褐藻羊栖菜水通道蛋白基因SFLIP的克隆及其在淡水浸泡下的表达分析
羊栖菜多糖的化学修饰及生物活性研究
羊栖菜多糖的化学修饰及生物活性研究羊栖菜是褐藻中的一种,广泛分布于中国、韩国、日本,作为治疗剂使用已有千年历史。
从羊栖菜中提取的多糖具有多种功能,如抗肿瘤、抗弧菌病、增强免疫力和抗高血脂等。
国内外有关研究表明,多糖的生物活性与多糖的分子量、空间结构、以及取代基种类、数目和位置有关。
羊栖菜多糖已阐明具有的抗氧化、抗菌、抑制酪氨酸活性均较低,难以满足需求,且羊栖菜多糖化学修饰大多集中在硫化和硒化。
为进一步提高多糖的抗氧化活性、酪氨酸酶抑制活性和抑菌活性,本文将羊栖菜多糖先降解,再制备其羧甲基化和异羟肟酸化衍生物,并研究他们的抗氧化活性、酪氨酸酶抑制作用和抑菌活性。
主要研究结果如下:1.用热水浸提法从羊栖菜中提取粗多糖(PSF),并用H2O2-Vc联合法对其进行降解得到降解多糖,对降解条件进行响应面优化,结果显示最佳工艺条件为:过氧化氢(H2O2)和维生素C(Vc)为17.26 mM,降解温度51℃,降解时间1.6h。
2.采用氯乙酸对在优化条件下得到的降解多糖(DPSF)进行羧甲基化修饰,得到的羧甲基衍生物(CDPSF),在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)存在下与羟胺偶联,得到多糖的异羟肟酸衍生物(HCDPSF)。
对降解前后多糖的化学组分分析,结果表明各组分相差不大。
HPGPC测得其降解前后的分子量分别为987、407 kDa。
GC-MS分析结果表明PSF、DPSF和CDPSF的单糖组成均主要为岩藻糖和半乳糖,以及少量的甘露糖、木糖和葡萄糖。
IR、1H NMR和13C NMR结果表明羧甲基化和异羟肟化修饰成功。
3.通过 PSF、DPSF、CDPSF、HCDPSF-2 对自由基(DPPH、·OH、O2-·)清除活性及铁还原能力的研究,对样品抗氧化活性进行评价。
结果表明,与PSF相比,DPSF的抗氧化活性有显著的提高,而衍生化多糖CDPSF、HCDPSF-2的抗氧化活性则比DPSF得到进一步的改善。
尹日晖水通道蛋白介绍
20世纪90年代初,Wayne等指出在植物的质 膜上存在着水分运输通道。
1992年第一次分离出具有水分运输特性的 蛋白CHIP28(channel-forming protein
of 28 ku),它是红细胞质膜内在蛋白,在质膜上 形成水分选择性运输通道,由约翰霍普金斯 大学医学院的彼得·阿格雷发现，他与通过X 射线晶体学技术确认钾离子通道结构的洛 克斐勒大学霍华休斯医学研究中心的罗德 里克·麦金农共同荣获了2003年诺贝尔化学 奖。
Ups and downs of a transcriptional landscape shape iron deficiency associated chlorosis of the maize inbreds B73 and Mo17
与玉米自交系B73和Mo17萎黄病相关的转录景观形 状缺铁性的起伏
水通道蛋白
液泡膜内在 蛋白(TIPs)
质膜内在蛋 白(PIPs)
NLM蛋白 (Nodulin 26 like MIPs)
1 magggdhsqt ngghvdqral eegrkeefad qgcaamvvsv pfiqkiiaei fgtyflmfag
61 cgavtinask ngqitfpgva ivwglavmvm vyavghisga hfnpavtlaf atsgrfpwrq
Developing Maize Leaf
通过对发育中的玉米叶的全基因组分析揭示 了水通道蛋白Байду номын сангаас横跨膜的溶质转运蛋白间 的相关性。
水通道蛋白介绍
尹日晖
水通道蛋白（Aquaporin）又名水孔蛋白
Discovery
羊栖菜成分以及药理研究进展
羊 栖菜是一 种保健 型食品 ， 含有 丰富的 营养成分 ， 目前 已得 到各界人士公认 。营养价值 高以及特殊 的生物活性是羊栖菜的 著特点 与优势 ， 羊栖菜 自身含有 氨基酸 、 矿物质 以及多 糖等 多种 化合物 ， 对 人体 保健有极大的作用 。我 国具有 十分丰富 的羊栖菜 资源 ， 现 阶段 已经建 成大型人 Ｔ养殖基地 ， 对 羊柄菜 的发展 与研 究有重要作用 。我 同对羊栖菜研究 起步较晚 ， 还没有形 成完整的
民营 科技２ ０ １ ７ 年第３ 期
科技 论坛
羊栖 菜成 分 以及药 理研 究进展
郭 勇 汲 晨锋
（ 哈 尔滨 商 业 大 学 ， 黑龙 江 哈 尔滨 １ ５ ０ ０ ２ ８ ）
摘 要： 羊栖 菜又称鹿 角菜 ， 所合 营养价值极 高， 具有人体 不能 自主合成 的必须氨 基酸以及 微量元素 ， 可药食 两用 ， 对人体 健康有 重要 意义。首先对羊栖 菜的化 学组成成分进行分析 ， 又对其 药理作用进行研 究， 仅供参考。
