菌种扩大培养
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第二章、菌种的扩大培养2010
实例
放线菌(抗生素生产) 放线菌的细胞生长繁殖速度较慢， 放线菌(抗生素生产)：放线菌的细胞生长繁殖速度较慢，常 常用三级种子扩大培养， 常用三级种子扩大培养，即将种子罐中之菌丝移植到较大的 种子罐中扩大培养后，再移入发酵罐中， 种子罐中扩大培养后，再移入发酵罐中，这种流程称为三级 发酵。一般50t发酵罐多采用三级发酵， 50t发酵罐多采用三级发酵 发酵。一般50t发酵罐多采用三级发酵，有的甚至采用四级 发酵，如链霉素生产。 发酵，如链霉素生产。 霉菌（酶制剂）：酶制剂发酵生产也采用三级发酵。 ）：酶制剂发酵生产也采用三级发酵 霉菌（酶制剂）：酶制剂发酵生产也采用三级发酵。 细菌(谷氨酸)：谷氨酸及其他氨基酸发酵所用的菌种是细菌， 细菌(谷氨酸) 谷氨酸及其他氨基酸发酵所用的菌种是细菌， 生长繁殖速度很快，所以采用二级发酵。 生长繁殖速度很快，所以采用二级发酵。
第二节、 第二节、种子扩大培养
扩大培养的目的：为每次发酵罐的投料，提供相当 扩大培养的目的：为每次发酵罐的投料， 数量的代谢旺盛的种子，以提高发酵效率。 数量的代谢旺盛的种子，以提高发酵效率。 种子的要求：一定的数量、代谢旺盛、不能染菌。 种子的要求：一定的数量、代谢旺盛、不能染菌。 种子扩大培养流程如下： 种子扩大培养流程如下： 斜面菌种---一级种子摇床培养---二级种子罐培 斜面菌种---一级种子摇床培养---二级种子罐培 ---一级种子摇床培养------发酵罐 发酵罐。 养----发酵罐。
接种量的确定
大量地接入成熟的菌种， 大量地接入成熟的菌种，可以缩短生长过程的缓慢 因而缩短发酵周期， 期，因而缩短发酵周期，节约了发酵培养的动力消 提高了设备利用率，并有利于减少染菌机会。 耗，提高了设备利用率，并有利于减少染菌机会。 接种量过多也无必要，因种子培养费时， 接种量过多也无必要，因种子培养费时，而且过多 地移入代谢废物，反而会影响正常发酵。 地移入代谢废物，反而会影响正常发酵。 接种量与菌种的生长速度有关， 接种量与菌种的生长速度有关，如霉菌接种量一般 10%，酵母5 10%，细菌1 5%。 为10%，酵母5-10%，细菌1-5%。 接种量与菌液中菌体的浓度有关，如使用孢子接种， 接种量与菌液中菌体的浓度有关，如使用孢子接种， 接种量可明高的营养缺陷型突 根据代谢控制的要求， 变菌株或调节突变菌株或野生菌株； 变菌株或调节突变菌株或野生菌株； 抗噬菌体能力强的菌株，不易感染噬菌体； 抗噬菌体能力强的菌株，不易感染噬菌体； 菌种纯粹，不易变异退化， 菌种纯粹，不易变异退化，以保证发酵生产和产品 质量的稳定性； 质量的稳定性； 不是病源菌， 不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒 包括抗生素、激素和毒素等) 以保证安全。 素(包括抗生素、激素和毒素等)，以保证安全。
菌种扩大培养
种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于 休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶 及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这 些纯种培养物称为种子。 发酵工业生产过程中的种子的必须满足以下条件： （1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长， 迟缓期短； （2）生理性状稳定； （3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求； （4）无杂菌污染； （5）保持稳定的生产能力。
水质的影响：地区不同、季节变化和水源污染，均可 造成水质波动，影响种子质量。 菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落， 氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。 解决措施： （1）培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用； （2）严格控制灭菌后培养基的质量； （3）斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间； （ 4 ）供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选 种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源。
