Roche_454(GS_FLX_Titanium_System)超高通量测序技术原理
高通量技术解析锡林河底泥反硝化菌群组成及丰度
Advances in Microbiology 微生物前沿, 2014, 3, 70-78Published Online September 2014 in Hans. /journal/amb/10.12677/amb.2014.33009Pyrosequencing Analysis RevealsAbundance and Community Composition of Denitrifying Bacteria in Xilin River SludgeJingli Yu1,2,3, Yahui Fan1, Xiaoxia Gao1, Haoxian Shi2, Ji Zhao1,3*1College of Environment and Resources, Inner Mongolia University, Hohhot2College of Life Sciences, Inner Mongolia University, Hohhot3Sino-US Center for Conservation, Energy Science in Inner Mongolia, HohhotEmail: hot-yjl@, *ndzj@Received: Aug. 10th, 2014; revised: Sep. 12th, 2014; accepted: Sep. 20th, 2014Copyright © 2014 by authors and Hans Publishers Inc.This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY)./licenses/by/4.0/AbstractNitrogen loss caused by denitrifying bacteria is an important link in the global carbon-nitrogen cycles, whose community compositions and abundance may have a role in regulating emissions and forms of gaseous nitrogen. Based on 454 pyrosequencing of the 16S rRNA gene, as well as the reported denitrifying bacterial genera mentioned in many literatures, we detected community compositions and abundance of denitrifying bacterial communities in Xilin River sludge. The re-sults showed that 5744 quality reads were grouped into 2263 OTUs at genus level (0.05 distance).After alignment with known sequences deposited in GenBank, the unclassified bacteria genera accounted for 57.49%. 204 classified bacterial genera covered 20 denitrifying bacteria genera, in-cluding 1.40% of Flavobacterium, 1.23% of Hydrogenophaga, 0.19% of Bacillus and Thauera,0.17% of Thiobacillus, 0.15% of Hyphomicrobium, etc. Among them, Flavobacterium and Hydroge-nophaga were the most dominant denitrifying bacterial genera in Xilin River bottom sludge, ac-counting for 69.03% of the total denitrifying bacterial genera. Correlation analysis showed that Flavobacterium preferred to attach to coarse sand grains in relatively high pH conditions, pro-moting the emission of CH4 and inhibiting the production of N2O and CO2. In opposition, Hydroge-nophaga showed special preference to fine silt grains in rich nutrition conditions, promoting the emission of N2O and CO2 and inhibiting the production of CH4.KeywordsPyrosequencing Analysis, Denitrifying Bacteria, Community Compositions, Abundance, Xilin River Sludge*通讯作者。
高通量测序技术及其在植物研究中的应用
2012年第4期2012№4辽宁林业科技Journal of Liaoning Forestry Science ＆Technology收稿日期：2012-02-22基金项目：引进国际先进林业科学技术项目（2012-4-39）；辽宁省科学技术计划重大项目（2011207002）；林业转基因生物安全性监测项目（JJ-11-03）。
高通量测序技术及其在植物研究中的应用冯健1，赵雪崴2（1.辽宁省林业科学研究院，辽宁沈阳110032；2.辽宁省林业调查规划院，辽宁沈阳110122）摘要：随着“后基因组时代”的到来，国际学术界已经认识到发展快速低成本测序技术的重要性。
在这样的背景下，高通量测序技术应运而生，其代表性技术平台有Roche 的454测序技术、Illumina 的Solexa 测序技术和ABI 的Solid 测序技术。
笔者通过查阅相关文献，系统回顾了第1代测序技术发展过程，详细叙述了高通量测序技术原理和方法，探讨了高通量测序技术在植物分子生物学研究中的应用。
关键词：高通量测序技术；测序技术；植物中图分类号：Q503文献标识码：A文章编号：1001-1714（2012）04-0029-072003年4月14日，美国人类基因组研究项目首席科学家Collins F 博士在华盛顿隆重宣布：人类基因组序列图绘制成功，人类基因组计划（Human Genome Project ，HGP ）的所有目标全部实现。