关键词 ： 羊栖 菜； 药理 研 究 ； 进展 ； 抗 病 性 同时含有３ 种多甾化合物 ， 我 们对其 巾两种化合物 进行化 羊栖菜是一种植物 ， 属于褐藻 门马尾藻科 ， 义被称为鹿角尖 、 甘露醇 ， 得 主要构成 成分 。 海牙菜 等 ， 主要生 长在暖温带 水域附 近 ， 在 我同主要 生长在 辽宁 学方法 以及光谱鉴定实验 ， 以及 山东等地浅海海域 。羊栖 菜肥厚多汁 ， 营养价值极 高足其显 ２ 药 理 活 性 研究表明 ， 羊柄菜具有抗肿瘤 、 降血糖 、 降血脂 、 调节免疫功能 著优势 与特点 ， 不仅可 以作为食用 ， 还可作 为药用 ， 是一 种传统美 而所述药理作用 可能主要 与其所含的羊栖菜多糖有关。 食也 是一种 中草药 ， 受到 民众的广泛 喜爱 ， 后被作 为海洋蔬 菜 以 等作用 ， ． １ 抗肿 瘤 。 羊 柄 菜 在 我 国作 为 药 用 的 历史 悠 久 。 研究证实 ， Ｓ Ｆ Ｐ Ｓ 及 健 康 长 寿 品被 广 泛 推 广 。经 现 代 医学 研 究 发 现 ， 羊 栖 菜 含 有 多 ２ 和马尾藻科植物的有效成分 的确有一定 的抗 肿瘤作用 ， 但其机理 种人类所需微量元素 ， 对改善人力免疫力有重要 作用。 复 杂 。之 前 的 研 究 大 多 将 动 物 作 为研 究 对 象 ， 主要 围 绕 羊 柄 菜 对 １ 化 学 成 分
羊栖菜功能多糖化学及其生物活性研究
羊栖菜功能多糖化学及其生物活性研究羊栖菜是海洋植物褐藻的一种，主要生长在北太平洋西部，在我国沿海多有分布。
羊栖菜中含有两种活性多糖，即褐藻酸和岩藻聚糖。
褐藻酸在含量与结构上与其他褐藻中的褐藻酸有一定不同。
本研究用热水提取法和乙醇沉淀法分离褐藻酸，每1000g干藻体含褐藻酸粗多糖160g，得率16%；取16g粗品用DEAE纤维素柱分离，分布收集洗脱液，得到相对纯的褐藻酸8g，相对于粗品得率为50%；再用中等强度的阳离子交换纤维处理，除去中性多糖，得到精制褐藻酸5.75g，相对于上一步得率为71.88%；用特性黏度法测定精制褐藻酸的分子量，为16,286Da；通过分析甘露糖醛酸（M）和古罗糖醛酸（G）含量，计算M/G的比值为2.75，这一数值较海带和紫菜中褐藻酸要高，这是羊栖菜褐藻酸的特点之一，很多活性与这一特点有关。
岩藻聚糖是一种具有独特结构和多种生物活性的多糖。
从羊栖菜中提取岩藻聚糖，利用Q-Sepharose FF阴离子交换树脂分级，得到硫酸根含量不同的三个组分：F-1, F-2和F-3，经化学组成分析和分子量测定，发现组分F-2不但得率较高而且组成较单一，主要单糖组成为岩藻糖和半乳糖，硫酸根含量高且糖醛酸含量低。
使用高效凝胶过滤色谱、高效薄层色谱、红外光谱、酸水解、甲基化反应、气－质联用色谱和核磁共振波谱等方法对组分F-2进行了进一步的结构分析。
HPSEC法测定表明组分F-2的分子量在160,000左右。
IR分析发现F-2中存在双硫酸根取代的情况。
用GC-MS对F-2和其脱硫产物F-2d的甲基化产物进行分析和比较，由此提出F-2中岩藻糖是以 1→3 连接为主，半乳糖是以 1→6连接为主，硫酸根主要取代在岩藻糖残基的C-4位上，其次在C-2位，还有C-2,4位双硫酸根取代。
组分F-2的酸水解产物利用截留分子量为5,000Da的超滤膜分离后通过Bio-Gel P4凝胶柱分为F-2-a, F-2-b 和F-2-c三个寡糖组分。
羊栖菜多糖SFPS抗氧化作用及对衰老作用的探讨
羊栖菜多糖SFPS抗氧化作用及对衰老作用的探讨衰老一直是人们研究的重要方向,特别是抗衰老,更是从古至今研究的热点。
近年来,衰老被证明主要由自由基所引起,与肠道菌群密切相关。
而且肠道微生态的紊乱与衰老、疾病等密不可分。
多糖作为膳食中含量丰富、结构复杂的成分之一,主要通过进入胃肠道被微生物分解利用。
因此,多糖对于维持肠道菌群稳态等具有重要意义。
而羊栖菜(Sargassum fusiforme)是一种营养丰富的药食两用海藻,从中提取的羊栖菜多糖主要包括褐藻胶、褐藻糖胶和褐藻淀粉,其中对褐藻糖胶活性的研究最为广泛。
近年来研究揭示,羊栖菜多糖是一种非常有潜力的天然抗氧化药物,但在延缓衰老方面的研究较少,尤其在肠道菌群方面的研究罕有报道。
本文以羊栖菜多糖为研究对象,通过鉴定其抗氧化活性,及对果蝇寿命的影响和对衰老小鼠肠道菌群的调节作用来解析羊栖菜多糖抗衰老的作用机制。
结果显示(1)喂食羊栖菜多糖数日,发现在氧化损伤环境下羊栖菜多糖可显著提高果蝇的生存率、平均寿命等。
而且各种与抗氧化相关的酶活都有所提升。
Nrf2基因表达提高,Keap1基因表达降低,且不同程度的上调了下游抗氧化基因如SOD、GCLC、HO-1等的表达,但存在性别差异,并清除果蝇体内MDA的含量,增加机体抗氧化功能。
(2)通过对不同组小鼠的肠蛋白和基因的检测,发现与衰老小鼠相比,多糖给药组小鼠的Nrf2及相关下游基因的表达显著上调,说明羊栖菜多糖可通过激活Nrf2/ARE信号通路来保护衰老过程中的小肠。
(3)用高通量测序对小鼠的肠道菌群16SRNA测序并分析,发现喂食羊栖菜多糖不仅提高了衰老小鼠肠道微生物的多样性,而且显著降低老年小鼠中的厚壁菌门与拟杆菌门的相对丰度(F/B比值)。
