大型溞毒性实验标准
水质物质对蚤类(大型蚤)急性毒性测定方法
水质物质对蚤类（大型蚤）急性毒性测定方法water quality——Determination of the acute toxicityof substance to Daphnia（Daphnia magna straus）GB/T13266-91本标准参照采用国际标准ISO 6341—1982《水质——大型蚤运动抑制的测定》。
本标准用大型蚤（Daphnia magna straus（Cladocera Crustacea））为试验生物。
测定物质或废水的半数抑制浓度，半数致死浓度（24h-EC50、24h-LC50或 48h-EC50、48h－LC50），用于判断物质或废水的毒性程度。
1 适用范围本标准适用于以下范围；a.在试验条件下可溶的化学物质（包括工业原料和产品、食品添加剂、农药、医药等）。
b.工业废水。
C.生活污水。
d.地表水、地下水。
2 原理2.1 24h－EC50、48h－EC50指在 24或 48 h内百分之五十的受试蚤运动受抑制时被测物的浓度。
2.2 运动受抑制（Immobilization）反复转动试验容器，15s之内失去活动能力的大型蚤，被认为运动受抑制。
即使其触角仍能活动，也应算做不活动的个体。
2.3 24h－LC50、40h－LC50指在24或48h内百分之五十的受试蚤死亡时被测物的浓度，以受试蚤心脏停止跳动为其死亡标志。
3 试验材料3.1试验生物为大型蚤（Daphnia magna straus,甲壳纲，枝尼亚目）。
保持良好的培养条件，使大型蚤的繁殖被约束在孤雌生殖的状态下（见附录A）。
选用实验室条件下培养3代以上的、出生 6～24 h的幼蚤为试验蚤。
试验蚤应是同一母体的后代。
3.2试验用水：3.2.1配制人工稀释水为试验用水。
新配制的标准稀释水PH为7.8±O.2，硬度250±25 mg／L（以CaCO3计）Ca／Mg比例接近 4:1，溶解氧浓度在空气饱和值的 80 ％以上，并不含有任何对大型蚤有毒的物质。
大型水蚤测试标准方法
大型水蚤测试标准方法大型水蚤测试标准方法本标准部分参照国际标准ISO6341：1982《水质——大型水蚤(甲壳纲、枝角目)活动抑制的测定》(UDC 617.777：576.097.2)及美国标准法“水和废水标准检验法”804B.水蚤(Daphnia)的生物检测步骤。
1 主题内容与适用范围本标准规定了大型水蚤生物测试技术中生存及运动影响(急性试验)和生长及繁殖试验方法(慢性效应)。
本标准适用于评价可溶性化学物质的毒性；评价工业废水及工业固体废物浸出液的综合毒性；评价废水处理效果；也适用于地面水、地下水的毒性评价及水中沉积物的毒性评价。
2 方法原理2.1 测定初始浓度EC50值，此浓度是指在本标准规定的条件下，24h及48h内使50%暴露在试验液中的大型水蚤失去活动能力的浓度，并指出使所有实验水蚤失去活动能力的最低浓度，及不能使任何实验水蚤丧失活动能力的最高浓度。
2.2 测定初始浓度LC50值，此浓度是在本标准规定的条件下24h 及48h内使50%暴露在试验液中的大型水蚤心脏停止跳动能力的浓度，并指出使所有大型水蚤死亡的最低浓度及不引起死亡的最高浓度。
2.3 测定生长曲线，不同浓度下实验水蚤生长的速度不同，其生长曲线也不同，与对照组生长曲线比较判断其生长影响。
2.4 测定生殖量，相同条件的实验水蚤在不同浓度实验液中由于毒性作用，其每胎生出的幼水蚤数量不同，与对照组比较判断其毒性。
3 试剂和材料3.1 试验生物采用大型水蚤(Daphnia magna straus)62Dm纯品系生物株，为同龄同母体后代。
EC50及LC50试验用1龄～3龄水蚤，每容器10个，平行2～3组；繁殖及生长试验用刚出生的幼水蚤，每浓度组5～6个水蚤。
3.2稀释水可采用未被有毒物质污染的天然水(地面水或地下水)及自来水(自然暴气的)，pH值为7～8.6，溶解氧4mg/L以上，或空气饱和氧的60%以上，水的硬度为250±22mg/L(以CaCO3表示)，也可用符合上述条件的人工配制水。
实验方案
材料：1.大型水溞（做水生态毒理或是水生态、小池塘）（采自淡水池塘,在20±1℃的恒温光照培养箱中进行纯系培养。
挑出一只健壮个体进行孤雌繁殖后移出母溞继续培养幼溞,如此反复操作直至达到试验要求的幼溞数量。