第二节 种子质量的控制 一、影响种子质量的因素及控制 影响种子质量的因素通常有：培养基、培养条件、培养时间 和冷藏时间等。 1、培养基 种子质量不稳定的主要原因是原材料质量波动。 例如：在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用 的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质 量的影响也不同。 蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响不同。 原材料质量的波动，也会影响孢子质量。如微量元素 Mg2+ 、 Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子 的质量。
例如:
生产啤酒的酵母菌一般保存在麦芽汁琼脂或 MYPG 培养基 （培养基配制：3g麦芽浸出物，3g酵母浸出物，5g蛋白胨，10g 葡萄糖和20g琼脂于1L水中）的斜面上，于4℃冰箱内保藏。每 年移种3-4次。 将保存的酵母菌种接入含 10ml 麦芽汁的 500-1000ml三角 瓶中，再于25℃培养2-3d。 再扩大至含有 250-500ml 麦芽汁的 500-1000ml三角瓶中， 再于25℃培养2d. 移种至含有 5-10L麦芽汁的卡氏培养罐中，于15-20℃培 养3-5d即可作100L麦芽汁的发酵罐种子。从三角瓶到卡氏培养 罐培养期间，均需定时摇动或通气，使酵母菌液与空气接触， 以有利与酵母菌的增殖。
菌种扩大培养
２、生产菌迅速占据了整个培养环境，减少染菌机会。
但过多，易使菌体（菌丝体）生长过快，培养液粘度增加，溶氧 降低，产物合成受影响。 e.g. 嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶
接种1%，酶活最高；1.5%~4%影响不大；大于4%，酶产量明显下降。
第四节 菌种扩大培养
种子扩大培养：将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状
二、生产车间种子制备： 种子罐的作用：使有限数量的孢子(菌体)发芽、生长、 并繁殖成大量的菌丝体(菌体)，满足发酵罐的需要（菌体 生长和产物形成）。实验室种子进入种子罐有孢子进罐法 和摇瓶菌种进罐法。 种子罐级数的确定：种子罐级数是指制备种子逐级扩 培的次数。 依据：菌种生长特性，孢子发芽及菌体繁殖的速度以 及所用的发酵罐的容积。
种子质量的判断方法
通常检测的培养液中参数
pH是否在种子要求的范围之内
糖、氨基氮、磷酸盐的含量
菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观
有无杂菌污染
其他参数，如接种前酶活、种子罐的 溶氧和尾气等
3 种子培养
⑴工业微生物菌种类型 A. 静置培养，又为嫌气发酵，以厌氧菌居多
B. 通气培养，又为好气发酵，以需氧菌和兼性需氧菌居多
态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及 种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。 菌种扩大培养的目的：发酵罐的投料提供足够数量的代谢 旺盛的种子。因为发酵时间的长短和接种量的大小有关，
接种量大，发酵时间则短。将较多数量的成熟菌体接入发
酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率， 并且也有利于减少染菌的机会
嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶 ，培养１２小时接种，酶活最高。
接种量(seed volume)指移入的种子的体积和接种后培养液的体积 比。Antibiotic： 7%~7.5% Glu： 1% 接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度。 采用较大接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰的时间，使 产物形成提前。 原因：1、种子多，种子液中含有大量的胞外水解酶，有利于 对基 质的利用
菌种的扩大培养
菌种的扩大培养、污染的检测与判别种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。
这些纯种培养物称为种子。
微生物工业自从采用纯种发酵以来，产率有了很大的提高，然而防止杂菌污染的要求也更高了。
人们在与杂菌污染的斗争中，积累总结出很多宝贵的经验。
规范了管理措施，设计了一系列设备(例如密闭式发酵罐，培养基灭菌设备，无菌空气制备设备等)和管道，应用了无菌室甚至无菌车间，建立了无菌操作技术，因而大大降低了发酵染菌率。
