检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术
检测蛋白相互作用的方法
检测蛋白相互作用的方法
检测蛋白相互作用的方法主要有酵母双杂交技术、免疫共沉淀和GST pull-down实验。
1. 酵母双杂交技术：主要用来进行互作蛋白的筛选，缺点就是假阳性较高，所以需要进行结果验证，一般可采用免疫共沉淀或GST-pull down实验进行验证。
2. 免疫共沉淀：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。
当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。
再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行Western blot检测，进而证明两者间的相互作用。
3. GST pull-down实验：是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术。
其基本原理是先构建靶蛋白-GST融合蛋白载体，然后进行体外表达及纯化。
将得到的靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，充当一种“诱饵蛋白”，然后将目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的蛋白，将目的蛋白洗脱下来，通过SDS-PAGE电泳及Western blot分析证实两种蛋白间的相互作用。
以上内容仅供参考，建议查阅相关文献获取更专业的信息。
细菌_双杂交实验报告(3篇)
第1篇实验名称：细菌双杂交系统检测蛋白质相互作用实验日期：2023年X月X日实验者：[实验者姓名]实验目的：1. 利用细菌双杂交系统，检测目标蛋白质A与蛋白质B之间的相互作用。
2. 验证蛋白质A与蛋白质B形成复合物的可能性。
实验原理：细菌双杂交系统是一种基于转录激活作用的蛋白质相互作用研究方法。
该系统利用大肠杆菌中的转录因子和报告基因的相互作用，通过检测报告基因的表达情况来判断蛋白质之间的相互作用。
实验原理如下：- 将目标蛋白质A与转录因子GAL4的DNA结合域（DBD）融合，形成融合蛋白A-DBD。
- 将目标蛋白质B与转录因子GAL4的激活域（AD）融合，形成融合蛋白B-AD。
- 当A-DBD与B-AD相互作用时，B-AD可以激活报告基因的表达。
- 报告基因的表达情况可以通过检测其产物（如β-半乳糖苷酶）的活性来评估。
实验材料：- 大肠杆菌菌株：如DH5α、BL21（DE3）等。
- 载体：如pET-28a、pGADT7等。
- 目标蛋白质A和B的克隆载体。
- 限制性内切酶：如EcoRI、BamHI等。
- DNA连接酶：如T4 DNA连接酶等。
- 转化试剂：如CaCl2、感受态细胞等。
- DNA标记物：如λ-DNA、pUC19等。
- 质粒提取试剂盒。
- β-半乳糖苷酶检测试剂盒。
实验步骤：1. 克隆构建：- 使用限制性内切酶EcoRI和BamHI切割目标蛋白质A和B的克隆载体，并连接到pET-28a和pGADT7载体上，分别得到pET-A和pGAD-B。
- 使用PCR技术扩增目标蛋白质A和B的编码序列，并克隆到pET-A和pGAD-B 载体上。
- 使用质粒提取试剂盒提取质粒。
2. 转化：- 将pET-A和pGAD-B质粒转化到大肠杆菌DH5α中，挑选阳性克隆进行培养。
3. 蛋白质表达：- 将阳性克隆转化到BL21（DE3）中，使用IPTG诱导表达融合蛋白A-DBD和B-AD。
4. 报告基因活性检测：- 收集表达融合蛋白的细菌，提取细菌裂解物。
检测蛋白互作的方法
检测蛋白互作的方法有多种，其中包括酵母双杂交技术、免疫共沉淀、GST-pull down实验等。
这些方法都可以用来研究蛋白之间的相互作用，并有助于进一步了解蛋白质的功能和机制。
1. 酵母双杂交技术：这是一种在酵母细胞中检测蛋白互作的方法，主要通过将两个蛋白的基因分别与报告基因的转录激活域融合，在两个蛋白相互作用时，报告基因就会被激活，从而得到蛋白互作的结果。
2. 免疫共沉淀：这是一种通过抗体和抗原之间的专一性作用来研究蛋白互作的方法。