其间投喂纯培养的淡水小球藻Chlorellasp.,小球藻培养的密度约为6×106cells/mL,日投喂量为10mL。
挑选溞龄小于24h的健康幼溞供试。
）1.预备试验：试验浓度分别为0.1、1、10mg/L，每个浓度至少放5个幼蚤，通过预试验找出被测物使100％大型蚤运动受抑制的浓度和最大耐受浓度的范围，然后在此范围内设计出正式试验各组的浓度。
2.正式试验：根据预备试验得出的浓度范围,设置6 个系列试验浓度和一个空白对照组,设置浓度分别为:？？？.每个浓度 3 个平行组,试验容器为50mL 烧杯,盛放40mL 试验溶液,每个烧杯中放10 只个体均匀的6~24h 的幼溞,水温(20±2)℃.用曝气大于24h 的稀释水(pH6.8∼7.2,COD1.02∼1.20ma/L, TOC0.02mg/L,电导率160∼170μS/cm,硬度(200±25)mg/L(以CaCO3 计,Ca、Mg 比例接近4:1))配制成不同浓度的试验液,保持光照与黑暗比16h:8h,试验期间不投放饵料,不更换试验溶液,分别于24,48,72,96h 在显微镜下观察大型溞存活状况（不活动或死亡）并记录试验结果,心脏停止跳动视为死亡.对照组死亡率不超过10%.3.检查大型蚤的敏感性4.慢性毒性试验：试验浓度设置以急性48h-LC50 和预试试验结果为基础,设置一个空白对照组以及 5 个浓度,分别为？？？？.每个浓度20个平行组.每个烧杯中盛放50mL 试验溶液及 1 只6∼24h 的幼溞.试验期间采用半静态试验系统,每隔1d更换1次试验溶液,保证试验期间受试液浓度为起始浓度的80%以上,更换受试液时滴加新鲜的斜生栅藻浓缩液 1 滴,使试验液中的藻密度为2.0×105∼3.0×105cells/mL.试验期间每24h 观察 1 次,取出新生幼溞,记录母溞第 1 次产溞时间、第 1 次产溞数、第3次产溞时间、第3次产溞数以及整个试验过程中的产溞次数、总产溞数、母溞脱皮次数、产雄溞数等,试验结束时在显微镜下测量母溞的体长(从头盔至壳刺部的长度).5. 子代恢复分别选取每个试验处理组中母溞所生的第1胎幼溞F1(lst)和第3胎幼溞F1(3rd)各20只(小于24h),分别放在50mL没有受试液的正常培养液中(恢复期),进行21d的恢复培养,其他条件与以上的慢性毒性试验相同.试验期间每24h 观察 1 次,取出新生幼溞,记录母溞第 1 次产溞时间、第1次产溞数、第3 次产溞时间、第3次产溞数以及整个试验过程中的产溞次数、总产溞数、脱皮次数等,试验结束时在显微镜下测量其体长(从头盔至壳刺部的长度)6. 对大型溞的胚胎毒性将怀卵8h 的母溞置于解剖镜下,从母溞体内取出卵,分别暴露于已准备好的不同浓度的处理液和空白对照液中,其中有机硅为0.05,0.10,0.20,0.40,0.60mg/L,每个处理10 卵粒,4个重复.在培养条件下进行孵化,24,48,72,96h(直到对照组不再孵化)检查结果,记录孵化受抑制率和对发育阶段的抑制情况观察.。
甲基嘧啶磷对三种水生生物的急性毒性及安全性评价
甲基嘧啶磷(Pirimiphos-methyl)是1974年英国帝国化学工业集团开发的一种低毒、高效、低残留的嘧啶类有机磷杀虫杀螨剂[1]，属于胆碱酯酶（ChE ）抑制剂，其致毒机理为阻抑昆虫神经突触上乙酰胆碱酯酶（AchE ）的活性，引起乙酰胆碱（ACh ）蓄积，使胆碱神经受到持续冲动，导致害虫持续兴奋后死亡[2-4]。
常被用于粮食仓储防虫，是联合国粮农组织和世界卫生组织推荐使用的储粮防护剂[5]。
目前对甲基嘧啶磷的研究主要集中在合成开发和复配[6]、仓储防效[7-8]、残留[9-10]、分析方法开发[11]及废水处理[12]。
甲基嘧啶磷在农药登记中均为卫生杀虫剂或用于仓储杀虫，其除了对仓储害虫具有很好的防效外，还对田间害虫具有一定的活性，可进行甲基嘧啶磷农药登记使用范围的扩大研究。
有研究表明[13]，有机磷农药喷洒后一般只有10%～20%的药液在作物上附着，剩余大部分均残存在土壤、水和大气中，之后随着降水、沉降和径流的冲刷而进入地下水和江河湖泊中，进而对水生生物造成影响。
因此，有必要研究甲基嘧啶磷对水生生物的毒性效应，从而更加全面、可靠地评价甲基嘧啶磷的环境安全性。
目前常用于污染物毒性评价的水生生物主要有藻类、溞类和鱼类。
藻类作为水生生态系统的初级生产者，是评价水环境质量和污染物生态毒性的关键生物，如被研究者广泛应用到水环境毒理试验中的斜生栅藻(Scenedesmus obliquus )对环境污染程度就有着高度敏锐性[14]。