但是某些发酵工业还遭受着染菌的威胁，染菌后轻者影响产率、产物提取收得率和产品质量，重者造成“倒罐” ，不但浪费大量原材料，造成严重的经济损失，还会对周围环境造成破坏。
凡是在发酵液或发酵容器中侵入了非接种的微生物统称为杂菌污染，及早发现杂菌并采取相应措施，对减少由杂菌污染造成的损失至关重要。
因此检查的方法要求准确、快速。
发酵污染可发生在各个时期。
种子培养期染菌的危害最大，因严格防止。
一旦发现种子染菌，均应灭菌后弃去，并对种子罐及其管道进行彻底灭菌。
发酵前期养分丰富，容易染菌，此时养分消耗不多，应将发酵液补足必要养分后迅速灭菌，并重新接种发酵。
发酵中期染菌不但严重干扰生产菌株的代谢，而且会影响产物的生成，甚至使已形成的产物分解。
由于发酵中期养分已被大量消耗，代谢产物的生成又不是很多，挽救处理比较困难，可考虑加入适量的抗生素或杀菌剂。
如果是发酵后期染菌，此时产物积累已较多，糖等养分已接近耗尽，若染菌不严重，可继续进行发酵;若污染严重，可提钱放罐。
染菌程度越重，危害越大;染菌少，对发酵的影响就小。
所以，实际生产中，应当根据污染程度和发酵时期区别对待。
器材与试剂1.器材高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、带摇床的培养箱、显微镜、天平、三角瓶、试管、移液管、培养皿、接种针、平板涂布器、酒精灯、载玻片2.试剂营养琼脂、葡萄糖、磷酸二氢氨、七水合硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钾、牛肉膏、蛋白胨、0.4%酚红溶液、蒸馏水、番红染液、香柏油、擦镜液3.培养基(1)营养琼脂培养基：直接称量营养琼脂粉4.5g，溶于100mL蒸馏水配制，pH 7.2，分装到试管中，灭菌后摆成斜面。
生产菌种的选育培养—菌种的扩大培养及保藏
2. 通过寄主体进行复壮 3. 淘汰已衰退的个体
（三） 菌种的保藏
不同菌种保藏方法比较
方法名称
主要措施
适宜菌种 保藏期 评 价
冰箱保藏法（斜面）
低温
各大类
3~6月 简便
冰箱保藏法（半固体）
低温
细菌、酵母菌 6~12月 简便
石蜡油封藏法*
低温、缺氧
各大类**
1~2年 简便
沙土保藏法
干燥、无营养 产孢子微生物 1~10年 简便 有效
恢复和建立具有原来生产性状的群体。
菌种的复壮： 狭义：在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离等技术，从已衰
退的群体中帅选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的 相应措施。
广义：在菌种尚未衰退前就有意识地采取纯种分离和生产性状的测 定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。
菌种复壮的措施：
1. 菌种的提纯（稀释涂平板法等、单细胞分离 法）
第四节 菌种的扩大培养及保藏
菌种的扩大培养：将保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠 状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐 级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培 养物称为种子。
一、 菌种的扩大培养
广义：从斜面菌种开始到发酵罐接种之前的所有生产过程。 狭义：仅指生产车间种子罐的培养过程。
菌种衰退的后果： 1. 菌种的发酵能力降低 2. 繁殖能力降低 3. 发酵产品的得率降低
菌种衰退的原因：
1. 基因突变（基因负突变） 2. 变异菌株性状分离 （多次划线分离纯化） 3. 连续传代 （减少传代次数） 4. 其他因素 （温度、湿度、培养基成分）
（二） 菌种的提纯与复壮
菌种的提纯： 从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，以
（三） 菌种的保藏
不同菌种保藏方法比较
方法名称
主要措施
适宜菌种 保藏期 评 价
冰箱保藏法（斜面）
低温
各大类
3~6月 简便
冰箱保藏法（半固体）
低温
细菌、酵母菌 6~12月 简便
石蜡油封藏法*
低温、缺氧
各大类**
1~2年 简便
沙土保藏法
干燥、无营养 产孢子微生物 1~10年 简便 有效
恢复和建立具有原来生产性状的群体。
菌种的复壮： 狭义：在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离等技术，从已衰
退的群体中帅选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的 相应措施。
广义：在菌种尚未衰退前就有意识地采取纯种分离和生产性状的测 定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。
