Western blot 之蛋白提取
生物医学实验入门（7）：WesternBlotting（1）蛋白提取
生物医学实验入门（7）：WesternBlotting（1）蛋白提取上一讲呢，本侠给大家介绍了大名鼎鼎的PCR，这一讲开始本侠将要给大家介绍另一项同样大名鼎鼎的实验技术，那就是WesternBlotting（蛋白质印迹法，后面简称WB）。
上回说PCR的时候，本侠说过，PCR是用来检测某分子在基因水平的表达情况的，当时本侠还说到了，在一般情况下，我们还需要同时检测该分子在蛋白水平的表达。
今天本侠要讲的WB就是用来检测蛋白表达的最常用方法，当然喽，之一。
WB的基本原理如果我们想知道细胞里面有没有表达某种蛋白，用眼睛看，看不到；用耳朵听，听不到；用手摸，也没法儿摸……桑脑筋没关系，你没办法触及蛋白，有一种东西可以，那就是抗体！所以WB 检测蛋白的过程说白了就是利用抗体识别蛋白的过程，这就是WB的原理基础。
不仅如此，这也是免疫组织化学（多数情况下）以及流式细胞术（也是多数情况下）的原理基础。
具体来说，WB是将细胞中的大量蛋白分离后，先利用一种载体（如一张膜）抓住蛋白，然后用能与该蛋白特异结合的抗体识别蛋白（这种特性性抗体我们习惯叫做“一抗”，不带任何标记，即抗体上没有酶也没有荧光），接着再用带有标记的抗体（我们习惯叫“二抗”）识别一抗。
这样一来，三个小盆友手拉手，蛋白拉着一抗，一抗拉着二抗，所以如果我们有办法检测到二抗，就意味着我们能检测到蛋白了。
童鞋们别忘了刚刚本侠说过，二抗是带有标记的，这个标记就是用来让蛋白“现形”的法宝。
WB中的二抗所带的标记叫做辣根过氧化物酶（HRP），让蛋白“现形”的时候，只要将HRP的底物与HRP进行反应即可。
WB的操作步骤那么WB究竟如何具体操作呢？总的来说，分为五步：蛋白提取、蛋白电泳、转膜、抗体孵育、显色。
具体点地说就是先从组织/细胞中将总蛋白（我们要检测的蛋白就在其中）提取出来，然后通过电泳的方法将总蛋白按分子量的大小进行分离（以便抗体识别蛋白），接着把分离好的蛋白从上步电泳中的胶上转移到便于抗体识别蛋白的载体上，这个载体就是一种薄膜。
Westernblot实验操作步骤
Western blot实验步骤一、制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取）1.倒掉细胞培养液,加3ml预冷的PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉PBS后将细胞培养瓶置于冰上。
2.裂解液RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1),两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。
3.裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧（动作要快），转移至ep管中.4.4度，12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中，用于后续实验（-80保存）常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷PBS洗涤细胞2次，弃去，再加入1ml PBS，用细胞刮轻轻刮取细胞，转移至1.5ml ep管中，12000rpm，离心5min，尽量吸净上清，沉淀于-80保存，用于后续实验。
融化蛋白样品，加入RIPA+PMSF细胞裂解液（200ul/ep管），充分混匀，冰上裂解20min，4度离心，5min ，12000rpm，小心吸取上清至新的ep管中。
二、蛋白浓度测定(BCA法)BCA(碧云天)蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul。
在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。
标准蛋白BSA浓度：5mg/ml (-20保存) ,完全溶解蛋白标准品，取10ul稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml(ug/ul)。
蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。
但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。
1. 配置BCA工作液A液： B液= 50 : 1 ，混匀 A液+B液=200ul (每个样本)样本数量： 7个标准品 + N 个待测蛋白样本2. 先将每孔加入200ul BCA工作液，再加入蛋白样本。
（96孔板）,总体积为10ul.待测蛋白样本先10倍稀释。
3.37度，温箱中孵育30min。
WB实验组织总蛋白提取方法
WB实验组织总蛋白提取方法总蛋白提取是生物学实验中常用的一种方法，主要用于从细胞或组织中提取所有蛋白质。
提取总蛋白的目的是为了进一步分析蛋白质的功能和结构，例如Western blot分析等。
下面是一种常用的总蛋白提取方法。
实验材料和试剂：1.已培养的细胞或组织样品2. RIPA裂解液：含有非离子界面活性剂（Tween-20或Triton X-100）、蛋白酶抑制剂（如苯甲砜）和磷酸酯酶抑制剂（如磷酸酯酶）3.低温高速离心管4.超声波细胞破碎仪或机械研磨器5.10%SDS-凝胶电泳试剂6.蛋白加载缓冲液7.高压电泳设备实验步骤：1.将细胞样品从培养皿中用PBS缓冲液洗涤一次，用PBS轻轻冲洗组织样品。
2.吸去PBS缓冲液，加入足够的RIPA裂解液使细胞或组织完全浸没。
注意：RIPA裂解液的加入量需根据样品的大小进行调整。
3.将细胞或组织样品转移到低温高速离心管中。
4.使用超声波仪器或机械研磨器对样品进行破碎。
这一步旨在使细胞或组织的细胞膜破裂，释放出胞浆中的蛋白质。
5.离心样品以除去细胞碎片和细胞核等大颗粒。
将离心管置于低温离心机中进行离心，离心条件需根据实验需要进行调整。
6. 将上清液转移至新的离心管中，得到总蛋白提取物。
可以根据需要进行蛋白质浓度的测定，常用的方法有BCA法、Lowry法等。
7.将总蛋白提取物加入相应的蛋白加载缓冲液，并在沸水中加热变性。
8.蛋白质经过热变性后，将其进行SDS-凝胶电泳分离。
9. 将凝胶中的蛋白质转移到PVDF或NC膜上，通过Western blot分析来检测目标蛋白质。
总蛋白提取方法的关键是裂解液的配方和破碎细胞或组织的方式。
裂解液中的各种成分旨在破坏细胞膜、解离蛋白质和保护蛋白质不被降解。
破碎细胞或组织的方式可以选择超声波破碎、机械研磨或冷冻-解冻法等。
总蛋白提取方法的优化可根据实验需要进行调整。
例如，在一些情况下，可以添加磷酸酯酶抑制剂、蛋白酶抑制剂或还原剂等成分来保护蛋白质的完整性。
Westernblot提取蛋白时...
Westernblot提取蛋白时...做Western blot的小伙伴都清楚，我们提取蛋白要加各种蛋白酶或磷酸酶抑制剂，这些酶的作用和发挥作用最佳浓度你真的了解吗？下面给大家一一盘点下。
DTT：二硫苏糖醇，一种很强的还原剂，易被空气氧化，稳定性较差；但冷冻保存或在惰性气体中处理能够延长它的使用寿命[1]。
蛋白质二硫键（又称S−S键，由2个巯基-SH被氧化而形成）常作为活性中心发挥作用，是保持空间结构的重要官能团。
为了确定蛋白质的一级结构，DTT可以将cys上的二硫键打开，使之成为线状多肽链，这样也便于抗体识别并结合特定的位点[2]。
对于包埋于蛋白质结构内部的二硫键，DTT通常作用较弱，这类二硫键的还原需先将蛋白质变性（高温加热或加入变性剂，如盐酸胍、尿素或SDS）[3]。
DTT在离子状态下才有作用，pH7-9.5时作用最强，pH降至3以下可终止其作用。
PCR反应体系中加入DTT可以使蛋白质从DNA上释放出来，便于DNA和引物的结合，提高扩增效率。
使用浓度：DTT浓度太低起不到保护作用，浓度太高又会破坏结构。
建议在0.5mM~1.5mM之间。
有的抗体说明书会给出目的蛋白的最佳使用浓度。
PMSF：苯甲基磺酰氟。
是一种丝氨酸蛋白酶不可逆抑制剂。
难溶于水，且在水溶液中非常不稳定，容易分解，30min就会降解一半，因此提取蛋白时每一步都要加入新鲜的PMSF，样品处理超过1h，补加一次。
PMSF可溶于异丙醇、乙醇、甲醇、二甲苯和石油醚。