溞类是浮游动物的主要构成部分，对水生生态系统的功能、结构和生物生产力起着至关重要作用。
溞类中研究使用最多的是大型溞(Daphnia magna )，其分布范围广，并对毒物具有较高的敏锐收稿日期：2023-03-09作者简介：马纪（2000—），女，湖南汨罗人，在读硕士，主要研究方向为农药生态毒理。
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*为通信作者，E-mail ：**************。
5％甲氨基阿维菌素苯甲酸盐微乳剂对6种环境生物的急性毒性
5％甲氨基阿维菌素苯甲酸盐微乳剂对6种环境生物的急性毒性游泳;林涛;李建宇;史梦竹;郑丽祯;傅建炜;魏辉【摘要】甲氨基阿维菌素苯甲酸盐是一种新型的抗生素类杀虫剂、杀螨剂，其大量使用可能会导致一系列的生态风险，因此有必要开展其对相关环境生物毒性的研究。
测定了甲氨基阿维菌素苯甲酸盐对意大利蜜蜂、日本鹌鹑、斑马鱼、家蚕、大型溞和赤子爱胜蚓6种非靶标生物的急性毒性。
5％甲氨基阿维菌素苯甲酸盐微乳剂对蜜蜂的急性经口LC50（48 h）为0．555 a．i．mg・ L-1，对鹌鹑的经口LD50（7 d）为148．369 a．i．mg・ kg-1，对斑马鱼的LC50（96 h）为0．368 a．i．mg・ L-1，对家蚕的急性摄入毒性LC50（96 h）为0．005 a．i．mg・ L-1，对大型溞的运动抑制毒性EC50（48 h）为0．020 a．i． mg ・ L-1，对蚯蚓的急性毒性LC50（14 d）为18．397 a．i．mg・ kg-1。
该农药对家蚕和大型溞均为剧毒，对蜜蜂和斑马鱼均为高毒，对鹌鹑中毒，对蚯蚓低毒。
总体而言，甲氨基阿维菌素苯甲酸盐微乳剂对环境生物危害大，在使用过程中要注意。
%Background Emamectin benzoate is a novel antibiotic insecticide and acaricide .Its extensive use may lead to serious ecological risks .It is necessary to evaluate its biological toxicity in relation to untargeted species .[Method]The acute toxicity of 5% emamectin benzoate on six representative untargeted species , i.e.honeybee ( Apis mellifera) , Japanese quail ( Coturnix japoni-ca) , zebra fish ( Danio rerio) , silkworm ( Bombyx mori) , Daphnia magna and earthworm ( Eisenia fetida) , was tested in laborato-ry.[Result]The results showed that the LC50(48 h) for acute oral toxicity (microemulsion) on bee was 0.555 a.i.mg・ L-1(high-lytoxic).The LD50(7 d) for quail was 148.369 a.i.mg・ kg-1(moderately toxic);the LC50(96 h) for zebra fish was 0.368 a.i. mg・ L-1;the LC50(96 h) for silkworm was 0.005 a.i.mg・ L-1(extremely toxic), the EC50(48 h) for Daphnia magna was 0.020 a.i.mg・ L-1(extremely toxic);and the LC50(14 d) for earthworm was 18.397 a.i.mg・ kg-1(weakly toxic).[Conclusion and significance]In general, the emamectin benzoate can be considered of high risk to untargeted organisms and should be used with caution .