消减杂交技术
抑制性消减杂交(SSH)技术及其应用
抑 制 性 消 减 杂 交 技 术
（ｕｐ ｅｓｏ Ｓ ｐｒ ｓ ｉｎ
１３ 将 ｔ ｓ ｅ Ｄ Ａ分成 两组 （ 和 ２ ，分 别于其 ． ｅｔｒｃＮ １ ）
Ｓ ｂ ｒ ｃ ｉ ｅ Ｈ ｂ ｉ ｉ ａ ｉ ｎＳ Ｈ 是 Ｄ ａ ｃ ｅ ｋ ｕ ｔ ａ ｔ ｖ ｙ ｒ ｄ ｚ ｔ ｏ ，Ｓ ） ｉ ｔｈｎ ｏ
一
阳性率低 、 筛选效 率高 、 操作 简单等优 点 ， 别适用 于 特 克 隆分析造成 某种特 殊表型 的 目相 同但 在
短链 （ １ 约 ０余个核苷 酸 ） 组成 的双链 ＤＡ片 段 ， Ｎ 长
同， 内侧序 列与第二次 Ｐ Ｒ引物序列 相 同。 外 ， 而 Ｃ 此 在
［ 摘
要］ 制性消减杂交技术 （Ｓ ） 抑 Ｓ Ｈ 是一种高效检测差异表达基 因的方法 。 详细论述了抑制性消减杂交的基本原理及过程，
并简要介绍了其在工业生产菌种改 良中的应用 。 ［ 关键词］ 抑制性消减 中 ８ ［ 文献 标 识 码 ］ Ａ ［ 章编 号 ］ １ ０ — ０ ５ ２０ ） ７０ ３ － ３ 文 ０ ３ ５ ９ （０ ８ ０ － ０ １０
５ 端接上 去磷酸 化 的接 头 １ 接 头 ２ （ｄ ｐｏ ， 和 ａ ａｔｒ １
等于 １９ 依据 消减杂 交和 抑制 Ｐ Ｒ发 展起 来 的 ９６年 Ｃ
一
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抑制性消减杂交_SSH_技术及其应用
抑制性消减杂交技术（ＳｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎＳｕｂｔｒａｃｔｉｖｅＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＳＳＨ）是Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ等于１９９６年依据消减杂交和抑制ＰＣＲ发展起来的一种分离差异表达基因的新方法［１，２］，该技术具有假阳性率低、筛选效率高、操作简单等优点，特别适用于克隆分析造成某种特殊表型的目的基因及其功能。
而消减文库是使用两种遗传背景相同或大致相同但在个别功能或特性上不同的材料（如同类菌种的高产、低产品系），提取ｍＲＮＡ经反转录合成ｃＤＮＡ，在一定条件下用大大过量的不含目的基因的一方作为驱动子（Ｄｒｉｖｅｒ），与含有目的基因的试验方（Ｔｅｓｔｅｒ）进行杂交，选择性的去除两部分共同基因杂交形成的复合物，最后将含有相关目的基因的未杂交部分收集后，连接到载体形成文库。
高等真核生物的所有生命现象，例如细胞生长、器官形成、恶性转化、特定代谢产物分泌等都是基因选择性表达的结果，要弄清这些生命现象的分子调节机制，就要对选择性表达的基因进行分离、克隆、序列分析，然后研究其氨基酸组成，表达产物的结构功能。
抑制性消减杂交技术为寻找表达基因和研究已知基因的新生物学功能提供了一个有利工具。
１ＳＳＨ的基本原理与过程［３，４］１．１提取样本ｍＲＮＡ，利用随机引物反转录为双链ｃＤＮＡ，将不含目的基因的一方作为驱动子（Ｄｒｉｖｅｒ），含有目的基因的样品称为试验方（Ｔｅｓｔｅｒ）。
１．２用识别四碱基的限制性内切酶ＲｓａＩ（或ＨａｅⅢ）酶切。
双链ｃＤＮＡ经酶切后，每个片段一般小于６００ｂｐ，可防止长链ｃＤＮＡ片段所形成的复杂结构干扰消减杂交。
１．３将ｔｅｓｔｅｒｃＤＮＡ分成两组（１和２），分别于其５′端接上去磷酸化的接头１和接头２（ａｄａｐｔｏｒ１，ａｄａｐｔｏｒ２）。