菌种复壮的措施：
1. 菌种的提纯（稀释涂平板法等、单细胞分离 法）
第四节 菌种的扩大培养及保藏
菌种的扩大培养：将保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠 状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐 级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培 养物称为种子。
一、 菌种的扩大培养
广义：从斜面菌种开始到发酵罐接种之前的所有生产过程。 狭义：仅指生产车间种子罐的培养过程。
菌种衰退的后果： 1. 菌种的发酵能力降低 2. 繁殖能力降低 3. 发酵产品的得率降低
菌种衰退的原因：
1. 基因突变（基因负突变） 2. 变异菌株性状分离 （多次划线分离纯化） 3. 连续传代 （减少传代次数） 4. 其他因素 （温度、湿度、培养基成分）
（二） 菌种的提纯与复壮
菌种的提纯： 从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，以
污水处理培养菌种方法
污水处理培养菌种方法污水处理是一项重要的环保工作，其目的是将污水中的有害物质去除或者降低到安全的水平，以保护环境和人类健康。
而污水处理的关键之一就是培养菌种，这是实现高效处理的基础。
本文将从五个大点来阐述污水处理培养菌种的方法。
引言概述：污水处理是一项复杂的过程，要达到理想的处理效果，需要使用适宜的菌种。
培养菌种的方法有不少种，包括传统的培养方法和现代的生物技术方法。
下面将详细介绍这些方法。
正文内容：1. 传统培养方法1.1 选择合适的培养基：根据污水的成份和特性，选择适合菌种生长的培养基。
常用的培养基有富营养培养基、无机盐基础培养基等。
1.2 菌种的分离和筛选：将污水中的细菌进行分离，筛选出适合处理特定污水的菌种。
常用的方法有平板分离法、液体分离法等。
1.3 菌种的纯化和培养：将分离出的菌种进行纯化，得到纯种菌株。
然后，将纯种菌株进行培养，以扩大菌种数量。
2. 现代生物技术方法2.1 基因工程技术：通过基因工程技术，改造菌种的代谢途径，使其具有更高的降解能力。
这包括基因克隆、基因转移等技术。
2.2 蛋白质工程技术：通过改变菌种中特定酶的结构和功能，提高其对特定污染物的降解效率。
这包括蛋白质工程、酶工程等技术。
2.3 微生物组群调控技术：通过调控不同菌种的比例和相互作用，实现协同降解特定污染物。
这包括菌种共培养、菌种共生等技术。
3. 培养条件的优化3.1 温度和pH值的调控：根据不同菌种的生长特性，调节培养条件中的温度和pH值，使其适应菌种的生长要求。
3.2 氧气供应的控制：根据菌种的需氧性或者厌氧性，控制培养条件中的氧气供应，以满足菌种的生长需求。
3.3 营养物质的添加：根据菌种的需求，添加适量的营养物质，以提供菌种生长所需的能量和营养。
4. 培养菌种的监测和评估4.1 菌种的数量监测：通过菌落计数、聚合酶链反应等方法，监测培养过程中菌种的数量变化，以评估培养效果。
4.2 菌种的活性评估：通过测定菌种对特定污染物的降解率、酶活性等指标，评估菌种的降解能力和活性。
发酵工程原理与技术_江南大学-陈坚-7第七章生产菌种的扩大培养与保藏
– 种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减 少染菌机会
– 种子级数太少，接种量小，发酵时间延长， 降低发酵罐的生产率，增加染菌机会
– 虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而 定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种 子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的 繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。
16
16
第二节 种子质量的控制
素含量要高
• 营养成分要尽可能与发酵培养基相近。
27
27
2，培养条件 （1）温度 （2）通气量
在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的 培养基外，有足够的通气量可以提高种子质 量。例如，青霉素的生产菌种在制备过程中 将通气充足和不足两种情况下得到的种子分 别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍 。但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种 子罐的通气量小对发酵有利。
41
41