【期刊名称】《生物安全学报》【年(卷),期】2014(000)001【总页数】6页(P40-45)【关键词】甲氨基阿维菌素苯甲酸盐;环境生物;急性毒性【作者】游泳;林涛;李建宇;史梦竹;郑丽祯;傅建炜;魏辉【作者单位】福建省农业科学院植物保护研究所，福建福州350013;福建省农业科学院植物保护研究所，福建福州350013;福建省农业科学院植物保护研究所，福建福州350013;福建省农业科学院植物保护研究所，福建福州350013;福建省农业科学院植物保护研究所，福建福州350013;福建省农业科学院植物保护研究所，福建福州350013;福建省农业科学院植物保护研究所，福建福州350013【正文语种】中文甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(emamectin benzoate)，化学名称4′-脱氧-4-表甲氨基阿维菌素B1苯甲酸盐，是1984年美国Merk & C.公司(Demchak &Dybas,1997)对阿维菌素进行衍生化合成，1994年又经优化改进开发得到的半合成农药品种，是一种新型的抗生素类杀虫剂、杀螨剂。
3种农药对大型溞的急性毒性比较
3种农药对大型溞的急性毒性比较杨淞霖;尹晶;王会利;郭宝元【摘要】采用“半静态法”测定了3种农药及其混剂对大型溞的24 h、48 h急性毒性,根据我国《化学农药环境安全评价实验准则》中的毒性等级标准,它们对大型溞的毒性等级如下:精甲霜灵悬浮种衣剂对大型溞的24 h、48 h-EC50均大于10 a.i.mg·L-1,属“低毒”级,咯菌腈悬浮种衣剂对大型溞的24 h、48 h-EC50分别是0.339 mg·L-1、0.246 mg·L-1,根据0.1 a.i.mg· L-1 ＜EC50(48 h)≤1.0 a.i.mg·L-1判断,属“高毒”级.嘧菌酯水分散粒剂对大型溞的24 h、48 h-EC50分别是0.389 mg·L-1、0.286 mg·L-1,根据0.1a.i.mg· L-1 ＜EC50(48 h)≤1.0a.i.mg· L-1判断,属“高毒”级.精甲霜灵·咯菌腈·嘧菌酯悬浮种衣剂对大型溞的24 h、48 h-EC50分别是0.292 mg·L-1、0.228 mg.L-1,根据0.1 a.i.mg· L-1 ＜EC50(48 h)≤1.0 a.i.mg·L-1判断,属“高毒”级.精甲霜灵·咯菌腈·嘧菌酯悬浮种衣剂和嘧菌酯水分散粒剂都属“高毒”,但比较具体数值,发现精甲霜灵·咯菌腈·嘧菌酯悬浮种衣剂毒性相对更大,原因是其中还含有“高毒”的咯菌腈.%Semi-static method was applied to determine the 24 h,48 h-EC50 values of three pesticides and their compounds to Daphnia magna Straus.And according to experimental criteria for environmental safety evaluation of chemical pesticides in China,the 24 h and 48 h-ECs0 values of mefenoxam seed coating agent are both above 10 a.i.mg· L-1 so it is of lowtoxicity.Fludioxonil seed coating agent is highly toxic because its 24 h and 48 h-EC50 values are 0.339 mg· L-1 and 0.246 mg· L-1 according to the standard of 0.1 a.i.mg· L-1 ＜EC50(48 h)≤ 1.0 a.i.mg·L-1.Azoxystrobin water dispersible granule is of high toxicity because its 24 h and 48 h-EC50values are 0.389 mg·L-1 and 0.286 mg· L-1 according