这标志“人类基因组计划”胜利完成和“后基因组时代”（Post Genome Era ，PGE ）正式来临[1]。
进入后基因组时代，功能基因组学、系统基因组学等研究越来越受到重视，与之相应的是对测序技术的需求有增无减，传统的测序方法已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求。
国际学术界已经清醒地认识到发展快速低成本测序技术的重要性。
2006年10月美国加州Santa Monica 的X Prize 基金会承诺给第1个实现1000美元人类全基因组测序的个人或单位颁发1000万美元的奖金，成为有史以来生物医学领域奖金额度最高的科技奖，足见人类科学对测序技术的需求。
宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
454测序价绍
罗氏454高通量测序平台美吉生物拥有两台罗氏454公司开发的第二代DNA高通量测序仪Genome Sequencer FLX（GS FLX）。
GS FLX的命名正是来源于其在多领域的灵活（flexible）应用。
该系统性能的提升和应用领域的不断扩展，对大规模基因序列研究的相关应用领域产生了巨大的推动作用。
Genome Sequencer FLX System平台概况型号：GS FLX System试剂：long-read GS FLX Titanium chemistry产量：100万序列∕Run读长：400bp以上应用：基因组de novo测序、转录组de novo测序、宏基因组测序、重测序贡献：应用此技术已经发表1026篇学术论文发展：2011年将实现测序读长达到1000bp测序原理GS FLX系统的测序原理是基于焦磷酸测序法，依靠生物发光对DNA序列进行检测。
在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，GS FLX系统将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。
通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。
此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、高灵敏度和高自动化的特点。
GS FLX高通量测序方法原理示意图实验流程GS FLX系统减少了传统测序样品制备过程中对大型自动站的依赖，完全不需要进行繁琐的建库过程，也不必进行克隆挑取、微孔板处理等工作，而是利用1）样品种类：GS FLX系统支持各种不同来源的样品序列测定，包括基因组DNA，PCR产物，BACs，cDNA及小分子RNA等，不同类型的样品测序都可在一台仪器上完成。
2）样品DNA打断：样品如基因组DNA或BAC等被打断成300到800bp的片段；对于小分子的非编码RNA，这一步骤并不需要。
短的PCR产物则可利用GS融合引物扩增后直接进行步骤4）。
测序技术及测序仪器的比较
河南农业大学本科生毕业论文（设计）题目现阶段的测序技术及测序仪器的比较学院生命科学学院专业班级2007级生物技术4班学生姓名徐志超指导教师高玉千撰写日期：2011年5月5日现阶段的测序技术及测序仪器的比较徐志超生命科学学院摘要：自sanger测序技术发明以来，经人类基因组计划的促进，测序技术有了跨越式的发展，以实验方法与实验仪器的改进为标志,测序技术经历了三代的发展，同时测序技术向着高通量测序，单分子测序，低价格测序的方向发展，目前测序技术已成为分子生物学实验中的重要的实验手段。
本文主要简单回溯了测序技术的发展历史，介绍了现阶段主流测序仪器IlluminaGA，ROCH-454，ABI 3730XL，ABI SOLID及HeliScope的原理及工作流程。
关键词：测序技术；测序仪；IlluminaGA；ROCH-454；ABI-3730XL；ABI-SOLID；HeliScope Studies on sequencing technology and sequencerXU Zhi-chaoCollege of Life SciencesAbstract:Sequencing technology has leaping developed promoted by the Human Genome Project since the Sanger sequencing technology been invented.Sequencing technology has gone through three generation by the improvement of sequencing methods and sequencer, at the same time, sequencing technology developed towards high-flux, single molecule sequencing and lower price. Sequencing technology has become the most important experimental means in molecular biology experiments currently. This paper simply reviews the historical development of sequencing technology,introduces the principle and workflow of the main sequencer.Keywords: sequencer;IlluminaGA;ROCH-454;ABI-3730XL;ABI-SOLID;HeliScope1953年Watson和Crick揭示了DNA的双螺旋结构[1]，这大大激励了人们对DNA 序列的探索。
高通量测序生物信息学分析(内部极品资料,初学者必看)
基因组测序基础知识㈠De Novo测序也叫从头测序，是首次对一个物种的基因组进行测序，用生物信息学的分析方法对测序所得序列进行组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。
目前国际上通用的基因组De Novo测序方法有三种：1. 用Illumina Solexa GA IIx 测序仪直接测序；2. 用Roche GS FLX Titanium直接完成全基因组测序；3. 用ABI 3730 或Roche GS FLX Titanium测序，搭建骨架，再用Illumina Solexa GA IIx进行深度测序，完成基因组拼接。
采用De Novo测序有助于研究者了解未知物种的个体全基因组序列、鉴定新基因组中全部的结构和功能元件，并且将这些信息在基因组水平上进行集成和展示、可以预测新的功能基因及进行比较基因组学研究，为后续的相关研究奠定基础。