有剧毒和腐蚀性。
可抑制丝氨酸蛋白酶（胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶），也可抑制半胱氨酸蛋白酶和乙酰胆碱酯酶[1]。
室温下可保存一年。
使用浓度：0.1~1mMNaF氟化钠：溶于水（溶解度10°C 3.66、20°C 4.06、30°C 4.22、40°C 4.4、60°C 4.68、80°C 4.89、100°C5.08）、氢氟酸，微溶于醇，有毒[1]。
westernblot原理及过程
westernblot原理及过程
1、Western Blot的原理是：蛋白质是带电的，在聚丙烯酰胺凝胶中通过SDS-PAGE分离蛋白质后，蛋白质被固定在凝胶中。
当凝胶被转移到支持物（例如NC膜或PVDF膜）上时，蛋白质在膜上保留其电荷。
通过针对特定氨基酸序列的特异性抗体作为探针检测蛋白质的位置。
这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析。
2、Western Blot的过程大致分为以下几步：
蛋白提取：从细胞或组织中提取总蛋白质混合物。
蛋白定量：确定凝胶中蛋白质的浓度。
SDS-PAGE电泳：通过SDS-PAGE分离蛋白质混合物。
电转印：将分离的蛋白质从凝胶转移到支持物（例如NC膜或PVDF 膜）上。
封闭：用含有去污剂和牛血清白蛋白的溶液处理膜，以封闭膜上的任何未结合位点。
抗原-抗体免疫反应：使用特异性抗体检测目标蛋白质的位置。
蛋白检测：使用化学发光剂检测膜上的目标蛋白质。
WB操作步骤-自己整理
Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法）人工肝实验室学习姚瑶（一）目的蛋白提取：（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。
2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。
共洗三次，每次十分钟。
3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。
4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。
（可不做）5、4℃，12000转离心10min。
6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。
（2）组织中总蛋白的提取：1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。
冰上裂解30min。
2、配平后，4℃，14000转离心10min。
3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定：1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。
2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。
3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。
4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。
5、37℃水浴30min。
6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。
7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。
（三）SDS-PAGE电泳：（1）清洗玻璃板（2）灌胶与上样：1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。
western blot蛋白样品制备原理
Western blot是一种常用的蛋白质分析方法，它可以用于检测特定蛋白质在样品中的存在和数量。
Western blot的实验流程包括样品制备、电泳分离、转膜和蛋白质检测。