to the standard of 0.1 a.i.mg· L-1 ＜EC50(48 h) ≤ 1.0 a.i.mg· L-1.Mefenoxam-fludioxonil-azoxystrobin seed coating agent is of high toxicity because its 24 h and 48 h-ECs0 values are 0.292 mg· L-1 and 0.228 mg·L-1 according to the standard of 0.1 a.i.mg· L-1 ＜EC50(48 h)≤ 1.0 a.i.mg-L-1.Mefenoxam-fludioxonilazoxystrobin seed coating agent and azoxystrobin water dispersible granule are both of high toxicity.However,considering the EC50 values,mefenoxam-fludioxonil-azoxystrobin seed coating agent is more toxic because it contains fludioxonil besides azoxystrobin.【期刊名称】《生态毒理学报》【年(卷),期】2017(012)002【总页数】5页(P238-242)【关键词】农药;大型溞;急性毒性;半静态法【作者】杨淞霖;尹晶;王会利;郭宝元【作者单位】中国科学院生态环境研究中心中国科学院环境生物技术重点实验室,北京100085;中国科学院大学,北京100049;中国科学院生态环境研究中心中国科学院环境生物技术重点实验室,北京100085;中国科学院大学,北京100049;中国科学院生态环境研究中心中国科学院环境生物技术重点实验室,北京100085;中国科学院大学,北京100049;中国科学院生态环境研究中心中国科学院环境生物技术重点实验室,北京100085;中国科学院大学,北京100049【正文语种】中文【中图分类】X171.5自20世纪40年代以来，农药工业蓬勃发展，一方面提高了农产品产量和质量，另一方面化学农药的不规范使用在全球范围内也带来了一系列残留和污染问题[1]。
5种药剂对大型溞的急性活动抑制毒性研究
5种药剂对大型溞的急性活动抑制毒性研究马德君;冯磊;蒋红云;李传仁;张燕宁;何伟志;张兰【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2012(040)017【摘要】[目的]比较5种药剂对大型溞(Daphnia magna Straus)的急性活动抑制毒性.[方法]测定了5种药剂对大型溞的急性活动抑制中浓度EC50,并评价了5种药剂对大型溞的毒性.[结果]5种药剂对大型溞的毒性大小表现为:20％甲氰菊酯水乳剂(EC50=0.002 8a.i.mg/L)＞ 10％高效氯氟氰菊酯可湿性粉剂(EC50=0.008 9 a.i.mg/L) ＞7.5％鱼藤酮乳油(EC50=0.189 9 a.i.mg/L)＞7.5％除虫菊素水乳剂( EC50=0.202 0 a.i.mg/L) ＞0.5％大黄素甲醚水剂(EC50=0.640 1 a.i.mg/L).[结论]为大型溞应用于环境污染监测研究提供了理论依据.【总页数】2页(P9331,9366)【作者】马德君;冯磊;蒋红云;李传仁;张燕宁;何伟志;张兰【作者单位】长江大学农学院,湖北荆州434025;中国农业科学院植物保护研究所,农业部作物有害生物综合治理综合性重点实验室,北京100193;中国农业科学院植物保护研究所,农业部作物有害生物综合治理综合性重点实验室,北京100193;长江大学农学院,湖北荆州434025;中国农业科学院植物保护研究所,农业部作物有害生物综合治理综合性重点实验室,北京100193;中国农业科学院植物保护研究所,农业部作物有害生物综合治理综合性重点实验室,北京100193;中国农业科学院植物保护研究所,农业部作物有害生物综合治理综合性重点实验室,北京100193【正文语种】中文【中图分类】S481+.9【相关文献】1.不同磷脂组成的莪术油包合物脂质体的药剂学性质与急性毒性研究 [J], 陈军;程娜娜;陆兔林;陈志鹏;严书霞;蔡宝昌2.防治黏虫药剂对日本鹌鹑的急性毒性研究 [J], 张燕宁;唐敬新;张兰;毛连纲;冯磊;蒋红云3.农药助剂和实验室常用有机溶剂对大型溞的室内急性毒性研究 [J], 宋伟华;刘茜;张燕;姜辉;林荣华4.4种新烟碱类杀虫剂对大型溞的急性活动抑制 [J], 邓丽;张兰;张燕宁;何伟志;冯磊;蒋红云5.微塑料对大型溞的急性毒性研究 [J], 李勤;李尚谕;熊雄;张榜军;刘洋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大型水蚤测试标准方法