(3)二级种子的质量要求 种龄 7~8h pH 7.2左右 OD值 净增0.5左右 无菌检查 (-) 噬菌体检查(-)
42
42
二、啤酒酵母的扩大培养
• 菌种在固体培养基上可呈现多种不同代 谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的 菌落类型也越多，不利于生产的稳定。
19
19
• 措施
– 培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使 用
– 严格控制灭菌后培养基的质量 – 斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一
定时间 – 供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源
，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂 的有机氮源
• 通常接种量，细菌1~5%，酵母 菌5~10%，霉菌7~15%，有时
20~25%
30
30
三、种子质量的控制措施
• 种子质量的最终指标是考察其在发酵罐 中所表现出来的生产能力。因此首先必 须保证生产菌种的稳定性，其次是提供 种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入， 以获得优良种子。
– 种子级数太少，接种量小，发酵时间延长， 降低发酵罐的生产率，增加染菌机会
– 虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而 定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种 子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的 繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。
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第二节 种子质量的控制
素含量要高
• 营养成分要尽可能与发酵培养基相近。
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2，培养条件 （1）温度 （2）通气量
在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的 培养基外，有足够的通气量可以提高种子质 量。例如，青霉素的生产菌种在制备过程中 将通气充足和不足两种情况下得到的种子分 别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍 。但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种 子罐的通气量小对发酵有利。
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(3)二级种子的质量要求 种龄 7~8h pH 7.2左右 OD值 净增0.5左右 无菌检查 (-) 噬菌体检查(-)
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二、啤酒酵母的扩大培养
• 菌种在固体培养基上可呈现多种不同代 谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的 菌落类型也越多，不利于生产的稳定。
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• 措施
– 培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使 用
– 严格控制灭菌后培养基的质量 – 斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一
定时间 – 供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源
，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂 的有机氮源
• 通常接种量，细菌1~5%，酵母 菌5~10%，霉菌7~15%，有时
20~25%
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三、种子质量的控制措施
• 种子质量的最终指标是考察其在发酵罐 中所表现出来的生产能力。因此首先必 须保证生产菌种的稳定性，其次是提供 种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入， 以获得优良种子。
《菌种扩大培养》课件
重要性