实验流程：公司服务内容1.基本服务：DNA样品检测；测序文库构建；高通量测序；数据基本分析（Base calling，去接头，去污染）；序列组装达到精细图标准2.定制服务：基因组注释及功能注释；比较基因组及分子进化分析，数据库搭建；基因组信息展示平台搭建1.基因组De Novo测序对DNA样品有什么要求？(1) 对于细菌真菌，样品来源一定要单一菌落无污染，否则会严重影响测序结果的质量。
基因组完整无降解(23 kb以上)， OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；每次样品制备需要10 μg样品，如果需要多次制备样品，则需要样品总量=制备样品次数*10 μg。
(2) 对于植物，样品来源要求是黑暗无菌条件下培养的黄化苗或组培样品，最好为纯合或单倍体。
基因组完整无降解(23 kb以上)，OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；样品总量不小于500 μg，详细要求参见项目合同附件。
(3) 对于动物，样品来源应选用肌肉，血等脂肪含量少的部位，同一个体取样，最好为纯合。
基因组学总结
Roche 454（GS FLX Titanium System）超高通量测序技术原理2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序的先河。
2007年又推出了性能更优的第二代基因组测序系统——Genome Sequencer FLX System。
2008年10月，454推出了全新的GS FLX Titanium系列试剂和软件，让GS FLX的通量一下子提高了5倍，准确性和读长也进一步提升。
GS FLX 测序原理：GS FLX系统的测序原理和GS 20一样，也是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术；在DNA 聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来(图1)。
通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。
此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。
Roche GS FLX System是一种基于焦磷酸测序原理而建立起来的高通量基因组测序系统。
在测序时，使用了一种叫做“Pico TiterPlate”（PTP）的平板，它含有160多万个由光纤组成的孔，孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。
测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。
如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。
这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。
此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。
有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。
关于ion torrent和454
技术特点
1、简单：基于半导体技术测序原理，不用荧光、化学发光和酶级联反应；消耗样本少；
2、快速：从文库构建到数据产出只需2天，上机测序只需2～3小时；
3、灵活性：可满足不同通量的测序需求。
314 TMChip（~10Mb/run），316 TMChip（~100Mb/run），318 TMChip （~1Gb/run），PI Chip （~10Gb/run），PII Chip （~100Gb/run）。
4、准确性：99.97%
Roche 454 GS FLX+ 测序平台是罗氏旗下的454生命科学推出的最新升级版测序仪，该仪器的最大读长能够达到1000bp，测序准确性高达99.997%，达到了与Sanger相当的长度与准确性，并降低了测序成本，从而集一代sanger 测序读长及质量优势与二代测序高通量特点于一身。
454 GS FLX+
介绍：
454 GS FLX+ 是基于焦磷酸测序(Pyrosequencing) 原理建立的高通量基因组测序系统，依靠生物发光进行DNA序列分析的技术：在多种酶的协同作用下，当碱基正确配对时，发生一个合成反应和一个化学发光反应的偶联，释放光信号。
光信号实时被高灵敏度CCD捕获，最终达到测序的目的。
性能参数：
测序流程：。
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Roche 454（GS FLX Titanium System）超高通量测序技术原理
2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序（sequencing-by-synthesis）的先河。
之后，454公司被罗氏诊断公司以1.55亿美元收购。
2007年，他们又推出了性能更优的第二代基因组测序系统—— Genome Sequencer FLX System (GS FLX)。
2008年10月，454推出了全新的GS FLX Titanium系列试剂和软件，让GS FLX的通量一下子提高了5倍，准确性和读长也进一步提升。
想当年，GS 20的出现，揭开了测序历史上崭新的一页。
Jonathan Rothberg博士就是大规模并行测序的发明者，同时也是454的创始人。
上世纪90年代，很多学者也都想到了大规模并行测序，他们试图将Sanger测序移到芯片上，但都以失败告终，因为这项技术没有可扩展性。
1999年，Rothberg的儿子出世，他放了两个星期的陪产假。
小家伙出生后被送入婴儿特护病房，Rothberg非常担心，甚至想获取儿子的基因组信息。
这段担惊受怕的经历给了他灵感，他突然意识到焦磷酸测序（pyrosequencing）不仅简单，而且具有可扩展性。
两个星期之后，Rothberg就开始设计芯片和流动室，让测序在更小的反应室中进行，并同时进行几百万个反应。
硬件的设计和制造也只是成功的一半，在样品制备上还有同样漫长的路要走。
Rothberg摒弃了传统的细菌克隆与挑选，将DNA打断成随机片段，并寻找一种方法来克隆每个片段。
受到其他学者乳液实验的启发，他也想将DNA放入油包水的乳液中，这样就省去了反应管。
一个好汉三个帮。
在Joel Bader等人的帮助下，Rothberg验证了这些想法的可行性，并利用了炸药中的表面活性剂来维持乳液的热稳定性。
就这样，乳液PCR终于诞生了。
对细菌的16S rDNA的V6/V3可变区进行测序分析，不需进行克隆筛选，测序的通量高，获得的数据量大，周期短，能更加全面的反映微生物群体的物种组成，真实的物种分布及丰度信息。
GS FLX 测序原理