大型水蚤测试标准方法本标准部分参照国际标准ISO6341：1982《水质——大型水蚤(甲壳纲、枝角目)活动抑制的测定》(UDC 617.777：576.097.2)及美国标准法“水和废水标准检验法”804B.水蚤(Daphnia)的生物检测步骤。
1 主题内容与适用范围本标准规定了大型水蚤生物测试技术中生存及运动影响(急性试验)和生长及繁殖试验方法(慢性效应)。
本标准适用于评价可溶性化学物质的毒性；评价工业废水及工业固体废物浸出液的综合毒性；评价废水处理效果；也适用于地面水、地下水的毒性评价及水中沉积物的毒性评价。
2 方法原理2.1 测定初始浓度EC50值，此浓度是指在本标准规定的条件下，24h及48h内使50%暴露在试验液中的大型水蚤失去活动能力的浓度，并指出使所有实验水蚤失去活动能力的最低浓度，及不能使任何实验水蚤丧失活动能力的最高浓度。
2.2 测定初始浓度LC50值，此浓度是在本标准规定的条件下24h及48h内使50%暴露在试验液中的大型水蚤心脏停止跳动能力的浓度，并指出使所有大型水蚤死亡的最低浓度及不引起死亡的最高浓度。
2.3 测定生长曲线，不同浓度下实验水蚤生长的速度不同，其生长曲线也不同，与对照组生长曲线比较判断其生长影响。
2.4 测定生殖量，相同条件的实验水蚤在不同浓度实验液中由于毒性作用，其每胎生出的幼水蚤数量不同，与对照组比较判断其毒性。
3 试剂和材料3.1 试验生物采用大型水蚤(Daphnia magna straus)62Dm纯品系生物株，为同龄同母体后代。
EC50及LC50试验用1龄～3龄水蚤，每容器10个，平行2～3组；繁殖及生长试验用刚出生的幼水蚤，每浓度组5～6个水蚤。
3.2稀释水可采用未被有毒物质污染的天然水(地面水或地下水)及自来水(自然暴气的)，pH值为7～8.6，溶解氧4mg/L以上，或空气饱和氧的60%以上，水的硬度为250±22mg/L(以CaCO3表示)，也可用符合上述条件的人工配制水。
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采用生长面积法( 国家环保局, 2002) 计算96h EC50 , 计算公式如下:A =( N1 - N0) /2 ×t1 +( N1 + N2 - 2N0) /2 × ( t2 - t1) + … +( Nn- 1 + Nn - 2N0) /2 × ( tn - tn- 1)(1)其中: A: 生长曲线以下面积; tn : 实验开始后第n 次计数时间; N0 : 初始细胞密度; Nn : tn 时刻细胞密度.生长抑制率( IA) 通过以下公式计算:IA =( Ac - At) /Ac ( 2)IA: 受试组与对照组相比细胞生长抑制率; Ac :对照组生长曲线以下面积; At : 受试组浓度生长曲线以下面积.以IA 为纵坐标, 浓度对数为横坐标作图, IA =50%所对应的浓度即为EC50 值相对抑制率= (1 - NΠN0 ) ×100 % ,其中N 为试验组的藻密度; N0 为对照组的藻密度土壤提取液)配置方法取花园土未施过肥0。
5kg置于烧杯或三角瓶中，加入蒸馏水1000毫升，瓶口用透气塞封口，在水浴中沸水加热2小时，冷却数小时，在无菌条件下过滤，取上清液，将灭菌蒸馏水加入上清液至总体积1000毫升。
土壤提取液保存在4ºC备用。
在蒸馏过后只能使用过滤的方法灭菌，不能经过高压高温灭菌水质物质对蚤类（大型蚤）急性毒性测定方法GB/T13266-91本标准参照采用国际标准ISO 6341—1982《水质——大型蚤运动抑制的测定》。
本标准用大型蚤（Daphnia magna straus（Cladocera Crustacea））为试验生物。
测定物质或废水的半数抑制浓度，半数致死浓度（24h-EC50、24h-LC50或48h-EC50、48h－LC50），用于判断物质或废水的毒性程度。
