矿物微生物浸出资源加工学

❖直接计数法
利用血球计数器，取菌液样品直接在显微镜下 观察计数。若测定单位菌液体积所含活菌数目，则 须用平皿计数法和稀释计数法。 ❖平皿计数法
将稀释后的菌液用固体培养基制成平板，然后 在一定温度下培养，使其长成菌落，计算菌落数目， 再乘以稀释倍数，则为所测菌液的活菌浓度。
❖稀释法
将菌液按10的倍数在培养基中连续稀释成不同 浓度，然后进行培养。观察细菌能够生长的最高稀 释度，此最高稀释度培养液中的细菌数目为1个，则 可按总的稀释倍数计算出原菌液内所含活菌的浓度， 一般达到正常繁殖情况下菌液活菌浓度为106～1010 个/mL。
结论： 黄铁矿细菌浸出以Fe3+间接氧化作用为主。
12.2.3 复合作用说
1)论点
复合作用机制是指在细菌浸出当中，既有细 菌的直接作用，又有通过Fe3+氧化的间接作用。 有些情况下以直接作用为主，有时则以间接作用 为主，但两种作用都不可排除。
这是迄今为止绝大多数研究者都赞同的细菌 浸出机制。
2)复合作用的证据 黄铁矿的浸出 辉铜矿的浸出反应：
12.2 微生物浸出基本原理
12.2.1 直接作用说
1)论点
在有水和空气的条件下，受氧化铁硫杆菌作用， 金属硫化矿会发生如下反应：
2FeS2+7O2+2H2O2FeSO4+2H2SO4 4FeSO4+O2+2H2SO4 2Fe2(SO4)3+2H2O CuS+2O2 CuSO4 CuFeS2+4O2 CuSO4+FeSO4
12 矿物微生物浸出
12.1 微生物浸矿
12.1.1 浸矿微生物种类、来源及生理生态特性 1)种类 ❖ 自养菌
在生长和繁殖过程中，不需要任何有机营养， 而是完全靠各种无机盐而生存的这类微生物。 ❖ 异养菌
需要提供现成有机营养才能生存的一类微生物。
结论: 与矿物浸出有关的微生物大部分属于自养菌，
某些异养菌也可以溶浸金属矿物，在生产中得 到实际应用的主要是自养类微生物。
❖ 常见的浸矿自养菌 排硫杆菌 特征：
¶ 菌体呈杆状，在液体硫代硫酸盐培养基上可 以生成小而圆的菌落，由于生成硫沉淀，菌落 呈黄色。
¶ 通常只存活一个星期左右，它可将硫代硫酸 盐氧化成元素硫，又将元素硫氧化成硫酸。
氧化硫硫杆菌 特征： ¶ 为圆头短杆状，通常以单个或成双、成短链状 存在，在菌体两端各有一油滴，可将培养基中的 硫溶入油滴之中再吸入体内进行氧化 ¶ 其氧化元素硫的能力比氧化硫化合物的能力强， 可以产生较多的酸，并有较强的耐酸性能，可耐 5%的硫酸。
细菌不产生元素硫： Cu2S+H2SO4+2O2 = 2CuSO4+H2O
用细菌浸出已知组成的铜蓝和辉铜矿发现有菌与无 菌条件下铜蓝的浸出速度相差很大。
由于浸出环境中没有Fe3+及其他氧化剂，所以浸出 作用只能是由细菌引起的，在浸出期间酸耗等于零。 矿物中CuS与S被等速浸出，反应如下：
Cu+1/2O2+2H2+===Cu2++H2O S+3/2O2+H2O===2H++SO42+ 总反应 ：CuS+2O2=CuSO4
❖ 稳定生长期 细菌死亡数目和新生数目大致相等，总的细菌
数维持恒定。这个时期培养器内细菌的绝对数是最 多的。但此时培养基中营养大量消耗，细菌已变得 不太活跃，当进入大量培养或用于生产接种时，应 当使用稳定期内尽量靠近对数期的细菌。 ❖ 衰亡期
细菌开始大量死亡，培养器内总的细菌数目急 剧减少。此时培养基中的营养物质已基本消耗完。
❖方法
取50~250mL细口瓶、洗净并配好胶塞，用牛 皮纸包扎好瓶口，置于120℃烘箱灭菌20min，冷 却后可作为细菌取样瓶，带取样瓶到上述矿山取 酸性坑水。
2)培养 ❖步骤 配好的培养基用蒸汽灭菌15min后，在无菌操作 下分装于数个已洗净并灭菌的100mL三角瓶中。 每瓶装培养基20mL，用洗净干燥吸液管分别取 1～5mL矿水样加到三角瓶中，塞好棉塞置于20～ 35℃恒温下，静置培养（或振动培养）7～10天。
❖ 自养化能菌的特征
靠氧化培养基中的亚铁离子或硫化合物取得 能量以空气中的CO2作为碳源，并吸收培养基 中的氮、磷等无机盐营养，合成菌体细胞。
菌的生活需要氧气，属于好氧菌，它们广泛 生活于金属硫化矿和煤矿等矿山的酸性矿坑水 中。
除利用的能源有差异外，其他性质都十分相 近。
说明：
氧化硫硫杆菌、氧化铁铁杆菌和氧化 铁硫杆菌三种自养菌的性能十分相近， 而且难以将它们分开，所以有人视它们 为一种菌，定名为氧化铁硫杆菌。
12.1.2 浸矿细菌的培养基
❖液体培养基 由水和溶在水中的各种无机盐组成的，液体培养
基用于粗略地分离培养某种微生物。
❖异养菌
平板分离用的固体培养基，是在液体培养基中 加入1.5%琼脂（洋菜）或一定量硅胶制成的。