菌种扩大培养是微生物实验和工业生 产中的重要环节，它能够提供足够数 量的微生物用于实验或生产，是实现 微生物利用的关键步骤。
菌种扩大培养的基本原理
生长曲线
菌种扩大培养需遵循微生物的生长曲线，即适应期、对数生长期和稳定期。在适应期，微 生物需要适应新的环境；在对数生长期，微生物快速分裂繁殖；在稳定期，微生物繁殖速 度减缓，细胞开始出现分化。
菌种活性检测
定期检测菌种的活性，确保菌种在 培养过程中保持较高的活性。
03
菌种扩大培养的技术与设备
微生物培养技术
微生物培养基
选择适宜的培养基成分，如碳源、氮 源、无机盐等，以支持微生物的生长 和繁殖。
无菌技术
培养条件控制
根据微生物的特性，控制培养温度、 湿度、pH值等条件，以获得最佳生长 效果。
工业生产
在工业生产中，菌种扩大 培养可用于发酵、酶工程 、生物制药等领域，提供 足够数量的目的产物。
农业生产
在农业生产中，菌种扩大 培养可用于菌肥、生物农 药等的生产，提高农作物 的产量和品质。
02
菌种扩大培养的步骤
菌种选择与纯化
菌种选择
选择适合工业化生产的菌种，考 虑其生长速度快、产率高、对环 境的适应性等。
新型发酵技术如连续发酵、分批补料发酵等能够提高菌种的发酵效率和产物得率 ，降低能耗和资源消耗。
新型发酵技术还有助于解决传统发酵工艺中存在的瓶颈问题，如高细胞密度培养 和产物抑制等，为菌种扩大培养提供新的解决方案。
智能化、自动化技术的进一步发展
智能化、自动化技术能够实现菌种扩大培养过程的实时监测 、控制和优化，提高培养过程的稳定性和可重复性。
《菌种扩大培养》PPT课件
目录 Contents
菌种扩大培养是微生物实验和工业生 产中的重要环节，它能够提供足够数 量的微生物用于实验或生产，是实现 微生物利用的关键步骤。
菌种扩大培养的基本原理
生长曲线
菌种扩大培养需遵循微生物的生长曲线，即适应期、对数生长期和稳定期。在适应期，微 生物需要适应新的环境；在对数生长期，微生物快速分裂繁殖；在稳定期，微生物繁殖速 度减缓，细胞开始出现分化。
菌种活性检测
定期检测菌种的活性，确保菌种在 培养过程中保持较高的活性。
03
菌种扩大培养的技术与设备
微生物培养技术
微生物培养基
选择适宜的培养基成分，如碳源、氮 源、无机盐等，以支持微生物的生长 和繁殖。
无菌技术
培养条件控制
根据微生物的特性，控制培养温度、 湿度、pH值等条件，以获得最佳生长 效果。
工业生产
在工业生产中，菌种扩大 培养可用于发酵、酶工程 、生物制药等领域，提供 足够数量的目的产物。
农业生产
在农业生产中，菌种扩大 培养可用于菌肥、生物农 药等的生产，提高农作物 的产量和品质。
02
菌种扩大培养的步骤
菌种选择与纯化
菌种选择
选择适合工业化生产的菌种，考 虑其生长速度快、产率高、对环 境的适应性等。
新型发酵技术如连续发酵、分批补料发酵等能够提高菌种的发酵效率和产物得率 ，降低能耗和资源消耗。
新型发酵技术还有助于解决传统发酵工艺中存在的瓶颈问题，如高细胞密度培养 和产物抑制等，为菌种扩大培养提供新的解决方案。
智能化、自动化技术的进一步发展
智能化、自动化技术能够实现菌种扩大培养过程的实时监测 、控制和优化，提高培养过程的稳定性和可重复性。
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优良种子应具备的条件
菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅 速生长，迟缓期短； 生理性状稳定； 菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求； 无杂菌污染； 保持稳定的生产能力。
种子制备过程
实验室种子制备阶段：琼脂斜面至 固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜 面培养等）或液体摇瓶培养
生产车间种子制备阶段：种子罐扩 大培养
对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以 用液体培养法(通过摇瓶培养提供比较好的溶氧）。
实验室种子的制备-1
e.g 产黄青霉菌(P.chrysogonum) 原始菌种 斜面试管 获得孢子
250ml 茄子瓶（大米或小米） 25 ~28 ℃ ，4~14天 成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下 ，于4 ℃冰箱保存）。
种子培养注意问题
泡沫控制 影响：氧的吸收；二氧化碳排放；缩小发酵容积； 引起染菌等 原因：通气、搅拌、成分变化、微生物代谢活动 措施：机械法（振动或压力）、化学法（消泡 剂）、改善培养基成分等
染菌控制 原因：设备管道等泄露、灭菌不彻底、空气净 化不好、无菌操作不严或菌种不纯等 控制：消毒到位，无菌操作；纯菌种；工艺条 件严格控制等
e.g.