1 适用范围本标准适用于以下范围；a.在试验条件下可溶的化学物质（包括工业原料和产品、食品添加剂、农药、医药等）。
b.工业废水。
C.生活污水。
d.地表水、地下水。
2 原理2.1 24h－EC50、48h－EC50指在24或48 h内百分之五十的受试蚤运动受抑制时被测物的浓度。
2.2 运动受抑制（Immobilization）反复转动试验容器，15s之内失去活动能力的大型蚤，被认为运动受抑制。
即使其触角仍能活动，也应算做不活动的个体。
2.3 24h－LC50、40h－LC50指在24或48h内百分之五十的受试蚤死亡时被测物的浓度，以受试蚤心脏停止跳动为其死亡标志。
3 试验材料3.1试验生物为大型蚤（（Daphnia magna straus）（甲壳纲，枝尼亚目））。
保持良好的培养条件，使大型蚤的繁殖被约束在孤雌生殖的状态下（见附录A）。
选用实验室条件下培养3代以上的、出生6～24 h的幼蚤为试验蚤。
试验蚤应是同一母体的后代。
3.2试验用水：3.2.1配制人工稀释水为试验用水。
新配制的标准稀释水PH为7.8±O.2，硬度250±25 mg ／L（以CaCO3计）Ca／Mg巴比例接近4:1，溶解氧浓度在空气饱和值的80％以上，并不含有任何对大型蚤有毒的物质。
人工稀释水用电导率10 µs／cm（lms／m）以下的蒸馏水或去离子水（以下简称水）按下述方法配制。
a.氯化钙溶液将11.76g氯化钙（CaC12·2H2O）溶于水中稀释至1L。
b.硫酸镁溶液将4.93g硫酸镁（MgSO4·7H2O）溶于水中稀释至1L。
c.碳酸氢钠溶液将2.59 g碳酸氢钠（NaHCO3）溶于水中稀释至1L。
d.氯化钾溶液将0.25g氧化钾（KCI）溶于水中稀释至1L。
各取以上四种溶液25mL混合，稀释至1L。
必要时可用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH值，使其稳定在7.8±0.2。
标准稀释水应容许大型蚤在其中生存至少48h，并尽可能检查稀释水中不含有何已知的对大型蚤有毒的物质。
例如：氯、重金属、农药、氨或多氯联苯。
3.2.2如果所进行的试验需要使用其他稀释水或改变稀释水的PH，应在试验报告中往明所用的性质。
要求稀释水的硬度在150～300 mg／L（以CaCO3计）范田内，Ca／Mg比例接近4:于6.5或不得高于8.5，同一试验PH波动pH波动不得大于0.5。
3.3 重铬酸钾（K2Cr2O7），分析纯。
4 试验液的制备4.1 试验物质溶液的配制4.1.1 试验物质可以是可溶于水的固体、液体或气体，但要求组分一定，具有代表性、重复性。
4.1.2 易溶于水的试验物质可直接加到稀释水里，也可以溶解在蒸馏水或去离子水中配成贮备液加人到稀释水中配成试验液，每升稀释水中的贮备液要少于10mL。
贮备液应当低温保存。
4.1.3 难溶于水的物质，可用适当的方法，将其溶解和分散.包括使用超声波装置及其他低毒溶剂增溶。
如果使用溶剂，溶剂在试验液中的浓度不应超过0.5mg／L，并应在试验的同时设两个对照组，一组用稀释水，另一组用最大浓度的溶剂。
4.2 工业废水试验液的制备4.2.1 样品的采集及处理：采集废水样品时，应将采样瓶充满水样，不留空气。
作品采集后应立即进行试验。
如果样品采集后6h之内不能进行试验，则必需将水样冷冻保存（0～4℃），并应尽可能缩短水样在试验前保存的时间。
4.2.2生产流程用水不稳定的工业废水，应在24h之内，每隔6h瞬时采样一次，分别测定每个求得其最大毒性。
4.2.3 废水样品可以用稀释水稀释配成不同浓度的试验液。
5.试验容器和仪器5.1 试验容器可采用100 mL小烧杯或结晶皿等玻璃制品，加盖表面皿。
为防止被玻璃器的吸附，试验前可用低浓度试验溶液浸泡一天。
试验结束后立即用空容器，刷洗、消除任何微量的溶液。
5.2 量简、容量瓶、移液管、吸管、玻璃缸、尼龙筛网等器皿5.3 溶解氧测定仪、pH计、温度计、电导仪。
6 环境条件6.1 试验温度要求基本稳定，变化不超过±1℃。
试验前的培养温度要求与试验温度基本一致。
毒性试验在20±1℃或25±1℃下进行。
6.2 实验在没有对大型蚤有害的气体、粉尘的大气条件下进行。
6.3 试验在自然光照或相当于自然光照下进行(避免阳光直射)每天光照10h左右。
6.4 大型蚤在试验前应与试验条件一致的环境中驯养7～10d。