其中，样品制备是整个实验的关键步骤之一，下面就让我们来详细了解一下Westernblot蛋白样品制备原理。
一、样品的选择在进行Western blot实验前，首先需要选择合适的样品。
一般来说，样品可以是细胞、组织或者体液等。
在选择样品时，需要考虑到样品来源、样品数量和样品纯度等因素。
如果样品来源不同，那么制备样品的方法也会有所不同。
例如，对于细胞和组织样品，可以通过细胞裂解和组织切片等方法来制备样品；对于体液样品，可以通过离心等方法来制备样品。
二、蛋白的提取在样品制备的过程中，需要将目标蛋白从样品中提取出来。
蛋白的提取方法有很多种，其中比较常用的方法包括化学法、机械法和生物学法等。
化学法包括使用洗涤剂、有机溶剂、酸碱等物质来破坏细胞膜，从而释放蛋白质。
机械法包括使用超声波、研钵等工具来破坏细胞膜，从而释放蛋白质。
生物学法则是利用生物学技术，如细胞裂解酶等，来破坏细胞膜，从而释放蛋白质。
三、蛋白的分离在蛋白提取后，需要将蛋白进行分离，以便进行后续的Western blot实验。
蛋白的分离方法有很多种，其中比较常用的方法包括凝胶电泳和液相色谱等。
凝胶电泳是一种将蛋白质按照其分子量大小进行分离的方法，常用的凝胶有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。
液相色谱则是一种将蛋白质按照其化学性质进行分离的方法，常用的液相色谱有离子交换色谱和逆相色谱等。
四、蛋白的转膜在蛋白分离后，需要将蛋白转移到膜上进行Western blot检测。
转膜的方法有很多种，其中比较常用的方法包括湿式转膜和干式转膜等。
湿式转膜是将蛋白质通过电泳转移到膜上的方法，需要使用电泳缓冲液和转膜装置等。
干式转膜则是将蛋白质通过电泳转移到膜上的方法，需要使用转膜装置和干燥器等。
五、蛋白的检测在蛋白转膜后，需要进行Western blot检测。
蛋白提取及Western blot 原理及步骤
蛋白质提取原理：使用机械法破坏细胞膜，将细胞内的蛋白质释放到溶液中，然后通过离心或过滤的方法去除细胞碎片、细胞核和细胞碎片等杂质，以得到较为纯净的蛋白质上清液→通过加入盐或有机溶剂等物质，使蛋白质发生沉淀，然后通过离心将沉淀的蛋白质分离出来→通过柱层析、电泳、凝胶过滤等方法进一步纯化蛋白质，去除其他蛋白质、核酸、小分子物质等杂质，使目标蛋白质得到更高纯度。
方法：组织液氮冷冻，研磨成粉末状→加入适量蛋白提取液，冰上放置20 min→4℃，12000 rpm离心10 min→吸上清，在通风橱加入5×Loading Buffer，99 ℃加热10 min，冰上冷却用于Western bolt 或-20℃保存。
5×Loading Buffer配方：①Tris-HCl (250 mM)：Tris-HCl 是一种缓冲盐，用于维持溶液的酸碱平衡，常用于蛋白质提取过程中调节pH 值的作用；②SDS (10%)：SDS （十二烷基硫酸钠）是一种离子型表面活性剂，具有溶解蛋白质和破坏细胞膜的作用，常用于蛋白质提取和电泳分析中；③BPB (0.5%)：BPB（溴酚蓝）是一种染色剂，常用于帮助观察蛋白质电泳分析结果，以检测样品前进方向和监测蛋白质迁移速度；④甘油(50%)：甘油是一种保护剂，可以增加蛋白质提取液的粘度和稳定性，有利于蛋白质的溶解和保存；⑤β-巯基乙醇(5%)：β-巯基乙醇（巯基乙醇）是一种还原剂，可以断裂蛋白质之间的二硫键，有助于蛋白质的还原和解聚。
Western bolt原理及步骤原理：Western Blot是一种常用的蛋白质检测技术，它能够检测复杂蛋白混合物中的某个蛋白的存在，还可以确定其大致分子量，检测其表达水平变化等。
WB以组织或细胞中的蛋白质为研究对象，经过SDS-PAGE分离蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
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Western blot 之蛋白提取（protocol）
一、蛋白提取准备：
冰浴盒、冰、小烧杯、EP管（1.5ml）、小镊子、RIPA裂
解液（4℃保存，试剂盒中含PMSF，-20℃保存）、蛋白