Glutamic acid-producer：（谷氨酸生产菌） 固体试管斜面（32 °C ，18~24小时）
原始culture)
种子罐培养
放线菌孢子的制备
放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基， 培养基中 含有一些适合产孢子的营养成分，如 麸皮、豌豆浸汁、蛋 白胨和一些无机盐等。
对于不产孢子的赤霉素生产菌，也可用大米固体培养 基在茄子瓶中培养菌丝体，用作种子罐种子。 产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的 灰色链霉菌，产卡那霉素的卡那链霉菌，可以用摇瓶液体 培养法，孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇床上培养， 获得菌丝体，作为种子。 不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状杆菌 （Corynebacterium）、短杆菌（Brevibacterium），生产上 一般采用斜面营养细胞进行扩培，再转入液体摇瓶培养， 获得细胞悬液再接种。
培养温度一般为28˚C。 培养时间为5~14天。
碳氮源不要太丰富 干燥和限制培养直接或间接诱导孢子形成 母斜面孢子接种利于防止菌种变异；子斜面孢子接种利于 节约菌种用量
霉菌孢子的制备 霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉 米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。 培养的温度一般为25~28˚C。 培养时间一般为4~14天。
种子罐级数越少越好，原因： 简化生产工艺和控制 减少接种带来的染菌机会 需考虑：尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生产
而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率［产物／ml· h］。
e.g. Glutamate fermentation 一级种子扩培 实验室种子 种子罐 发酵罐
e.g. penicillin fermentation 实验室种子 一级种子罐
第三节 微生物菌种生长条件
温度 pH 氧 种龄 接种量
温度 最低生长温度：微生物能进行繁殖的最低温度 最适生长温度：微生物生长繁殖速度最快温度 最高生长温度：微生物能进行繁殖的最高温度 致死温度：致死微生物的最低温度
pH
大多数微生物生长适应的pH跨度为3-4个pH 单位，最佳生长pH跨度在0.5-1 pH最适范围:细菌和放线菌6.5-7.5；酵母和 霉菌在4.5-5.5
大量地接入培养成熟的菌种的优点：
缩短生长过程的延缓期，因而缩短了
发酵周期，提高了设备利用率
节约发酵培养的动力消耗
有利于减少染菌机会
放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种龄对多糖产量的影响
接种量：移入的种子液体积和接种后培养液体的体积的比例 接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰老细胞增加 等，发酵后劲不足 种量过少延长发酵周期，形成异常形态，且易造成染菌 以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据 接种量的大小直接影响发酵周期
态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及 种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。 菌种扩大培养的目的：发酵罐的投料提供足够数量的代谢 旺盛的种子。因为发酵时间的长短和接种量的大小有关，
接种量大，发酵时间则短。将较多数量的成熟菌体接入发
酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率， 并且也有利于减少染菌的机会
⑵培养方法及特点 A. 液体培养法：液体试管、三角瓶摇床振荡或回旋式培养 B. 表面培养法：茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养 C. 固体培养法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培养皿等麸皮培 养
⑵培养方法及特点
表面培养
一种好氧静置培养法，不需深层的搅拌和通气，省动力。 如醋酸、柠檬酸发酵等。
固体培养
浅盘和深层固体培养，统称取法培养。固体曲的酶活力高。
二级种子扩培 二级种子罐 发酵罐
e.g. Streptomycin fermentation
实验室种子 一级种子罐
三级种子扩培
三级种子罐 发酵罐
二级种子罐
(Streptomyces griseus)－－灰色链霉菌