此外,还增加了肠道中部分有益菌(如:Atopostipes,Clostridium sensu stricto等)的丰度,同时抑制了有害菌(如:Thaumarchaeota,Cyanobacteria phyla等)的大量滋生。
羊栖菜综述
羊栖菜营养价值、多糖提取及其研究进展摘要本文介绍了羊栖菜的形态特征与繁殖方式，阐述了其营养和药用价值，讨论了羊栖菜多糖的三种提取工艺（水提取工艺、酸提取工艺和氯化钙提取工艺），最后展示了一下羊栖菜加工之后的几种产品，并展望了羊栖菜的发展前景。
关键词：羊栖菜；营养；功能；提取工艺；多糖Nutritional value, polysaccharidel extraction and and its research progress of sargassum fusiformeAbstractThis article introduces the morphological characteristic and breeding method of Sargassum, describes its nutritional and medicinal value, discusses three extract technology of it’s polysaccharide (water extraction, acid extraction technology and calcium chloride extraction). Finally, the paper shows several products after processing, and look into the future development of Sargassum.Key words：sargassum fusiforme；nutritional；function；extract technology；polysaccharidel目录1 引言................................................................................................................... Ⅱ―12 羊栖菜的形态特征与繁殖方式....................................................................... Ⅱ―22.1 羊栖菜形态特征..................................................................................... Ⅱ―22.2 羊栖菜繁殖方式..................................................................................... Ⅱ―23 羊栖菜的营养和功能....................................................................................... Ⅱ―33.1 羊栖菜营养成分..................................................................................... Ⅱ―33.2 羊栖菜功能............................................................................................. Ⅱ―33.2.1消食化瘀........................................................................................ Ⅱ―33.2.2增强免疫力.................................................................................... Ⅱ―33.2.3 降血脂血糖................................................................................... Ⅱ―43.2.4 抗肿瘤促进造血........................................................................... Ⅱ―44 羊栖菜多糖的提取工艺简介........................................................................... Ⅱ―54.1水提取工艺.............................................................................................. Ⅱ―54.2 