将其中一个蛋白进行免疫沉淀后，与其互作的蛋白也会被沉淀下来，然后通过Western blot等技术检测到被沉淀的蛋白，从而确定两者之间的相互作用。
3. GST-pull down实验：这是一种体外检测蛋白互作的方法，通过将目标蛋白与谷胱甘肽亲和树脂结合，再与待检测的蛋白混合，如果两者之间有相互作用，目标蛋白就会与待检测蛋白结合并被吸附在树脂上，最后通过Western blot等技术检测到结合的蛋白，从而证明两者之间的相互作用。
生物分子相互作用的实验方法与分析技术
生物分子相互作用的实验方法与分析技术生物分子相互作用是指生物体内分子之间的相互作用，包括蛋白质与DNA、RNA、低分子化合物等的相互作用。
了解生物分子相互作用的方法可以帮助我们更好地理解生命过程，从而为疾病治疗、药物研发等提供有益的指导。
下面将介绍几种常用的生物分子相互作用实验方法与分析技术。
1. 亲和层析法（affinity chromatography）亲和层析法是一种利用特定配体与目标分子的亲和作用进行分离和纯化的方法。
一般分为亲和柱层析和免疫沉淀两种。
亲和柱层析是将特定配体固定在柱子上，利用配体与目标分子的亲和作用将其吸附在柱子上，在洗脱过程中分离目标分子。
免疫沉淀则是利用特异性抗体与目标分子结合，再将抗体-目标分子复合物通过一系列的洗涤步骤分离。
2. 免疫共沉淀法（co-immunoprecipitation）免疫共沉淀法利用抗体特异性地结合目标分子，然后以抗体为桥梁将与目标分子结合的其他分子一同沉淀下来。
通过分析沉淀物中的分子成分，可以确定目标分子与其他蛋白质的相互作用关系。
该方法通常与免疫检测技术（如免疫印迹）相结合使用，可以用来研究蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA/RNA等之间的相互作用。
3. 蛋白质结晶与X射线晶体衍射（protein crystallization andX-ray crystallography）蛋白质结晶与X射线晶体衍射是研究蛋白质三维结构的常用方法。
首先通过体外重组表达得到目标蛋白质，并将其进行纯化和结晶处理。
然后在适当的缓冲溶液中形成结晶，最后通过X射线衍射测定结晶体的晶体学参数，通过计算和解析来得到蛋白质的三维结构。
蛋白质结晶和X射线晶体衍射为药物研发提供了重要的结构信息，例如为针对特定蛋白质的药物设计提供靶标。
4. 双杂交法（yeast two-hybrid）双杂交法是研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验方法。
该方法利用酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）的生殖特点，将转录因子中的DNA结合域（DNA binding domain，DBD）和激活域（activation domain，AD）分别与两个蛋白质结合。
gstpulldown实验技术
汇报人： 2023-12-25
目录
• 实验简介 • 材料准备 • 实验操作 • 结果分析 • 实验结论
01
实验简介
实验目的
确定蛋白质之间的相互作用
通过gstpulldown实验可以检测到与特定蛋白质结合的其他蛋白 质，从而确定蛋白质之间的相互作用。
验证已知的蛋白质相互作用
结果解读
解读实验结果
根据实验目的和预期，对实验结果进行解读，判断实 验是否达到预期目标。
解读数据变化
分析实验数据的变化趋势，探究可能影响实验结果的 因素。
解读误差范围
评估实验结果的误差范围，判断实验结果的可靠性和 稳定性。
结果讨论
讨论实验结果的意义
01
探讨实验结果对科学研究和实际应用的价值和意义。
04
结果分析
结果展示
实验结果表格
整理实验数据，以表格形式展示 各个组别的实验结果，包括样本 编号、实验条件、实验结果等。
实验结果图
根据实验数据绘制图表，如柱状 图、折线图等，直观展示实验结 果的变化趋势。
数据分析表格
对实验数据进行统计分析，计算 各组别的平均值、标准差等统计 指标，以便对实验结果进行比较 和评估。
gstpulldown实验可以用于验证已知的蛋白质相互作用，例如验证 某个蛋白质是否与特定的结合蛋白相互作用。
发现新的蛋白质相互作用
通过gstpulldown实验可以发现新的蛋白质相互作用，从而为研究 新的生物学过程和疾病机制提供线索。
实验原理
蛋白质相互作用