两接头分别是具有一段反向末端重复序列的寡核苷酸序列，由一长链（约４０余个核苷酸）和一短链（约１０余个核苷酸）组成的双链ＤＮＡ片段，长链外侧２０余个核苷酸序列与第一次ＰＣＲ引物序列相同，而内侧序列与第二次ＰＣＲ引物序列相同。
抑制消减杂交(SSH)技术的研究与应用
Ｈ ｉ ｎ ｊ ｎ ｎｍ ｌ ｃ ｎ ｅ ｅ ｏ ｇｉ ｇＡ ｉ ａ Ｓ ｉ ｃ ｌ ａ ｅ
ａ ｄ Ｖｅｅｉ ａｙＭｅ ｉｉｅ ｎ ｔｒ ｒ ｄｃｎ ｎ № ２ ２０ ０８
近。 由于 Ｖ Ｐ 在 立 体 结 构 上 与 天 然 病 毒 相 同或 类 Ｌｓ 似， 因此 Ｖ Ｐ Ｌ ｓ能激 发 体 液 免疫 、 细胞 免 疫 和黏 膜 免 疫， 具有 安全 、 高效 的特 点 ， 是很 有发 展前 景 的候 选疫 苗 。但 是 ， 目前 Ｖ Ｐ 主要 通 过基 因工 程 手 段从 酵母 Ｌｓ 或感染重 组杆状 病毒 的昆虫细 胞 中制备 ， 这对操 作者 有 较高 的要求 和较复杂 的试验 操作 条件 。 ３ 利用 反 向遗传 操作 技术制 备的疫 苗
随着 人类 基 因组 计 划 的完 成 及后 基 因组 计划 的 启 动 ， 异基 因表达就 成 了一 项热 门 的技 术 。由于分 差
工程疫 苗及 反 向遗 传疫苗 并存应 用 的局 面。
参 考文献 ：
［ ］ 丁壮 ， １ 金宁一 ， 王兴 龙 ， 鸡 新城疫病毒 Ｈ 等． Ｎ基因亚单 位疫苗
诱导免疫保护 的试验 研究 ［ ］ Ｊ ．动物 医学进 展 ，０ ２ ２ （ ） ２０ ，３ １ ：
４ —５ ． ９ １
清学 方法 无 法 区 别 是疫 苗 株 还 是 野 毒 株 感 染 所 致 。 因此通过 改变免疫 原蛋 白的某 些 中和表 位 ， 构建一 个 能用 合适 的血 清 学 方法 鉴 别 的疫 苗 是 十分 必 要 的 。 Ｐｅｅ ｅｔｓＢＰ等人 通过 反 向遗传 操作 构建 了 Ｎ Ｖ感 染 ｒ Ｄ
３ １ 卵内免疫 疫苗 ．
其 表达外 源基 因 ， 诱 发 对 载体 和表 达基 因的 免疫 。 来 葛金英 等人利 用反 向遗传 操作 技术 以 Ｎ Ｖ 的 ＬＳｔ Ｄ ａｏ ａ 疫 苗株 为载体 ， 入 Ｈ ＡＶ 的 Ｈ Ｎ 插 ＰＩ ５ １株 Ｈ Ａ基 因 ． 研
抑制性消减杂交技术的应用[1]
![抑制性消减杂交技术的应用[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/a11ab97801f69e3143329423.png)
・技术与方法・生物技术通报B I O TECHNOLOGY BULL ET I N2009年第5期抑制性消减杂交技术的应用李小庆 景志忠(中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州730046) 摘 要: 基因的差异表达是调控各种生命活动的核心分子机制,而分离、克隆并进一步研究差异表达基因已成为现代分子生物学研究的热点,也是功能基因组学研究的重要内容。
在研究差异表达基因的诸多项技术中,抑制性消减杂交(SSH )技术具有特异性强、假阳性率低、灵敏度高和快速简便等优点,被广泛地应用于生命科学和医学领域的基因差异表达的研究中。
近年来,抑制性消减杂交(SSH )技术得到了相应的改进和完善,而在许多研究领域,该技术在广度和深度上都有了一些新进展。
主要就抑制性消减杂交技术的产生背景、原理、技术流程、特点及其最新应用研究进展等方面作简要综述。