酸提取工艺............................................................................................. Ⅱ―54.3 氯化钙提取工艺..................................................................................... Ⅱ―55 羊栖菜加工及利用........................................................................................... Ⅱ―75.1羊栖菜干制品.......................................................................................... Ⅱ―75.2羊栖菜粉末.............................................................................................. Ⅱ―75.3 调味品系列............................................................................................. Ⅱ―75.4 羊栖菜保键茶系列................................................................................. Ⅱ―75.4.1 固形袋泡茶................................................................................... Ⅱ―75.4.2 速溶茶........................................................................................... Ⅱ―85.5 羊栖菜休闲食品系列............................................................................. Ⅱ―85.5.1 羊栖菜调味纸片食品................................................................... Ⅱ―85.5.2 羊栖菜多元化彩色营养颗粒食品............................................... Ⅱ―86 结论................................................................................................................... Ⅱ―9 参考文献............................................................................................................. Ⅱ―101 引言羊栖菜[sargassum fusiforme(harv.)satchel]属褐藻类马尾科植物，在我国分布很广，北起辽东半岛、山东，南至浙江、福建和广东浅海及滩头均有生长，在浙江沿海则表现为优势种[1],是一种重要的经济海藻资源。
羊栖菜成分以及药理研究进展
羊栖菜是一种植物 ， 属于褐 藻门马尾藻科 ， 又被 称为鹿角尖 、 海 实验研究 ， 通过一些列 的化学成分断定发 现羊栖菜 中含有 大量甘露 牙菜等 ， 主要生长在 暖温带水域 附近 ， 在 我国主要生长在 辽宁 以及 醇 ， 同时含有 ３种 多 甾化合物 ， 我们对 其 中两种 化合物 进行化 学方 山东 等地 浅海海域 。羊栖菜肥厚多汁 ， 营养价值极高是其显著优 势 法 以及光谱鉴定实验 ， 得出主要构成成分 。 与特点 ， 不仅可 以作为食用 ， 还可作为药用 ， 是一种传统美食也 是一 ２ 药 理 活 性 种 中草药 ， 受到 民众 的广泛喜爱 ， 后被作 为海 洋蔬菜 以及 健康 长寿 研究表 明 ， 羊栖菜具 有抗肿 瘤 、 降血糖 、 降血脂 、 调节 免疫 功能 品被广泛推广 。经 现代 医学研究发现 ， 羊栖菜含有多种人类所 需微 等作用 ， 而所述药理作用可能主要与其所含 的羊栖菜多糖有关 。 量元素 ， 对改善人力免疫力有重要作 用 。 ２ ． １ 抗 肿瘤 。羊 栖菜在 我 国作 为药用 的历史悠 久 。研究证 实 ， １化学成分 － Ｓ Ｆ Ｐ Ｓ和马尾藻科植 物的有效成分 的确有一定 的抗肿瘤作用 ，但其 羊栖菜是一 种保健型食品 ， 含有 丰富的营养成 分 ， 目前 已得到 机理复杂。之前的研究大多将动物作为研究对 象 ， 主要 围绕羊栖菜 各界人士公认。 