具有很多微细差异构成了不同的细胞系统，在所有系统中有 2 个系统： 免疫细胞系统和神经系统。 ② 特化了的细胞的协作和协调 1）免疫细胞系统具有化学识别能力，能够识别“异己” ，消灭其致病作用，当病毒 细胞侵入体内，辅佐细胞提呈 TDAg、TiAg 激活 TC 介导细胞免疫应答(CML)、BC 介导细胞体 液免疫应答(Ig)消灭致病作用。ICC(免疫活性细胞)吞噬病毒、细菌，首先涉及到识别异己的 能力，如何识别并把信息传递给其它 ICC，这就涉及细胞通讯和信息传递问题。 2）神经系统功能是传递兴奋，它迅速将感受器⇌CNS，使多细胞高等生物适应周围 环境，且使 C 各部分协调一致。这种 IS 识别“异己”到消灭“异己” ，神经细胞传递“兴奋” 都属细胞通讯和信息传递范畴。 ③ 人体通讯的三大干线和两类信息物质及三种传递方式 假若大脑是人的通讯总站，人的细胞通讯和信息传递至少有 3 大干线： “硬线”NS； “软线” IS；经络系统。 目前， 了解比较深入的细胞外信息物质有两大类， 一类是甾体激素， 它们可以通过膜脂双层， 自由进入细胞与胞浆或核内相应受体反应，从而影响基因活动。另一类包括蛋白质、多肽、 生物胺等其它小分子，它们共同特点是不能通过脂双层，其信息传递方式有如下几种： 1）简单直接摄入，如 Na+、K+、ATP 酶转运细胞内 Na+、K+可视为特殊信息物 质、 影响细胞内代谢过程。 2）与载体蛋白结合后进入细胞、如 VitB12 和胆固醇。 3）通过受体跨膜信息传递。 2. 信息传递 ①信息传递——通过受体将外来信号刺激传至胞内， 产生一系列信息分子和有规律的生 化级联反应，最终对细胞和整个生物体的生理功能进行调控的过程，称（受体介导的） 信息传递。 ②信息分子——传递信息的媒介称为信息分子。 ③信息传递的方式，可分为： 1） 直接传递——如局部化学介质，在邻近小群 C 之间传递信息； 2） 间接传递——如激素细胞因子（第一信使）→膜 R 结合，活化，→偶联蛋白（G 蛋白）效应酶活化→级联反应→细胞功能性应答。
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文章编号:1001-4829(2002)04-0106-04
收稿日期:2002-09-23
作者简介:唐荣华(1965-),男,广西人,副研究员,在职博士生。主要从事生物工程及经济作物研究。
SSR分子标记的开发技术研究进展唐荣华1,张君诚2,吴为人2(11广西农业科学院经济作物研究所,广西南宁 530007;21福建农林大学作物科学学院,福建福州 350002)摘 要:综述简单重复序列标记(SSR)的特点及在作物遗传图谱构建、品种鉴定及分子标记辅助育种等方面的应用价值。重点描述开发SSR标记的两种方法的基本原理和主要步骤,一种是通过克隆酶切片段和大量测序寻找SSR标记的传统方法,一种是应用SAGE原理不需要克隆的STMP技术。介绍这两种方法在创建小麦或大豆SSR标记中的应用。它们都能有效地开发可扩增出特定位点SSR的PCR引物。关键词:SSR;分子标记;引物开发中图分类号:S188 文献标识码:A
ProgressinthewaytodevelopSSRmolecularmarkerTANGRong2hua1,ZHANGJun2cheng2,WUWei2ren2(1.ResearchInstituteofCashCrops,GuangxiAcademyofAgriculturalSciences,NanningGuangxi530007,China;2.CollegeofCrop
Science,FujianAgriculture&ForestryUniversity,FuzhouFujian350102,China)