关键词: 抑制性消减杂交 差异表达 功能基因 DS N 均一化技术 c DNA 微阵列Suppressi on Subtracti ve Hybr i di zati on Techn i que andProgress i n the Appli cati onL i Xiaoqing Jing Zhizhong(Lanzhou Veterinary R esearch Institute CAAS,Key Laboratory of Ani m al Parasitology of Gansu P rovince,Key Laboratory of Veterinary PublicHealth of M inistry of Agriculture,S tate Key Laboratory of Veterinary E tiological B iology,Lanzhou 730046) Ab s trac t: D ifferential exp ressi on of genes is the centralmolecular mechanis m of regulating all kinds of life acti ons 1Among all thetechnol ogies of identifying differential exp ressed genes,supp ressi on subtractive hybridizati on (SSH )is considered t o be with high s peci 2ficity,l ow backgr ound,high sensitivity,convenient mani pulati on,and had been widely app lied in life science and medicine research fields 1I n this paper,the p rinci p le,method,characteristics and the research p r ogress of SSH technique were intr oduced 1Key wo rd s: Supp ressi on subtractive hybridizati on D ifferential exp ressi on Functi onal genes DS N (dup lex 2s pecific nuclease )2nor malizati on method c DNA m icr oarray收稿日期:2008211211基金项目:国家自然科学基金项目(30871884),国家高新技术“863”项目(2006AA10A203),甘肃省支撑计划项目(0804NKCA076)作者简介:李小庆(19832),男,硕士,专业方向:畜禽疫病的分子生物学与免疫学通讯作者:景志忠,博士,研究员,主要从事病原与宿主的分子生物学与免疫学研究;E 2mail:zhizhongj@yahoo 1com 1cn 上世纪90年代以来,随着分子生物学技术的快速发展以及多物种包括人类的基因组全序列测定计划的陆续完成,分子生物学的研究热点已经从结构基因组研究转向基因功能和表达调控的功能基因组研究,于是多种用于差异表达分析的基因克隆技术相继问世。
利用抑制消减杂交(SSH)技术筛选乙烯利诱导黄瓜茎尖雌性表达相关基因