营养价值 高以及特殊 的生物活性是羊栖菜 的显著特 对免疫的促进作用和对荷瘤动物体 内 自由基 、 脂质 过氧化作用 的影 点与优势 ， 羊栖菜 自身含有氨基酸 、 矿物质以及多糖等多种化合 物 ， 响展开 。在诱导肿瘤细胞 的凋亡试验 中发现 Ｓ Ｆ Ｐ Ｓ能改变肿瘤细 胞 对人体保健有极大的作用。我国具有十分丰富的羊栖菜资 源 ， 现 阶 周期和细胞凋亡 ， 同时发现 Ｓ Ｆ Ｐ Ｓ能治疗人 胃癌和人直肠癌 ， 且疗 效 段 已经 建成大型人工 养殖 基地 ，对羊栖 菜的发展 与研究有 重要作 较好 ， 推测其作用 机制是 Ｓ Ｆ Ｐ Ｓ升高肿瘤 细胞 内 Ｃ ａ ２ ＋浓度 ， 从而诱 用。 我 国对羊栖菜研究起步较 晚 ， 还没有形成完整的系统以及制度 ， 导肿瘤细胞凋亡 。在羊栖菜多糖诱导肿 瘤细胞凋亡实验 中 ， 研究 了 近些 年来 ， 相关科技人员越 愈加重视对羊 栖菜 的研究 与发展 ， 下 面 Ｓ Ｆ Ｐ Ｓ 对人 类 白血病 Ｈ Ｌ － ６ ０细胞系 的增 殖抑制和 凋亡诱导 的作用 ， 我们对羊栖菜 的化学成分记性仔细分析。 证实 Ｓ Ｆ Ｐ Ｓ阻滞 Ｇ ２ ／ Ｍ期 细胞 ， 从而显著抑制 Ｈ Ｌ 一 ６ ０细胞增殖 。 其他 １ ． １ 蛋 白质和氨基 酸。 蛋白质高 、 低脂肪以及 低热量是羊栖菜显 研究表 明，羊栖菜多糖抗肿瘤作用并 不仅限于诱导肿瘤 细胞凋亡 ， 著特 点之一 ， 我们通过 对羊 栖菜营养组 成部分进行分析 ， 得 出羊栖 还通 过多条途径联 合作用 ， 如抗 氧化 、 免疫调节 、 诱导 细胞凋 亡等 ， 菜 营养均衡 的结 论 ， 同时羊栖菜含有 ８中人体必须 的氨基酸 ， 分别 从 而达 到 良好 的抗肿瘤作用 。 为亮氨酸 、 缬氨酸 、 色氨酸 、 精氨 酸 、 赖氨 酸 、 苏 氨酸 、 蛋氨酸 以及 异 ２ ． ２降血糖 。现代药理学研究发现 ， 糖 尿病 的发病与 自由基增多 亮 氨酸 。 这８ 种氨基酸为人体必须营养元素 ， 且不能 自主合成 ， 所以 及 防御 系统紊乱有关 。 羊栖 菜中含有 大量 的膳 食纤 维 ， 如海藻 淀粉 、 羊栖菜 对人 体健康有 重要意义 。 同时我们通过相关实验对羊栖菜所 褐藻胶 、 纤维素 、 半纤维素等 ， 具有很 高的持水性 。膳食 纤维与人体 含氨基酸含 量进行测算 ， 得出数值为 ０ ． １ ５ ％一１ ． ５ ７ ％。 内糖代谢密切相关 ， 降血糖作用 明显 。研究 了用羊栖菜 制成 的保健 １ ． ２矿物质与微量元素。 羊栖菜还有天然矿物质食 品的美誉 。 主 食品海麦素对高血糖小 鼠的降糖作用 ， 发现海麦素 能明显降低高血 要是因羊栖 菜中不仅含有人体所需 氨基 酸 ，还含有大量无机元素 。 糖小 鼠空腹和餐后血糖值 ， 而对正 常小鼠和糖尿病小 鼠耐糖量无 明 我们对 羊栖菜进行版 测量分析实验 ，对 羊栖菜 中微 量元 素进 行测 显影 响； 王兵 等发 现 ， 四氧嘧 啶糖尿病 小 鼠的血液及胰 腺 中过氧化 定， 发现 羊栖菜 中营养 元素含 量较高 ， 例 如铁 、 钙 以及锌 等微 量元 脂质含量 明显 高于正常组 ， Ｓ Ｆ Ｐ Ｓ对其降糖作用 明显 ， 但对 正常小 鼠 素， 这些元 素对人体健康发展有重要意义。 羊栖菜中铜元 素较少 ， 铜 无明显作用 ， 这些研究共 同表 明羊栖菜并不是通过 刺激胰岛素分 泌 是一种对人力健康发展有 害的元素 ， 这更加说 明羊栖 菜的优点 。同 来降低血糖 。 认为羊栖菜可能是通过增强 Ｇ Ｓ Ｈ — Ｐ Ｘ和血清超氧化物 时， 通过实验 ， 我们在羊栖菜 中发现大量 的碘元素 与砷元素 ， 这说 明 酶（ Ｓ Ｏ Ｄ ） 的活性来 降低体 内 Ｎ Ｏ和丙二醛 （ ＭＤ Ａ ） 的水 平 ， 从而降低 血 羊栖菜具有较强 的聚集碘以及 砷的能力 ， 其 中砷大多数 以有机 砷 的 糖 。 形式存在 。 ２ ． ３降血脂 。羊栖菜 Ｓ Ｆ Ｐ Ｓ在降血脂和预 防动脉粥样硬化形 成方 １ ． ３多糖 。 羊栖菜 多糖 是羊栖菜藻体 的主要构成成分 ， 这其 中又 面亦具有潜在 的应用价值 ，它具有减少 Ｌ Ｐ Ｏ含量 ，增加 Ｓ Ｏ Ｄ、 Ｃ Ａ Ｔ 包括褐藻酸 、 褐藻淀粉以及褐 藻糖 浆。经过不断的实际时 间与研究 活性 ， 清除过氧阴离子 自由基和羟基 自由基等一系列作用 。研 究发 表明， 多糖结 构对羊栖 菜药理活性有决定 作用 ， 下面我们 对其进行 现 ， 不同剂量组的 Ｓ Ｆ Ｐ Ｓ均能显著升高高密度脂蛋 白胆固醇含量 ， 并 仔 细分析 。 能抑制高血脂模型 大鼠血 中总胆 固醇 、 甘 油三脂和低密度脂 蛋 白胆 １ ． ３ ． １ 褐藻酸以及褐 藻淀粉 。褐藻酸是一 种高聚物 ， 主要 由甘露 固醇升高。羊栖菜多糖 的调血脂作用可能 与其 多糖 结构特性有关 。 糖 醛酸 以及 古洛糖醛酸构成 ，是 羊栖菜多糖 中含量最 多的一种 成 对高脂模 型的大鼠或家兔用 不同浓度的 Ｓ Ｆ Ｐ Ｓ进行灌 胃，发现不 同 分， 可作为食 品添加剂被食用。 