gstpulldown实验利用GST（谷胱甘肽巯基转移酶）融合蛋白作为诱饵，与细胞或组织 提取物中的目标蛋白质进行结合，从而检测到与诱饵蛋白结合的目标蛋白。
蛋白相互作用检测
蛋白相互作用检测
蛋白相互作用检测是一种用于研究蛋白质相互作用的实验技术。
蛋白质相互作用是细胞内许多生物学过程的重要组成部分，包括基因调控、细胞信号传导、代谢途径等。
因此，研究蛋白质相互作用对于理解细胞生物学过程具有重要意义。
蛋白相互作用检测的方法有很多种，包括酵母双杂交、共免疫沉淀、表面等离子共振等。
其中，酵母双杂交是一种常用的方法。
该方法利用酵母细胞中的转录因子活性来检测蛋白质相互作用。
当两个蛋白质相互作用时，它们可以将转录因子的两个结构域连接起来，从而激活报告基因的表达。
该方法可以进行大规模筛选，但也存在假阳性和假阴性的问题。
共免疫沉淀是一种利用抗体将目标蛋白质沉淀下来的方法。
该方法可以用于检测两个蛋白质是否存在相互作用。
该方法的优点是可以直接检测细胞内的蛋白质相互作用，但也存在特异性和灵敏度的问题。
表面等离子共振是一种用于检测生物分子相互作用的技术。
该方法可以实时监测分子之间的互作，可以用于确定互作的动力学参数。
该方法具有高灵敏度和高特异性，但需要较昂贵的设备和技术。
总的来说，蛋白相互作用检测是研究细胞生物学过程的重要工具。
不同的方法可以在不同的情况下使用，以满足不同研究的需求。
- 1 -。
检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术
检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术蛋白质之间的相互作用对于生物体的正常功能和生理进程至关重要。
因此，了解和研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用对于疾病研究和新药发现具有重要意义。
本文将介绍常见的用于检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术。
1. 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）免疫沉淀是一种常用的方法，用于鉴定和分离与特定抗原相互作用的蛋白质。
该方法利用特异性抗体结合特定蛋白质并沉淀出来，然后通过电泳、质谱或免疫印迹等分析方法进行检测。
这种方法不仅可以用于识别特定的蛋白质-蛋白质相互作用，还可以捕获整个蛋白质复合物。
2. 酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）酵母双杂交是一种广泛应用于蛋白质-蛋白质相互作用的实验技术。
该方法利用了转录因子的两个功能域的相互作用来检测蛋白质-蛋白质相互作用。
这种方法包括构建两个融合蛋白质：一个与DNA结合域融合的结构域和一个与激活域融合的结构域。
当两个融合蛋白质相互结合时，它们能够重新组装转录因子并激活报告基因的表达。
3. 质谱（Mass Spectrometry，MS）质谱是一种常用于分析蛋白质-蛋白质相互作用的技术。
图谱可以通过分析蛋白质混合物的质量和荷质比来确定蛋白质相互作用的可能性。
质谱技术包括多肽和蛋白质质量指纹图谱（Peptide and protein mass fingerprinting），包括基于基质辅助激光脱附电离（Matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）和电喷雾（Electrospray Ionization，ESI）的方法。
4. X射线晶体学（X-ray crystallography）X射线晶体学是一种用于解析蛋白质-蛋白质相互作用的高分辨率结构的技术。
该方法涉及到将蛋白质复合物结晶成晶体，然后通过测量和分析这些晶体所产生的X射线散射模式来确定蛋白质的结构及相互作用。
验证蛋白互作的方法
验证蛋白互作的方法生物学研究中，蛋白质互作是一个重要的研究领域，因为它关系到生命体的许多生物学过程如细胞周期、细胞信号转导、细胞凋亡等。
蛋白质互作研究的目的是了解蛋白质之间的相互作用，以及这些作用对于生物体内功能的影响。
为了获得这些信息，科学家们需要开发一些工具和技术来研究蛋白质之间的相互作用。
本文讲述了几种常用的蛋白互作验证方法。
一、酵母双杂交（Y2H）法酵母双杂交法是最常用的蛋白质互作验证方法之一。