Abstract:Thecharacteristicsofsimplesequencerepeats(SSR)anditsimportanceingeneticmapping,varietyidentifyingandmolecularmarker2assistantbreeding,etc,arediscussedinthisarticle.AndtwowayswhichcandevelopSSRmolecularmarkerswiththeirbasicprinci2plesandmainstepsarealsoshowninthisarticle.Oneisthetraditionalwaywhichneedsagreatnumberofcloningofenzyme2cutDNAfragmentsandagreatdealofsequencing,theanotherisanewwaywhichcaneliminatethecloningstepandcanreducemuchmoreworkofsequencingbythebasicprincipleofserialanalysisofgeneexpression(SAGE).TheutilityofthesetwowaysinthedevelopmentofbreadwheatorsoybeanSSRisshown.TheresultsshowedthattheywereeffectiveinthedesigningofPCRprimerstoamplifylocus2specificSSR.Keywords:SSR;molecularmarker;primerdevelopment
所有真核基因组中均含有一类DNA碱基序列,被称为微卫星(LITTandLUTY1989)[1]或简单重复序列(SSRs)(TAUTZetal.1986)[2],它们均由1～6个碱基组成的基本序列串连而成,不同等位基因间的重复数存在丰富的差异,因而是许多真核基因组中普遍存在的遗传标记来源(WANGetal.1994)[3]。微卫星分析的主要技术是聚合酶链式反应(PCR),比之限制性片段长度多态性(RFLP)分析容易得多,而且易于分析自动化。在植物当中,微卫星已被证明在很多物种中是高信息量的,并且是位点特异的分子标记(CONDITandHUBBELL1991,PROVANetal.1996,SMULDERSetal.1997)[4～6]。由于微卫星可在多个等位基因间显示差异,因而在作物的遗传图谱构建,遗传多样性发析,亲缘关系鉴定,
DNA指纹图谱构建,品种鉴定,QTL分析及分子辅助育种中均具有公认的优越性及应用前景。这一分子标记的特殊性及重要性在于其有以下特征:①均匀,随机,广泛地分布于水稻、大麦、小麦、大豆等多种作物基因组中。②SSR序列的两侧顺序常较保守,在等位基因间多相同。③多数SSR无功能作用,增加或减少几个重复序列的重复数不影响生物的正常生长发育,因而在品种间具广泛位点变异,比RFLP及RAPD分子标记更具多态性,尤其对花生、六倍体小麦等用常见分子标记技术检测不出很多DNA片段多态性的作物品种来说,具有更大的研究价值和应用前景。④呈孟德尔式遗传,共显性,因而对个体鉴定具特殊意义。⑤仅需微量组织,即便DNA降解,也能有效地分析鉴定。⑥虽然开始筛选
601西 南 农 业 学 报SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences 2002年15卷4期Vol115 No14重复序列和引物设计过程较慢,但只要确定了引物,
结果稳定。SSR分子标记的开发就是检测出SSR两侧的核苷酸序列作为设计PCR扩增引物的根据,以便在不同品种或不同个体间扩增出多态性SSRDNA片段。本文重点介绍创建SSR标记的常规技术和一种新的改良技术,并以面包小麦为例介绍其应用效果,对其应用前景作一分析。1 常规SSR分子标记开发技术111 基因组文库的构建对提取的基因组DNA进行酶切。酶切一般用两种限制性内切酶,一种是识别位点为6个碱基,如EcoRI(G/AATTC),BamHI(G/GATCC)或者RstI(CT2GCA/G),其中PstI是一种对CNG甲基化敏感的酶,如果识别位点的胞嘧啶被甲基化,则不能切割,可用于特异切割有转录活性的DNA区域;另一种的识别位点为4个碱基,如MboI(/GATC),Sau3A(/GATC)。