相对与褐藻酸来说 ， 羊栖菜多糖 中只 剂量的 Ｓ Ｆ Ｐ Ｓ对不 同用药时期 的血脂水平影响不 同。 含有少量的褐藻淀粉 ， 主 要 由葡 聚 糖 构 成 。 结 束 语 １ ． ３ ． ２褐藻糖胶 。褐藻糖胶是一种水溶性天然硫化杂聚多糖 ， 主 羊栖菜特定 活性 单体与药效及作用机 理的关 系不断被 明确 ， 尤 要存在与褐藻细胞间 ， 又被称为褐藻多糖硫酸酯 。糖醛 酸 、 半乳糖 、 其是在 Ｓ Ｆ Ｐ Ｓ药理活性和抗肿瘤机理 的研究上 。但对 复合多糖 以及 甘露醇以及木糖 等都 是褐藻糖胶 的主要 构成成分 ， 对褐 藻的生物活 除多糖外其他化学成分如 甾醇等药理活性还有待深入研究 。 羊栖 菜 性有一定的影响 。 来源广泛 ， 且药食 两用 ， 应用价值较高 。随着各项技术 的不断发展 ， １ ． ３ ． ３ 膳食纤维 。膳食纤维 的主要来源就是羊栖菜中的多糖 ， 我 羊栖 菜作为海洋植 物资源在 医药 的开发 及可持续 利用方 面具 有重 们根据 相关实验对羊栖 菜中膳食纤维 总量进行测定 ，得 出数据 为 要 意 义 。 参 考 文献 ４ ９ ． ２ ％， 主要由不溶性膳食纤维 与可溶性膳食纤维组成 ， 其 占有量分 别为 １ ６ ． ３ ％和 ３ ２ ． ９ ％。同时我们 发现可溶性膳食纤维含有 大量 的灰 ［ １ ］ 王 百龙 ， 孙稚 颖， 周凤 琴． 羊栖菜成分 以及 药理研 究进展 ［ Ｊ 】 ． 山东中 分， 而不溶性 膳食纤维含有 大量的蛋 白质 ， 这是 两种膳食纤 维本 质 医杂 志 ， ２ ０ １ ５ （ ９ ） ． 上 的不 同 。 『 ２ ］ 郭悦， 夏亚 男－ 周敏， 金 洪国， 关丽萍． 羊栖 菜不 同溶剂提取 物抗抑郁 １ ． ３ ． ４甾醇 化合 物 。首先我们对羊 栖菜的 乙醇提 取物进行相 关 活性研 究『 Ｊ １ ． 浙江海洋学院学报（ 自然科学版） ， ２ ０ １ ５ （ ６ １ ．
羊栖菜褐藻糖胶的结构分析
羊栖菜褐藻糖胶的结构分析褐藻糖胶是羊栖菜的主要成分之一,含有岩藻糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖和葡萄糖醛酸,部分单糖中的羟基发生硫酸酯化。
由于结构复杂,分子量较大,给结构分析带来困难。
近年来发现褐藻糖胶具有多种生物活性,但对其结构与生物活性之间的构效关系尚不清晰。
要解决这一科学问题,必须对褐藻糖胶进行结构分析。
本研究对羊栖菜进行热水煮提、80%乙醇沉淀,得水溶性总多糖WHFP,收率为20.4%。
通过CaCl2沉淀除去其中的水溶性褐藻胶,得褐藻糖胶F,得率为3.7%。
苯酚-硫酸法、间羟基联苯法和考马斯亮蓝法分析结果显示F的总糖含量、糖醛酸含量和蛋白质含量依次为52.1%、6.4%和1.2%。
采用DEAE-Sepharose CL-6B和Sephacryl S-400HR柱对F进行分级纯化,得到纯化组分F1-2和F2-2,透析冻干,对两组分进行理化性质分析。
采用上述同样方法测定总糖含量、糖醛酸含量和蛋白质含量,硫酸钡-浊度法测定硫酸基团含量,PMP衍生化和高效液相色谱法测定单糖组成,通过高效凝胶渗透色谱法使用TSK-gel G-5000PWXL柱测定纯化样品的平均分子量。
紫外全波长扫描检测两组分是否含有蛋白质和核酸。
结果显示F1-2和F2-2在Sephacryl S-400HR柱上呈现均一的对称峰,相对于F,两者的回收率分别为8.8%和32.6%。
F1-2的糖含量、糖醛酸含量、蛋白质含量和硫酸基团含量分别为59.8%、6.0%、0.8%和24.0%。
对于F2-2,各种含量依次为62.9%、5.2%、0.2%和19.5%。
F1-2的单糖组成为Fuc:Gal:Xyl:GlcA:Man:Rha=67.9:15.8:8.2:3.7:2.6:1.8,F2-2的单糖组成为Fuc:Gal:Xyl:GlcA:Man:Rha=68.6:20.4:5.9:2.6:1.6:1.0。
两个组分的数均分子量分别为1.7×104Da和2.4×104Da,重均分子量分别为3.9×104Da和5.O×104Da。
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摘要褐藻羊栖菜对淡水浸泡有很强的耐受能力，利用此特性，养殖户们用淡水浸泡的方法清除沙蚕等敌害生物，而对羊栖菜幼苗则无不良影响，而藻类独特的水通道蛋白在其中可能扮演重要角色。
通过克隆得到了褐藻羊栖菜sflip基因编码序列，其包含678 bp的开放阅读框，编码225个氨基酸，sflip蛋白结构域预测表明其含有6个跨膜区域并且含有2个npa水通道特征性单元，但其中第二npa被npm取代；基因结构分析发现sflip基因含有5个内含子，与长囊水云的同源性很高；sflip基因在淡水浸泡过程中的表达先升后降，但随着时间延长则又显著上升。
上述结果表明，sflip属于藻类中发现的一类新的水通道蛋白，其在羊栖菜耐受低渗胁迫中可能有种特殊的作用机制。