方法：在加热条件下配成一定浓度的消毒琼脂 溶液后，再加入无菌过滤的FeSO4等无机盐母液， 用H2SO4调节好酸度，冷却至常温即制成固体培 养基。
2)细菌间接作用的证据
黄铁矿的细菌浸出有直接作用也有间接作用。 2FeS2+7O2+2H2O=2FeSO4+2H2SO4
FeS2+7Fe2(SO4)3+8H2O=15FeSO4+8H2SO4 有铁时的浸出速度比无铁时快，说明黄铁矿细菌浸 出，高铁氧化作用比细菌直接氧化作用更重要。加 入Fe2+和加入Fe3+的浸出效果不一样，说明细菌氧 化Fe2+的速度远远高于Fe3+被黄铁矿还原的速度。
12.1.5 浸矿细菌的驯化
1)影响细菌生长的因素
浸矿细菌的细胞膜类似于半透膜，可透过水分 而对其他物质有选择性。细菌较其他生物细胞对 渗透压的变化有较强的适应能力，但外界盐分浓 度过高，会抑制细菌生长，甚至因渗透压变化过 大，造成细菌死亡。
重金属离子可使细胞蛋白质凝固，大部分重金 属离子对细菌有毒性作用，超过一定限度，细菌 会因细胞脱水而死亡。
重铬酸钾容量法测定 测定培养液中亚铁变成高 铁的数量。变化快的，说明细菌生长旺盛。
显微镜观察 观察细菌的形成，是否具有氧化铁 硫杆菌的形状特征。
说明：
上述方法得到的菌种是不纯的，如要分离纯种， 上述分离过程要无菌操作，并且要作平板分离。
❖平板分离 ➢方法 把配制好的固体培养基倒入培养皿制成平板。 在无菌操作下，用接种环取上述培养菌液在平 板上划线分离，使所取菌液中的菌体细胞尽量沿划 线分散开。 将划好的线培养皿在25～30℃条件下恒温培养。
在装有一定体积培养基的三角瓶中加入较低浓 度的金属离子后，接种入要驯化的细菌进行恒温培 养，待细菌适应能正常生长后，将它再转移到含有 更高浓度金属离子的培养基中继续培养。依此类推， 每转移一次都提高金属离子浓度，最终可获得对该 金属离子具有较强耐性的菌株。
12.1.6 细菌的计量
❖比浊法
利用菌液所含细菌浓度不同，液体混合度不同， 用分光光度计测定菌液的光密度的办法进行计算。 将光密度大小与标准曲线对比，可以推知菌液的浓 度。
Cu2S+H2SO4+O2=2CuSO4+H2O 直接作用：不生成S
Cu2S+H2SO4+5/2O2 = 2CuSO4+H2O 间接作用：生成S，但S又被氧化为硫酸
Cu2S+2Fe2(SO4)3=2CuSO4+4FeSO4+S 单独用Fe2(SO4)3浸出：可看到沉淀S生成
12.2.4 电位-pH图
如果在含硫化铜培养基中培养，一般要2～4周
如果细菌的养料不变，则转移当中的的缓慢期 就很短，甚至没有缓慢期。
❖ 对数生长期
随着细菌适应环境后，生长非常活跃，以对数增 长的速度繁殖，此时细胞数目大量增加，对数生长期 的曲线斜率就是细菌生长率μ：
1dnd(long)
ndt dt
这个时期新增加的细菌数目远超过死亡的细菌数。
以上是所有微生物生长繁殖所必须经历的四个时期， 每个时期的长短和细菌的活跃程度受环境因素制约。
❖ 生长缓慢期
当细菌由一个环境转移到一个新环境时，会出 现一个逐步适应的缓慢生长期，细菌生长繁殖速 度很慢，细菌也不活跃。根据被培养细菌对环境 的适应性，这个时期可能很短，也可能较长。
比较正常的情况是2～4周
❖培养的机制
在转移培养中，借助培养基的高酸度，可杀死 淘汰掉一些不嗜酸的杂菌，同时由于培养基中的高 浓度亚铁离子，只有氧化亚铁的细菌才能生长繁殖， 其他菌则被杀死淘汰掉，而氧化铁硫杆菌则得到充 分繁殖，活性越来越大。
❖氧化铁硫杆菌的检查和鉴定方法
肉眼观察 如有该菌生长，则培养基中的亚铁将 被氧化变成高铁，培养基的颜色由浅绿变成红棕 色，最后产生高铁沉淀。
硫细菌和铁细菌的生活环境，正处于金属硫
蚀阴沟硫杆菌 特征：
与氧化硫硫杆菌类似，但它可以利用硝酸盐 和铵离子作为氮源，不能利用亚硝酸盐。
氧化铁铁杆菌
特征： 呈短杆状，可将亚铁离子氧化成高铁离子，在
液体培养基中由于生成Fe3+使培养基由浅绿色变成 红棕色，在固体培养基上长成红棕色菌落。
氧化铁硫杆菌 特征： ¶ 菌体呈杆状，它可以氧化亚铁为高价铁，也 可将硫代硫酸盐氧化为硫酸。 ¶ 含亚铁的液体培养基中，亚铁被氧化使培养 基变成红棕色，Fe3+水解成氢氧化物或铁矾沉 淀。 ¶ 用不含铁的液体培养基，则由于硫代硫酸盐 氧化生成硫酸，使培养基酸度提高。
2) 细菌直接作用的证据 在无Fe3+条件下细菌可以浸蚀辉铜矿和铜蓝。 细菌可浸蚀元素硫。反应是：
2S+3O2+2H2O 2H2SO4 (无菌下此反应难发生)
对比细菌和Fe3+浸出辉铜矿（CuS2）发现二者的 反应产物不同。