酶抑制剂（protease inhibitor tablets）、磷酸酶抑制剂
（phosphatase Inhibitor cocktail 3）、15ml离心管(裂解
液)、移液器、超声粉碎机、低温高速离心机、BCA蛋白
定量试剂盒、96孔板、酶标仪、4×蛋白上样缓冲液（分
装1ml/管，-20℃保存）、
二、蛋白提取操作：
1. -80℃取出组织，冰上复温；由冻存管移入1.5mlEP
管，并重新编号；（1、2、3、4、5、6分别为sham、3h、12h、24h、3d、7d）
2. 加裂解液;
a、裂解液配制：(10mlRIPA（4℃）+100ulPMSF（-20℃）
+100ul蛋白酶抑制剂（4℃ 10×、1×）+1-2ul磷酸酶抑
制剂)
注：磷酸酶抑制剂作用是保护已磷酸化蛋白，避免其降解破坏，所以加
之有益无害。
b、加入EP管，1mg：10-20ul；（400ul/EP管，不要求
精确）
3. 匀浆；机械（电动匀浆机）；
超声粉碎机√
附：超声粉碎机操作：a、打开电源；
b、确认设置；（默认）
c、蒸馏水清洗机头；（每次换样本均要清洗、避
免污染、并擦干）
d、匀浆；（电源键控制机头启停，装有标
本的1.5mlEP管置入小烧杯冰浴中，匀浆过程反复上下活动，充分匀浆组织）
4. 冰浴静置30分钟；（再加裂解液600ul至总量
1000ul；）
5. 预开机制冷，12000rpm，4℃，离心20分钟；离心
结束后，取上清至新1.5mlEP管；
附：低温高速离心机操作：a、开机；
b、设置speed、time、temp，注意ROTOR
内外对应；12154（1.5ml或2mlEP管）
c、温度降至预设温度后，配平，开始；
6. BCA试剂盒蛋白定量
a．配制工作液；BCA试剂：CU试剂=50:1
（5mlBCA+100ulCU）；（标准品数量+样品数量）×200ul；充分混匀，24小时室温稳定；
b．各孔加BCA工作液200ul；
c、稀释标准品；（0.5mlEP管）
①90ulPBS稀释液+10ulBSA标准品（-20℃），至100ul，浓度0.5mg/ml；
②加稀释后的标准品至96微孔板标准孔中：
20、16、12、 8、 6、 4、 2、 0 ul
加PBS补足至20ul：
0、 4、 8、12、14、16、18、20 ul
实际浓度：
0.5、0.4、0.3、0.2、0.15、0.1、0.05、0mg/ml
d、样品稀释；（0.5mlEP管）（尽可能让样品点落在标准线1/2后）,样品量不能少于2ul，否则误差太大。
78ul裂解液+2ul样品=40倍稀释
38ul裂解液+2ul样品=20倍稀释
加20ul样品到96孔板的样品孔中。
e、37℃孵育30分钟；（包薄膜防止水分蒸发影响检测结果）
f、酶标仪A562nm测定，绘制标准曲线，计算蛋白浓度；
附：酶标仪操作：a、打开电脑主机及酶标仪主机；
b、打开softmaxpro软件；
c、open drawer置入96孔板，close；
d、settings：A562nm、96孔、area，Ok；
e、read；将数据直接复制至excel中；
excel中操作：a、新建excel工作表，粘贴数据；
b、标准品后插入列，输入标准品品对应浓度值，同时选中吸光度值及浓度值，插入----散点图，在任意一散点上点右键，添加趋势线，（选中公式、卡方值），卡方值常在99%以上。
c、待测样品吸光度值后插入列，将上面得到的公式插入，得到样品浓度值，均×40得实际浓度值；上样浓度预调整至2ug/ul，按每凝胶上样孔40ug/20ul×10计算，总上样量200ul，4×buffer=200ul/4=50ul，
样品：4×buffer=3:1，加样量+裂解液=150ul；加样量=400u/样品浓度，裂
解液=150ul-加样量；从而得出调整后加样量及裂解液量；
7、调整加样量；按BCA蛋白测定后调整的加样量+裂解液量+4×buffer 50ul 加入EP管；
8、 100℃水浴加热、煮沸变性5-10min(Thermo shaker)；注：煮沸变性过程中会有样品溢出现象，EP管中样品若超过1ml，需先分装；离心(普通离心机，说明书上10000-14000rpm离心
2-5分钟)，取上清，50ul/管分装，-80℃保存或直接上样；。