关键词羊栖菜；水通道蛋白；基因克隆；淡水胁迫；基因表达中图分类号 q943.2 文献标识码 a 文章编号 1007-5739（2016）11-0228-04水通道蛋白（aquaporins，aqps）是细胞膜上选择性高效转运水分子的特异蛋白通道，属主要内在蛋白（major intrinsic proteins，mips）家族成员，除水分子外，aqps还能转运甘油、硼酸、二氧化碳、尿素和过氧化氢等多种小分子。
高等植物中存在大量aqps基因，如拟南芥（arabidopsis thaliana，35个）[1]、水稻（oryza sativa，34个）[2-3]、玉米（zea mays，35个）[4]，根据亚细胞定位和转运能力的不同，主要分为pip（plasma membrane intrinsic protein）、tip（tonoplast intrinsic protein）、nip（nodulin-26 like intrinsic protein）、sip（small intrinsic proteins）和xip（x intrinsic proteins）等6类[5]。
目前的研究较少关注低等植物――藻类的aqps，它们的数量明显少于高等植物，如长囊水云（ectocarpus siliculosus，3个）、三角褐指藻（phaedactylum tricornutum，5个）、假微型海链藻（thalass-iosira pseudonana，2个）等[6]。
对高等植物而言，组织、器官高度分化，不同的膜、组织，甚至不同的外界条件及胁迫时间，都可能需要有不同的aqps，因此目前高等植物中发现庞大数量的aqps符合它们应对不同外界胁迫的要求；而藻类等低等植物，形态、结构和生活方式较简单，一般没有根、茎、叶的分化，它们体内aqps的数量就相对较少。
另一方面，由于藻类与陆生高等植物在生长环境上存在巨大差异，藻类特别是海洋藻类中的aqps，在其应对渗透胁迫上的作用机制与高等植物也会有所区别。
本研究克隆得到了褐藻羊栖菜sflip基因编码序列，分析了该基因的氨基酸序列特征、基因结构及其在淡水浸泡过程中的表达模式，并预测了其蛋白结构域。
1 材料与方法1.1 试验材料羊栖菜采集自温州市洞头县鹿西岛。
收集后，用保温箱在2 h内将海藻运回实验室。
接着马上用过滤过的天然海水洗涤藻体，在用淡水处理前将其置于20 ℃装有灭菌天然海水的高密度聚丙烯箱中暂养2 d，光周期为12 h∶12 h，并向培养基中通气，同时每天更换新鲜灭菌海水。
1.2 羊栖菜总rna提取和cdna合成样品在液氮中研磨后采用ctab法提取总rna[10]，经dnase消化去除dna，并经1%的琼脂糖凝胶电泳检测总rna的浓度和完整性。
cdna合成采用roche公司cdna合成试剂盒。
1.3 sflip编码区序列的扩增以羊栖菜cdna为模板，利用引物sflip1和sflip2（表1）扩增sflip编码区外显子全序列。
pcr反应条件为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃再延伸5 min。
将pcr产物纯化后连接到pgemt easy质粒，用热激法导入大肠杆菌dh5α，amp抗性和x-gal/iptg蓝白斑筛选并鉴定阳性克隆，送华大基因公司测序。
以羊栖菜gdna为模板，利用引物sflip1和sflip2（表1）扩增sflip基因组全序列。
采用neb公司超保真pcr试剂盒。
将pcr产物纯化后连接到pgemt easy质粒，用热激法导入大肠杆菌dh5α，amp抗性和x-gal/iptg蓝白斑筛选并鉴定阳性克隆，送华大基因公司测序。
1.4 序列分析及比较根据已知的cdna序列设计合适引物，获得sflip的基因组序列，继而对基因结构进行分析；通过protscal软件[11]预测分析sflip蛋白的疏水域；同时，用octopus[12]软件对aqps 蛋白拓扑结构进行预测。
1.5 羊栖菜基因的实时定量pcr分析以正常盐度海水处理为对照和淡水处理时间为5、15、30、60、300 min的藻体cdna为模板，对sflip基因在淡水处理不同时间后的表达进行荧光实时定量pcr分析。
荧光实时定量pcr试剂盒采用bio-rad公司的，pcr反应体系按照试剂盒说明书。
以羊栖菜看家基因β-actin作为内参，利用bio-rad iq 5多重荧光定量pcr进行目标基因表达情况的分析。
反应程序：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性15 s，54 ℃退火20 s，40个循环；65～95 ℃，每次上升0.5 ℃作溶解曲线。
54 ℃收集荧光信号。
每个样品重复3次，取其平均值。
所用的基因特异引物参照表1。
2 结果与分析2.1 sflip基因编码区序列前期，在羊栖菜转录组数据中发现了一个可能编码aqp的基因，深入分析，发现其与藻类中发现的一类新的aqp――lip的序列同源性非常高[6]，因此将该基因命名为sflip。