利用抑制消减杂交（SSH）技术筛选乙烯利诱导黄瓜茎尖雌性表达相关基因黄瓜(Cucumis sativus L.)属葫芦科(Cucurbitaceae)中幼果带刺的栽培品种,以幼嫩的果实供食用,结果能力强,产量高。
应振士等(1990)认为黄瓜是研究植物性别决定和性别分化的好材料。
黄瓜为雌雄同株植物,性器官的败育发生在形态发生晚期,单性花的性别决定取决于植物个体的基因型与环境条件的相互作用。
影响黄瓜性别的基因中起主要作用的是m、F和A基因。
但不论作用多强,其表达也要受到其他基因和环境的影响。
黄瓜的性别决定对植物生长调节剂处理非常敏感,适宜的植物生长调节剂处理可使黄瓜的性别向不同的方向转化。
乙烯利(或乙烯)可使植株雌性化,乙烯的作用看来是明确而且关键性的,其作用位点是茎尖。
并且许多因素可以影响植物生长调节剂对性别的作用,如处理时的发育时期,植物生长调节剂处理的浓度和处理次数,环境因素(特别是温度和光周期)等。
虽然利用遗传分析已对黄瓜的性别决定遗传有一些了解,但有关性别基因作用的机理、细胞遗传以及植物激素(尤其是乙烯)是怎样参与调控性别决定过程等方面的研究尚少报道。
因此,要用分子生物学的方法分离出有关的基因,仍需大量的工作。
本研究以黄瓜雄性系品种D06103为试材,利用150 mg/L的乙烯利处理黄瓜两叶一心时期的茎尖,以处理组茎尖为Tester,对照组茎尖为Driver,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建性别决定时期乙烯利处理的黄瓜茎尖cDNA文库,筛选乙烯利诱导黄瓜雌性表达相关基因,并对文库筛选出的11个基因进行了表达分析。
在此基础上利用电子克隆技术克隆出3个黄瓜雌性表达相关基因的cDNA全长,并分别对其组织特异性表达进行了研究。
试验结果如下：1.确立了外源激素乙烯利对黄瓜两叶一心时期的诱雌效果最佳的浓度为150 mg/L,并且不同浓度的乙烯利对黄瓜第一雌花节位影响不显著,但是对植株上雌花占总花数的百分比影响差异显著。
运用消减杂交技术构建IgA肾病肾阳虚证的相关基因文库
行 纯 化 ， 化 后 产物 用 紫 外 分 光 光 度 计 检 测 ｃ Ｎ 纯 Ｄ Ａ
纯度 与浓 度 。 １ ３ ２ 抑 制性 消减 杂 交 ．． 参 照 Ｄ ａ ｈｎ ｏ方 法 建 ｉ ｃ ｅｋ ｔ 立 抑 制性 消减 杂交 。按 实验 要 求 ， 同时 进 行 正 向及 反 向消减 杂交 。ＩＡ肾病 肾 阳虚 组 ｃ Ｎ ｇ Ｄ Ａ及 对 照组 ｃＮ Ｄ Ａ各 被分 为 ２份 。正 向消减 ： 验 方 （ ｅｔ 实 Ｔ ｓ —
证 的相关 基 因 。 １ 资料 与方 法
ｇｎ公 司 。淋 巴细胞分离液 购于威佳公 司 。琼脂糖 为 ｅ 西 班牙 出 品 ， ｓＩ内切 酶 、４ Ｄ Ａ连 接 酶 购 自 Ｎ Ｂ Ｒａ Ｔ Ｎ Ｅ
１１ 临床 资料 ．
选 择 ２０ ０９年 １ ０月 ～２ １ ００年 １月
公 司 。逆 转 录 酶 、 Ｏ ｌｓ Ｒ ａｅｉｈｂｔ 、 ｉａ ｏ Ｋ Ｄ ｐｕ 、 ｎｓ ｎ ｉｉ ｒ Ｌｇｔ ｎ ｏ ｉ ｈｇ ｉ ｈ购 自 Ｔ Ｙ Ｂ 公 司 。Ａ ｖｎａｅ ａ ｉ、 ｄ Ｏ ＯＯ ｄ ａｔ ２ Ｔ ｑ Ｍ ｘ Ａ － ｇ
Ｃ ｒｍ ｐｎ１０ ｈｏ ａｓｉ一０ ０纯 化 柱 购 自 Ｃｏ ｔ ｈ公 司。 Ｈ ｔ ｌ ｅ ｎｃ ｏ．
ｍａｔ ｘ ２ ５×） 自 Ｅ ｐｎ ｏ 公 司。Ｈ ｔ ａｔ ａ ｓｒ ｅ Ｍｉ（ ． 购 ｐ ｅｄ ｆ ｏｔ ｑ ｓ ｒＴ