由于其名称中含有“双杂交”，因此可以理解为将两个蛋白质“杂交”在一起，然后观察它们是否相互作用。
首先，将两个蛋白质分别构建成两个不同的来源的表达向量。
然后，在酵母细胞中，将这两个表达向量分别与GAL4激活子和GAL4结合蛋白相连，形成一个杂交蛋白。
如果这两个蛋白质发生相互作用，它们将结合并形成GAL4转录激活子，从而激活报告基因进行表达。
最终，研究人员可以通过观察转录活性的变化来判断这些蛋白质之间是否存在相互作用。
虽然酵母双杂交法是一种比较简单的技术，但有一些潜在问题需要研究人员注意。
首先，该方法只能检测蛋白质之间的直接相互作用，无法检测多个蛋白质之间的复杂相互作用。
其次，酵母细胞内的反应条件与活性可能与真实环境中相差很大，这可能导致结果的误判。
二、共免疫沉淀法（Co-IP）共免疫沉淀法是一种可以定量检测蛋白质相互作用的技术。
它的原理是将两个蛋白质在细胞内共同表达，并通过特异的抗体沉淀来寻找这两个蛋白质之间的相互作用。
具体来说，将目标蛋白质和其交替作用的伴侣蛋白质在细胞内共同表达。
然后，通过特异的抗体与其中一个蛋白质发生特异性结合，可以选择性地沉淀出另一个蛋白质。
最后，通过Western blot等技术检测被沉淀下来的伙伴蛋白的数量。
如果目标蛋白质和其伴侣蛋白相互作用，那么其它蛋白质沉淀下来时就会被一同检测到。
这种方法可以用来研究多个蛋白质相互作用的情况，还能够定量地衡量它们之间的相互作用强度。
不过该方法对于选择适当的抗体是非常准确的，因此需要仔细设计和验证实验条件来确保免疫沉淀过程的特异性和有效性。
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一、检测蛋白质与蛋白质相互作用
①ＦREＴ技术(in vｉvo)
FRET，Fluoresｃence ｒesonancｅenergy transfer，即荧光共振能量转移技术。
该技术得原理就是用一种波长得光激发某种荧光蛋白后,它释放得荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白,使其释放另一波长得荧光,如下图所示:
以下图为例,若要利用FＲET检测两种蛋白就是否有相互作用,需将两种蛋白得基因分别与这两种荧光蛋白得基因融合,并在细胞内表达出两种融合蛋白。
然后只需用紫外光对CFＰ进行激发，并检测GＦP就是否放出绿色荧光.如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用;反之,则就是这两种蛋白没有相互作用。
②酵母双、三杂交技术(in vivｏ)
酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白就是否有相互作用,其原理就是典型得真核生长转录因子,如GＡL4、GＣN4等都含有二个不同得结构域，即ＡD与BD.这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录．由此,设计不同得两个载体,一个含有AD基因（假设为A载体),另一个含有BD基因(假设为Ｂ载体）。
一般将一个已知蛋白得基因连在Ｂ载体上，作为诱饵（Baｉt),将未知蛋白得基因连在A载体上,将这两个载体都转到特定得酵母细胞内,瞧未知蛋白与已知蛋白就是否有相互作用.如果两者有相互作用,那么就可以启动报告基因得转录,从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来;如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达,那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示:
由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间得相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。
该系统得原理如下图所示:
如图所示，将泛素蛋白拆分为两个片段,即C端段（Ｃub)与Ｎ端段(NubG）,并在Ｃ端段得Ｎ端接上一个LｅxA—VP16转录因子,此时它并不能激活基因转录(因为它被限制在了C端段上，不能进入细胞核发挥作用）。
将该C端段连到一个膜蛋白上,将N端段连接到另一个膜蛋白上。