2 接种龄与接种量 接种龄
种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种 子罐或发酵罐时的培养时间 种子培养期应取菌种的对数生长期为宜， 菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而 且会降低产量。
嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶 ，培养１２小时接种，酶活最高。
接种量(seed volume)指移入的种子的体积和接种后培养液的体积 比。Antibiotic： 7%~7.5% Glu： 1% 接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度。 采用较大接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰的时间，使 产物形成提前。 原因：1、种子多，种子液中含有大量的胞外水解酶，有利于 对基 质的利用
一般相对湿度40~45%时孢子数量最多，孢子颜色均匀，质量较好。 培养时间和冷藏时间对种子和孢子形成都有影响。 如土霉素菌种孢子斜面培养四天左右，即于4℃冰箱保存，发现冷 藏7~8天菌体自溶，而培养五天以后冷藏，20天未发现自溶。 链霉素生产菌，斜面孢子在6 ℃冷藏两个月后的发酵单位比冷藏 一个月降低8%。
四. 种子质量的控制措施
必须保证生产菌种的稳定性
提供种子培养的适宜环境条件，保证无杂菌侵入 1. 菌种稳定性的检查： 少量菌种--无菌生理盐水--递增稀释--平板划线培养。 挑出形态整齐，孢子丰满的菌落进行摇瓶试验，测定其 生产能力。 2. 无菌检查： 显微镜观察、种子液进行无菌检验、生化分析。
种子液平板划线、斜面培养用肉眼观察是否有异常菌落、 异常现象及镜检是否有杂菌。
液体深层培养
易按照生产菌种对代谢营养要求及不同生理时期的要求条 件，选择最佳培养条件。
三. 影响种子质量的因素
1. 原材料质量：如四环素、土霉素生产中配制孢子培养基的麸皮 （wheat bran）、霉菌用的大（小）米、琼脂的牌号的不同、蛋白胨 加工原料不同等均影响种子的质量。 原料质量的波动，起主要作用的是其中的无机盐含量的不同，如 微量元素Mg++、Ca ++ 、Ba++能刺激孢子的形成。P含量的多少也影响 种子的质量。 氨基酸发酵中，淀粉水解糖制备后，加入其他的营养物（麸皮水 解液、豆饼水解液、玉米浆），也对种子质量多少有些影响。
氧 影响因素 培养及成分和浓度 菌龄影响 发酵条件影响 有毒代谢产物影响
通风和搅拌 培养罐深，搅拌转速大，气泡在培养液 内停留时间就长，氧的溶解度就大，培 养基的黏度越小，氧的溶解度越大
过度搅拌会导致培养液大量涌泡，增加 染菌机会
种龄与接种量： 种龄(seed age)指种子罐培养种子从开始至结束的培养时间。 在种子罐中，培养时间延长－－菌体量增加－－基质消耗及代谢 产物积累－－菌体量不再增加－－老化 过老：生产能力下降，菌体自溶。 过嫩：前期生长缓慢，发酵周期延长，产物形成时间推迟，甚至 造成异常发酵。 适宜时间：以菌体处于生命力极为旺盛的对数生长期且培养液中 菌体量还未达到最高峰时，较为适宜。
二、生产车间种子制备： 种子罐的作用：使有限数量的孢子(菌体)发芽、生长、 并繁殖成大量的菌丝体(菌体)，满足发酵罐的需要（菌体 生长和产物形成）。实验室种子进入种子罐有孢子进罐法 和摇瓶菌种进罐法。 种子罐级数的确定：种子罐级数是指制备种子逐级扩 培的次数。 依据：菌种生长特性，孢子发芽及菌体繁殖的速度以 及所用的发酵罐的容积。
种子质量的判断方法
通常检测的培养液中参数
pH是否在种子要求的范围之内
糖、氨基氮、磷酸盐的含量
菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观
有无杂菌污染
其他参数，如接种前酶活、种子罐的 溶氧和尾气等
3 种子培养
⑴工业微生物菌种类型 A. 静置培养，又为嫌气发酵，以厌氧菌居多
B. 通气培养，又为好气发酵，以需氧菌和兼性需氧菌居多
发酵终点判断（P51）
经济因素 最低成本获得最大生产能力的时间 产品质量因素 发酵周期对提取工艺及产品质量的影响 特殊因素 染菌、代谢异常等 合理的放罐时间有实验确定
一般情况：培养基糖分要少，氮源要多，无机盐所占的比例要大。 种子罐和发酵罐培养基成分趋于一致也有好处，种子很快适应，但各 成分的数量根据目的各自确定。 总之，各成分选择得当，才能发挥菌种的特征，提高产量。
2. 培养条件：
温度、pH值、湿度、培养时间和冷藏时间等都影响种子质量。
制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量影响很大。 如土霉素生产菌种龟裂霉菌的孢子，在北方干燥地区孢子斜面长 的快，在含少量水分的试管斜面培养基中下部孢子长的好，而上部孢 子稀少；气温高，湿度大的地区，斜面孢子长的慢，试管下部冷凝水 多而不利于孢子形成。