根据该序列设计特异性引物sflip1和sflip2，并以羊栖菜cdna为模板进行pcr扩增，测序后确认序列的同源性达100%，克隆获得的sflip基因编码区序列包含了678 bp的开放阅读框（orf），编码225个氨基酸（图1）。
为了解sflip基因的结构，以羊栖菜gdna为模板进行pcr扩增，测序结果发现，sflip 基因包含5个内含子，并且都符合gt-ag规则，所有内含子的碱基都以gt起始和ag终止，长度为507～1 894不等（图2）。
2.2 基因序列分析及结构域预测经protparam软件分析，sflip蛋白分子量为24.03 kd，理论等电点为5.69，负电荷的氨基酸残基总数（asp+glu）为11，带正电荷的氨基酸残基总数（arg+lys）为10，不稳定系数（instability index，ⅱ）为21.24，是一类稳定的蛋白。
按照octopus对sflip跨膜结构的预测，该蛋白具有6个跨膜区，分别位于15―23、34―64、75―95、119―139、148―168和195―215氨基酸位置，有2个aqp家族成员高度保守的npa（天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸，asn-pro-ala）单元，分别位于58―60和174―176氨基酸位置，其中，第2个npa中的丙氨酸被甲硫氨酸替换（图3）。
2.3 sflip基因序列同源性分析通过氨基酸序列比对显示（图4），羊栖菜sflip与其他藻类lip的同源性为长囊水云（ectocarpus siliculosus，cbj-27953）84%、微绿球藻（nannochloropsis gaditana，xp_005853 759）43%、三角褐指藻（phaeodactylum tricornutum，xp_0021 76929）34%、柱状脆杆藻（fragilariopsis cylindrus）33%、针尖杆藻（synedra acus，aeq27900.1）31%、假微型海链藻（thala-ssiosira pseudonana，xp_002287257）30%、大洋海链藻（thal-assiosira oceanic，ejk66519）30%、多列拟菱形藻（pseudo-nitzschia multiseries）29%以及褐潮藻（aureococcus anophage-fferens，xp_009034432）25%。
对其氨基酸序列与其他藻类lip蛋白利用clustal x构建进化树（图5）。
结果显示，10个藻类lip类aqp基因被聚为三大类群，其中sflip蛋白与长囊水云esmip聚为一类，亲缘关系最近。
2.4 sflip基因的表达特异性分析为了检测羊栖菜淡水浸泡过程中sflip基因表达量的变化，以不同处理时间羊栖菜的cdna为模板，以羊栖菜看家基因β-actin作为内参，对sflip基因进行实时荧光定量pcr分析。
结果（图6）显示，在短时间内（5 min），与对照组相比，sflip基因的表达量迅速上升了1.29倍，之后呈下降趋势，淡水浸泡30 min后，sflip基因表达量恢复到浸泡前水平，而1 h后则降至对照的39%，但更长时间（5 h）的浸泡又使得sflip基因的表达量显著上调。
表明sflip基因对淡水胁迫存在瞬时的应激反应，表达量迅速上调，随着胁迫时间的延长，该基因的表达受到显著抑制，表达量急剧下调，但更长时间的胁迫则又使得其表达量逐渐恢复并成倍上调表达，这可能与该基因所行使的功能有关。
3 结论与讨论aqps在植物应对渗透胁迫中起着重要作用，以往的研究主要集中在高等植物身上，较少涉及藻类，而藻类、特别是潮间带的海洋藻类，由于其生活环境与陆生高等植物间存在巨大差异，既会经历各种高盐、脱水等高渗，也需经受雨水等低渗在内的极端环境的胁迫，因此藻类在应对外界环境胁迫的机制上应区别于高等植物，对于aqps同样如此，研究aqps有助于解析此类低等植物耐受渗透胁迫的应对机制。
aqps通常含有6个α螺旋跨膜结构（h1-h6），而每个α螺旋由20个左右氨基酸组成，aqps的-nh和-cooh末端位于胞质侧，跨膜结构间由环连接，分为3个胞外环（a、c、e环）和2个胞内环（b、d环），其中b、e环各有一段高度保守的npa单元串联序列[13]。
此外，特定的4个氨基酸，包括h2、h5各1个外加le环上2个，形成了一个特殊的ar/r（芳香类氨基酸/精氨酸）过滤结构，对aqps的底物特异性起到重要影响[14]。
本研究获得的羊栖菜aqp与藻类中发现的一类新的aqps亚家族成员lips同源性极高，因此将其命名为sflip。
lips 虽然在氨基酸序列上与sip非常接近，但在aqps家族中高度保守的特征性序列上却存在显著差异，其第2个npa单元中的丙氨酸被替换成了疏水性更强的甲硫氨酸，后者的侧链更长；同时，对于sflip结构域的预测则显示其与其他aqps的差异，特别是对于h1和h2的推测，不同软件（如octopus和thmm等）预测的结果存在不一致性，表明该区域的不确定性；此外，sflip在ar/r过滤结构上也与lips非常接近，由色氨酸、亮氨酸、脯氨酸和异亮氨酸组成。