基金项 目： 东省 自然基金博 士启 动项 目（ ４ １５ ５ １０ ７８） 广 ９ ５０ １Ｏ ０ ２ ８ 。 通讯作 者， — ｉ： ｊ＠ｆ ｕ ＣＢ Ｅｍａ Ｋ ｚ ｉ ｌ ｍｍ ． Ｏ
１ ＣＲ ｕ ｆｒ２． ｌ １ ０ ＸＰ ｂ ｆｅ ５ 、 ０ ｍｍｏ ｄＮＴＰｓ０． ￣Ｉ ５ 、０ ５
抑制消减杂交技术筛选肺炎链球菌多耐药相关DNA片段
消减混合物 ， ｐ ＡＳ － 克 隆载 体连接并转化到 ＴＰ ０ 与 Ｅ Ｙ Ｔ３ １ 感受 态细胞 中， 构建 多耐药肺炎链球菌差异 Ｄ ＮＡ 消减文 库 。结果 结论 耐药株与敏感株 问差异 片段 大量富集 ， 到大小 ２ ０ ０ ｐ弥散状 Ｄ 得 。 ～１５ ０ｂ ＮＡ条带 ； 这些差异 Ｄ 将 ＮＡ片
ｍｅ ｔ ｆ Ｌ ｂ ｒ ｔｒ ｄ ｃｎ ， ｓ ｈ ｎ ｓ ｉ ｌ ｙ ｌ ｔ ｏＳ ｃ ｕ ｎ Ｕ ｉ ｅｓｔ Ｃ ｅ ｇ ｕ Ｓ ｃ ｕ ｎ ６ ０ ４ ， ｉｏ ｒ ａ ｏａ ｏ ｙ Ｍｅ ｉｉｅ Ｗｅｔ ｉａ Ｈｏｐ ｔ ｃ ａ ＡＪ ｉ ａ ｅ ｔ ｉ ａ ｎｖ ｒｉ ｉ ｄ ｈ ｙ， ｈ ｎ ｄ ， ｉｈ ａ １ ０ １
ｓｐ ｒｓｉｎｓｂｒｃｉｅｈ ｂｉｉ ｔ ｎ（ Ｓ ｕ ｐｅｓ ｕ ｔ ｔ ｙ ｒ ｚ ｉ Ｓ Ｈ）ａ ｄｗｅｅｌ ａｅ ｔ Ｅ Ｙ Ｔ ｅｔｒ ｎ ａ ｓ ｒ ｄｔ ｏ ｅｅ ｔ ｏ ａ ｖ ｄ ａｏ ｎ ｒ ｇ ｔ ｗｉ ｐ ＡＳ － ３ｖｃｏ ｄｔ ｎ ｆ ｍｅ Ｏｃｍｐ ｔｎ ｉ ｄ ｈ ａ ｒ ｏ
ｉ ｔ ｈ ｌｃ ｌ ｒｍｅ ｈ ｎ ｓ ｏ ｌ — ｒ ｇ ｒ ｓｓａ ｔｓ ｒ ｐ ｏ ｏ ｃ ｓ ｐ ｅ ｍｏ ｉ．Ｍ ｅｈ ｄ Ｔｈ ｅ ｏ ｉ ＤＮＡｓ ｗｅ ｅ ｎ ｏ ｔ ｅ ｍｏ ｅ ｕ ａ ｃ ａ ｉｍ ｆｍｕ ｔ ｄ ｕ ｅ ｉｔ ｎ ｔ ｅ ｔ ｃ ｃ ｕ ｎ ｕ ｎ ａ ｉ ｔｏｓ ｅｇ ｎ ｍ ｃ ｒ
ｐ ｒｆ ｄ ｆｏ Ｍ ＤＲ ９ ６ ４ ７ ａ ｄ ＡＴＣ ４ ６ ９ Ｔｈ ｉ ｔ ｒ ｆ ｓ ｂ ｒ ｃ ｅ ｕ ｉ ｅ ｒ ｍ ｉ ０ ０ ２ ０ ｎ Ｃ ９ １ ． ｅ ｍ ｘ ｕ ｅ ｏ ｕ ｔ ａ ｔ ｄ ＤＮＡ ｒ ｇ ｎ ｓ ｗｅ ｅ ｏ ｔ ｉ ｅ ｓｎ ｆａ ｍｅ ｔ ｒ ｂ ａ ｎ ｄ ｕ ｉ ｇ
抑制性消减杂交技术(SSH)及其在烟草生物学研究中的应用
科学研究表明， 因的选择性差异表达决定植 基 物的生长 、发育、衰老、死亡 、对逆境 的适应等生 理过程 。分离差异表达基因对于了解和揭示植物体 的生长 、发育规律 ， 进而有针对性地对生物性状进 行改良具有重要意义。近年来随着 Ｐ Ｒ 技术 的兴 Ｃ 起， 出现了许多基于 Ｐ Ｒ的分离差别表达基因的新 Ｃ
由于速度快 、假阳性率低 、灵敏度高等优点 ，现 已 广泛应用于植物学研究 的各个领域【 ６ 】 。烟草是我 国
重要 的经济作物之一 ，面积 和总产量都 居世界第
一
。
与此 同时，它作为模式植物 ， 在植物学的研究
领域具有重要 的科研意义 ，尤其是在遗传 、繁育、
生理、 生化和转基 因等研究领域 。 笔者就 Ｓ Ｈ技术 Ｓ
Ｒｅ ｅ ｃ ｓ ａｒ ｈ
ＬＩＬｉ ｎ． ｑｉ ＬＵ ｍｉ Ｌｉ ｎｇ