6.5 试验操作及试验过程中蚤类不能离开水，转移时要用玻璃滴管。
7 预试验7.1 正式试验之前，为确定试验浓度范围，必须先进行预备试验。
预备试验浓度间距可宽一些(如0.1、1、10)每个浓度至少放5个幼蚤，通过预试验找出被测物使100％大型蚤运动受抑制的浓度和最大耐受浓度的范围，然后在此范围内设计出正式试验各组的浓度。
7.2 预试验中应了解毒物的稳定性，在标准稀释水中是否会出现沉淀、pH等理化性质的改变。
以便确定正式试验是否需要采取流水或更换试验液及改变稀释水pH等措施。
8 正式试验8.1 试验浓度的设计，根据预试验的结果确定正式试验的浓度范围，按几何级数的浓度系列(等比级数间距)设计5～7个浓度(如1、2、4、8、16等比级系数为2；又如1、1.8、3.2、5.6、10等比级数系数为1.778)。
试验浓度要设计合理，浓度系列中以能出现一个60％左右和40％左右大型蚤运动受抑制或死亡的浓度最为理想。
8.2 试验用100mL烧杯(或结晶皿)，装40～50mL试验液，置蚤10个。
每个浓度至少有2～3个平行。
一组试验液设一空白对照，内装相等体积的稀释水。
试验前要用化学方法测定试验液的初始浓度。
8.3 试验开始后应于1、2、4、8、16及24h定期进行观察，记录每个容器中仍能活动的水蚤数，测定0～100％大型蚤不活动或死亡的浓度范围，并记录它们任何不正常的行为。
在计算试验蚤的不活动或死亡的百分数之后，立即测定试验液的溶解氧浓度。
8.4 检查大型蚤的敏感性及试验操作步骤的统一性，定期测定重铬酸钾的24h-EC50，目的是验证大型蚤的敏感性。
在试验报告中报告24h-EC50。
重铬酸钾的24h-EC50为0.5～1.2ppm(20℃条件下)。
按照第8章所叙述的步骤进行验证检查，如果重铬酸钾的24h-EC50在0.5～1.2ppm以外，则应检查使用试验步骤是否严格，并检查大型蚤的培养方式。
如有必要，使用新的符合敏感要求的大型蚤品种。
9 数据结果的处理及有效性9.1 EC50(LC50)的估算试验结束，计算每个浓度中不活动的大型蚤或死亡蚤占试验总数的百分比，用概率单位目测法，计算EC50(或LC50)(见附录C)。
也可用计算机EC50(或LC50)程序处理(寇氏修正法)，获得EC50(或LC50)。
9.2 结果的表示以24h-EC50或48h-EC50表示物质在相应时间内对大型蚤运动受抑制的影响。
以24h-LC50或48h-EC50表示物质在相应时间内对大型蚤生存的影响。
当浓度间距过近仍不能获得足够数据时，可采用使100％大型蚤活动受抑制或心脏停止跳动的最低浓度和使0％大型蚤活动受抑制或心脏停止跳动的最高浓度来表示毒性影响的结果。
检测排水时，以百分数或毫升／升表示。
捡测化学物质时，以毫克／升表示。
9.3试验结果的有效性符合下列条件的试验为结果有效。
a.对照组试验未出现不活动大型蚤。
b.重铬酸钾的24h-EC50在20℃时为8.5～1.2ppm的范围内。
c.试验结束时溶解氧浓度必须大于或等于2mg／L。
d.必须经检测证明被测定的试验物质浓度保持于试验全过程(至少应为计划配制浓度的80％)。
如果浓度偏差＞20％，应以测试浓度结果为准。
10 试验报告试验报告要求包括以下几个方面：a.实验蚤的种名、来源、数目、蚤龄、饵料、驯养时间，对照组是否发生死亡。
b.被测物质的化学性质、来源、样品的保存方法、保存时间及前处理方法。
c.实验用稀释水的性质。
d.试验环境、水温、pH、DO、电导等情况。
e.试验条件下大型蚤的任何不正常行为，包括中毒症状。
f.实验结果、数据处理、结论、讨论。
g.方法依据及参考文献。
附录A 大型蚤的培养繁殖方法(补充件)A1 试验蚤的选育试验蚤(Daphnia magna)可以从其他试验室已有的纯培养中挑取、引种，也可以从野外采集。
野外采集的蚤要经分离、纯化，在显微镜下鉴定后，选择体大、健康的母体数个，用50mL 小烧杯单个培养。
选择繁殖量最大的一代为母蚤，单克隆化，使之成为纯品系。
A2 饵料雌性的大型蚤可以在20℃生存4个月之久。
蚤类喜食藻类、细菌、酵母及有机物碎屑等。
藻类的营养价值高于其他食物，本方法推荐用实验室培养的栅藻为大型蚤的饵料。
栅藻的培养方法见附录B。
A3 容器单个培养母蚤可用50mL小烧杯，繁殖培养用2000mL大烧杯，储备培养用30cm×30cm圆玻璃缸，或类似大小的水簇箱。