GS FLX系统的测序原理和GS 20一样，也是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术；在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP 的聚合与一次荧光信号释放偶联起来(图 1)。
通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。
此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。
Roche GS FLX System是一种基于焦磷酸测序原理而建立起来的高通量基因组测序系统。
在测序时，使用了一种叫做“Pico TiterPlate”（PTP）的平板，它含有160多万个由光纤组成的孔，孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。
测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。
如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。
这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。
此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。
有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。
图1：GS FLX 高通量测序方法原理示意图
GS FLX系统的工作流程
GS FLX系统的流程概括起来，就是“一个片段 = 一个磁珠 = 一条读长（One fragment = One bead = One read）”。
1）样品输入并片段化：GS FLX系统支持各种不同来源的样品，包括基因组DNA、PCR产物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。
大的样品例如基因组DNA或者BAC等被打断成300－800 bp的片段；对于小分子的非编码RNA或者PCR扩增产物，这一步则不需要。
2）文库制备：借助一系列标准的分子生物学技术，将A和B接头（3’和5’端具有特异性）连接到DNA片段上。
接头也将用于后续的纯化，扩增和测序步骤。
变性处理回收单链的DNA （sstDNA），具有A、B接头的单链DNA片段组成了样品文库。
3）一个DNA片段＝一个磁珠：单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上。
每一个磁珠携带了一个独特的单链DNA片段。
磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，这样就形成了只包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。
4）乳液PCR扩增：每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响。
整个片段文库的扩增平行进行。
对于每一个片段而言，扩增后产生了几百万个相同的拷贝。
随后，乳液混合物被打破，扩增的片段仍然结合在磁珠上。
5）一个磁珠＝一条读长：携带DNA的捕获磁珠随后放入“Pico TiterPlate”（PTP）板中进行后继的测序。
PTP孔的直径（29um）只能容纳一个磁珠（20um）。
然后将PTP板放置在GS FLX 中，测序开始。
放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。
如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。
这个焦磷酸在ATP硫酸化酶和萤光素酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将萤光素氧化成氧化萤光素，同时释放出光信号。
此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD相机捕获到。
有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。
这也就是大名鼎鼎的焦磷酸测序。
6）数据分析：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息。
GS FLX 系统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用：达400 MB的从头拼接和任何大小基因组的重测序。
GS FLX系统的准确率在99%以上。
其主要限制来自同聚物，也就是相同碱基的连续掺入，如AAA或GGG。
由于没有终止元件来阻止单个循环的连续掺入，同聚物的长度就需要从信号强度中推断出来。
这个过程就可能产生误差。
因此，454测序平台的主要错误类型是插入-缺失，而不是替换。
新升级让性能全面提升
去年底发布的Titanium系列试剂，是对现有GS FLX平台的重要升级。
升级内容包含耗材、试剂和软件。
你无需对仪器的硬件做任何昂贵的升级，只改进试剂和软件，就能立刻实现性能提升。
升级之后，每轮测序能产生100万个读长片段，高质量（Q20）的读长增加至400 bp。
第400个碱基的准确率是99%，之前的更高。
通量也提高了5倍，目前每轮运行能获得4-6亿个碱基对，所需时间为10小时。
•PTP平板的创新重设计重新设计之后，PTP平板上孔的密度更高，利用更小的DNA捕获磁珠进行金属覆盖，改善了信号质量，因此读长的数量和长度都明显改善，同时准确性更高。
目前孔的直径是29 um，DNA捕获磁珠的大小是20 um。
•改进的测序试剂改进的GS FLX Titanium试剂显著降低了背景噪音，因此在几乎相同的运行时间内，读长更加长。
•升级的软件优化用于超高通量测序的软件，能轻松对更大、更复杂的基因组进行拼接和作图。
•GS FLX 2.0版它与以前版本的输出数据也完全兼容，让片段能够共同拼接和作图。
广阔的应用天地
在新一代测序技术中，GS系统是最多产的。
截至2008年9月，已经发表了250多篇高质量的paper。
其中Nature 20篇、Science 13篇、Cell 6篇、Genome Research 20篇、PNAS 24篇。
光是这些数据就让人咂舌。
这些研究跨越了测序应用的多个方面：82篇全基因组测序论文包括比较基因组学的从头测序和重测序；54篇小分子RNA研究；37篇聚焦快速兴起的宏基因组学；27篇关于转录组图谱分析，包括全转录组拼接和表达图谱；13篇研究染色体结构和表观遗传学；10篇有关稀有变异检测的超深度测序这个新领域；11篇研究古老RNA。
其余的文章关注454测序系统的技术和生物信息学。
多种多样的应用彰显出454测序系统的能力，那些传统意义上无法用测序来解决的问题现在也一并解决了。