由于酶切位点较识别位点为6个碱基的内切酶多,因而可得到较小的DNA片段。酶切后的片段在1%琼脂凝胶电泳分离。切下大小为2～5kb或更小的片段,用GenecleanⅡ(Bio101Inc)试剂盒纯化。纯化的片段连接到λ载体如LambdaZapⅡ(Stratagene,LaJolla,CA),Bluescript(Stratagene)等载体上,转化大肠杆菌,如XL22Blue菌株,将转化后的大肠杆菌涂布于含青霉素(100mg/L),X2gal(40μg/L),IPTG(400mg/L)的LB选择培养基上,以便判断连接,转化效果及对克隆的选择。112 带有微卫星克隆的识别和筛选人工合成带放射性同位素或化学发光物质标记的与SSR互补的探针,然后与文库中各个克隆的DNA杂交,鉴定出含有SSR的克隆。需要2～3次重复鉴定以确定目的文库。113 测序筛选出的带SSR序列克隆在作序列分析之前进行预处理:将单个克隆经12h(37℃)液体LB摇动培养后,用QIAwellPlasmidKit(QiagenInc.)分离和提取带插入序列质粒,用作序列分析。序列分析采用ABIdRhodaminesequencingkit,先作PCR反应,经沉淀及变性后在自动的激光荧光DNA测序仪(Pharmacia)上测序。114 引物设计目前多数使用PRIMER015计算机软件(WhiteheadInstitute,Camridage,MA02142)选择引物,主要参数因不同作物和SSR类型而异。一般为:引物长度18～30bp,产物的长度为80～300bp,PCR反应的退火温度为40～60℃。引物3’端有1～2G/C核苷酸,单个引物少于3个核苷酸的互补,
两个引物之间少于连续3个核苷酸的配对,以防止PCR时引物形成二聚物及发夹结构而影响扩增物的产量。115 检测所设计的引物必须经过PCR在对应克隆和基因组DNA中扩增出预计产物才能成为可用的SSR
标记引物。剔除那些两个反应产物片段大小不一致,或非期望片段大小,或有多个片段的引物。MarionS.Rder等[7]利用该技术从含有A、B、
D三个染色体组的六倍体面包小麦基因组中开发出230对微卫星引物,可扩增出279个微卫星。大多数引物对都是基因组特异的,并在三个染色体组之一中只扩增出一个微卫星,只有20%的标记可检测到一个以上的位点。并把93个位点定位到A染色体,115个定位到B染色体组,71个定位到D染色体组。这些标记在连锁图上是随机分布的,但在几个着丝点区域有聚集现象。小麦微卫星的二核苷酸主要重复单位有AG,CA,TA,TC,GT。在大豆中已开发出900多个SSR标记,约700个SSR标记的引物选择设计在(ATT)n两侧,约200个SSR标记的引物选择设计在(CT)n两侧,约30个SSR标记的引物选择设计在(AT)n及其它类型两侧。由于要建基因组文库,并需要对每个克隆进行SSR筛选和鉴定,工作量非常大,找到一个有功能的SSR需要花费大量的人力物力,也需要花费大量的时间,影响了该方法的推广普及。
2 序列标签微卫星整合技术如果在SSR开发过程中省去基因组文库的构建和克隆的筛选,并能在每个克隆质粒的一次测序中获得多个SSR位点的信息,那将会节省大量的费用和时间。M.J.HaydenandP.J.Sharp采用一种新的分子生物学技术———基因表达系列分析(SAGE)原理,构建序列标签文库,用于在目的基因组内进行SSR位点的快速鉴定,从中可开发出微卫星标记。基本原理和具体步骤如下:
(1)基因组DNA酶切:用两种限制性内切酶
(如MseI和PstI)酶切,产生带粘性末端的DNA片
段。(2)连接接头:用T4DNA连接酶把MseI和
PstI两种接头分别连接到所获得的DNA片段上,用QiaQuickPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化连接上接头的DNA片段,并用核酸外切酶Ⅲ处理,降解掉接头未完全接好的DNA片段。
7014期唐荣华等:SSR分子标记的开发技术研究进展