（ ｒ ｎ ｍｙＣ ｌ ｇ ｆ ｉｈ ａ ｒ ｕｔｒｌ ｎ ｖ ｒ ｔ， ａ ａ ， ｉ ｕ ２ ０ ４ Ｃ ｉａ Ａｇｏ ｏ ｏｌ ｅ ｃ ｕ ｎ ｉ ｌ ａ Ｕ ｉｅｓ ｙ Ｙ ’ Ｓｃ ａ ６ ５ １ ， ｈｎ ） ｅ ｏＳ Ａｇ ｃ ｕ ｉ ｎ ｈｎ Ａｂ ｔａ ｔ Ａ ｎ ｗ ｍｅ ｏ ，ｅｍｅ ｐ ｒｓｉｎｓ ｂｒｃｉｅ ｙ ｒ ｉ ｔ ｎ（ Ｓ ， ａ ｅ ｎｄ ｖ ｌｐ ｄｂ ｓｄｐ ｍａ ｌ ｎｔｅ ｅ ｈ ｉｕ ｓ ｒ ｃ ： ｅ ｔ ｄ ｔｒ ｄｓ ｐ ｅ ｓ ｔ ｔ ｂ ｄｚ ｉ Ｓ Ｈ）ｈ ｓ ｅ ｅ ｅｏ ｅ ａ ｅ ｒ ｒ ｙｏ ｃ ｎｑ ｅ ｈ ｕ ｏ ｕ ａ ｖ ｈ ｉ ａｏ ｂ ｉ ｉ ｈ ｔ
Ｄ Ｉ ０ ９９ ．ｓ． ０—１９ ０１ ３ １ Ｏ ：１． ６￣ｉ ｎ ０７５ １． １． ． ９ ３ ｓ １ ２ ００
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消减杂交技术
通过对《干旱胁迫下黄檗幼苗c DNA消减文库的构建和分析》的试验的介绍，说明消减杂交技术的原理，以及技术流程。
试验摘要
以干旱胁迫下的黄檗幼苗cDNA 为tester, 正常生长的黄檗幼苗cDNA为driver, 利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)构建了干旱胁迫下黄檗幼苗的消减文库并对其进行了EST序列分析。
从消减文库中随机挑取20个阳性克隆, 提取质粒进行酶切和PCR鉴定, 显示文库克隆的重组率大
于95%, 插入片段大小大部分集中在300~800bp之间。
随机挑取816个克隆进行测序, 得到265个基因。
将其进行同源性分析, 划分为16类。
获得了热激蛋白70、脱水响应蛋白(RD22)、通用胁迫蛋白、金属硫蛋白(MTII), 晚期胚胎丰富蛋白(LEA14)等44种与干旱胁迫相关的基因,它们涉及了植物的渗透调节、信号传递、转录调控、活性氧清除等方面。
本研究为抗逆基因克隆和系统研究干旱胁迫下黄檗基因的表达奠定了重要的理论基础。
黄檗
(黄檗Phellodendron amuranse Rupr.) 又名关黄柏、黄波罗, 为芸香科黄檗属, 是第三纪古热带区系的孑遗植物。
是东北重要的珍贵阔叶树种。
从生活史看, 黄檗经历了从第三纪炎热到寒冷等一系列的气候变迁, 对自然界的非生物胁迫(如高温、干旱、寒冷)有很强的适应力。
材料与方法
• 1.1 实验材料
•黄檗种子采于牡丹江市, 用70%乙醇对种子表面除菌后, 4℃低温层积2个月, 播种在珍珠岩中, 25~30℃光照培养箱培养。
大约生长60 d左右对黄檗幼苗进行胁迫处理, 减小加水量使其相对水含量达到65%~70%(约6~7
d), 未处理的作为对照。
处理后, 取幼苗叶片和茎干置于液氮中速冻, −
70℃保存。
1.2实验方法
• 1.2.1 总RNA提取和mRNA纯化
•以干旱处理的黄檗幼苗为实验组, 未处理的为对照组。
取叶片和茎干, 液氮研磨后, 以总RNA 提取试剂盒Trizol(Invitrogen)的方法提取总RNA, 以Qiagen公司的Oligotex mRNA kit分离纯化mRNA。
将提取得到的总RNA和mRNA溶于一定体积的无RNase的水中。
用GeneQuantII
(Pharmacia Biotech)检测RNA质量和浓度。
• 1.2.2 cDNA消减文库的构建
•分别以干旱处理的实验组cDNA为tester, 未处理的对照组的cDNA 为driver。
进行抑制性消减杂交, 具体操作依照Clontech PCR-Select
cDNA Sub-traction Kit User Manual进行。
将第二次PCR扩增后的正向消减产物用PCR Purification kit (Promega)纯化后, 与pGEM-T载体
(Promega)连接, 4℃过夜。
用化学转化法转化感受态细胞
TOP10(Tiangen), 根据蓝白斑检测文库克隆的重组率, 筛选出有插入片段的阳性克隆。
• 1.2.3 插入片段的PCR和酶切鉴定
•随机挑取20个阳性克隆, 接种于LB液体培养基中, 37℃培养过夜, 然后提
取质粒DNA, 用pGEM-T载体两端测序引物T7、SP6作为PCR引物, 对插入片段进行PCR扩增, 通过琼脂糖凝胶电泳检测其插入片段长度。
利用载体插入片段两端分别有Nco I和Pst I酶切位点, 用Nco I和Pst I对提取的质粒进行酶切, 可以验证阳性克隆和插入片段的大小。
• 1.2.4 文库的测序与分析
•随机挑选阳性克隆, 用碱裂解法提取质粒, 送北京华大生物公司测序, 测序结果在GenBank (http: ///blast) 进行同源
性比对,确认为新序列后,将序列通过Sequin软件提交给Genbank的
dbEST数据库。
•通过直系同源簇数据库(Clusters of Orthologous Groups of proteins, COGs), 把EST序列的编码蛋白质与所有COGs中的蛋白质进行比对, 以预测单个蛋白质的功能和整个新基因组中蛋白质的功能。
用Blastp
(Blastx)对测序结果进行分析并
归类(参数E-value: 1e-5)根据
系统进化关系把它们归入适当
的COG家族。
结果
• 2.1 PCR扩增产物结果分析
消减杂交后先用外侧共有引物进行第一次PCR扩增, 然后利用巢式引物进行第二次PCR扩增。
电泳结果(图1)显示, 第一次PCR扩增后的电泳带很弱, 第二次PCR扩增后出现明显电泳带, 片段大部分集中在0.2 kb~1 kb之间, 在600 bp
左右有明显条带, 这说明消减基因得到了富集, 黄檗干旱诱导基因得到了很好的均一化和差减。
主要包括干旱信号的感应, 信号转导, 进而引起转录因子以及功能性基因的表达。
植物主要通过气孔关闭、渗透性物质积累、活性氧清除以及对膜和蛋白结构的保护等一系列反应作为对干旱的耐受响应[10,11]。
本研究所得的265个EST序列涉及到黄檗对干旱胁迫响应机制的各个方面, 其中防卫机制相关的基因占到总数的16.6%, 表明黄檗在干旱的条件下通过表达相关的抗旱基因以响应外界的逆境信号。
其中有66个比对不出较为明确的结果为功能未知基因, 这些基因的表达是否是黄檗对干旱胁迫的反应还需要进一步研究。
迄今为止, 已在植物中发现了几百种胁迫诱导基因, 在功能已确定的基因之中, 除了防卫功能基因外, 很大部分可归类为代谢基因和调控基因, 如蛋白激酶和转录因子[12]。
转录因子可以通过调节下游干旱胁迫相关基因的表达, 目前为止, 已有很多利用转录激活因子或抑制因子来提高植物抗旱性的报道[13]。
文库中涉及到如锌脂蛋白(Zinc-finger pro-tein)、WRKY转录因子(WRKY DNA-binding protein)等, 这为用基因工程手段利用编码转录因子和信号因子研究植物抗旱提供了新的基因和研究思路。
•综上所述, 利用SSH技术构建黄檗幼苗在干旱胁迫下差异表达基因文库, 并通过EST技术研究干旱胁迫过程中所有干旱相关基因的表达情况, 从总
体上阐述植物抗旱机制已成为可行性的方法。
抗旱基因的研究不仅仅是干
旱信号的识别和抗旱基因的开启, 更涉及到抗旱过程中一系列基因的表
达和干旱信号的传导和级联反应, 这将在基因水平上有助于我们对抗旱
机制的深入理解，且有了深入的了解了消减杂交技术。