若两个膜蛋白有相互作用,那么两个膜蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白得Ｎ端段与C端段靠近结合,形成一个完整得泛素蛋白。
此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记得片段降解，那么连接C端段得LexA-VＰ16转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因得表达。
酵母三杂交得原理与双杂交一样,只就是它研究得就是两个蛋白与第三个成分间得相互作用,通过第三个成分使两个蛋白相互靠近。
第三个成分可以就是:蛋白、RNＡ或小分子,如下图所示:
如上图所示,在加入第三种成分前，蛋白X与蛋白Y之间并无直接相互作用,因此无法使BD与AD靠近,报告基因不能表达;当加入第三种成分后,蛋白X与蛋白Y得距离被拉近,ＢD与AＤ靠近,报告基因表达,从而可以被检测到。
③ Puｌlｄoｗn技术(iｎｖｉｔro)
Ｐuｌlｄｏwn，即蛋白沉降技术,它就是建立在蛋白质亲与层析得基础上得一种检测蛋白质间相互作用得分析方法．亲与层析得原理如下图所示,不同蛋白对配体得亲与程度不同,因此可以先将非特异结合得蛋白用低浓度缓冲液给清洗出去,只剩目得蛋白与层析柱结合,然后再用洗脱液将目得蛋白洗脱下来,达到纯化目得蛋白得作用。
Puｌldown技术利用得就是亲与层析技术以及特异得配体(如GSH或者镍）。
以下图为例,将ＧSＴ得基因与蛋白X得基因融合,表达出融合蛋白。
将该融合蛋白得溶液过带有GSH配体得层析柱,那么这一融合蛋白就能结合在配体上,然后将待测蛋白得溶液过柱,并让其与融合蛋白反应一段时间。
接着开始进行洗脱.如果待测蛋白与蛋白X无相互作用,那么在开始清洗得时候就会被洗下来；如果在用洗脱液洗脱后才能在收集到得样品中发现待测蛋白(以及蛋白X)，说明待测蛋白与蛋白X可能有相互作用。
④Faｒwesterｎbloｔ（in vitｒo）
Ｆａr western ｂlot就是基于ｗesterｎblot发展而来,其原理如下图所示.将样品蛋白用非变性得ＰAＧE胶分离，然后转膜、封闭、洗膜,加入待测蛋白，使其与已在膜上得样品蛋白进行相互作用．接着加入带有标记（如HRP)得待测蛋白得抗体反应，最后进行显色（如加入HRP得底物），观察实验结果。
⑤免疫共沉淀（Co—ＩP）（in vivo)
免疫共沉淀就是探测活体细胞内蛋白间得相互作用得一门技术.它得原理就是当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在得许多蛋白质-蛋白质间得相互作用被保留了下来。
如果用蛋白Ｘ得抗体免疫沉淀Ｘ,那么与X在体内有相互作用得蛋白Y也能沉淀下来。
Ｃｏ—ＩP得原理如下图所示,首先从细胞中提取蛋白质,获得蛋白提取液,并将其与抗体孵育,使抗体与蛋白X结合。
将预处理过得ｐroteiｎG琼脂糖珠(Sepharose）加入到抗体与蛋白提取液得孵育液中反应,使抗体与prｏtein G结合.通过离心将琼脂糖珠沉降到管底,去除上清液,然后再用缓冲液将琼脂糖珠冲洗数次，最后用wesｔern blot(或SDS—PAGE)进行检测。
二、检测蛋白质与DNA相互作用
①DＮAｆoot prｉｎtinｇ（ｉｎｖiｔro)
DNＡｆootｐrintｉng得原理如下图所示。
将ＤＮA得一个3'端用32p标记,然后将DNＡ分成两份,一份直接用ＤＮａs
ｅⅠ进行不完全酶切;另一份先与待测蛋白混合反应一段时间，然后再用DＮaｓeⅠ进行不完全酶切.然后将两份样品用变性得PAGＥ胶进行电泳,观察电泳结果。
下图中，由于待测蛋白与DNＡ结合得部位无法被DNase Ⅰ酶切降解,因此它得电泳结果中与直接用DNase Ⅰ进行处理得样品相比，会缺少一段；如果待测蛋白与DNA无相互作用,那么这两组得电泳结果应当一致.
②EMSＡ(in vitrｏ）
EMSA，ElectrｏphoreｔiｃMｏbｉlity ShiｆｔAssay，又称凝胶阻滞实验．其原理就是与蛋白质结合得ＤNA在Nａtive —ＰＡGE胶（非变性胶)上比没有结合蛋白得DNA移动速率要慢，因此通过电泳即可瞧到DＮA得变化,如下图所示．
③Sｃreｅn a Phage cDＮA-ｌiｂrａry bｙDNＡpｒobe(in
vitro)
该方法又成为原位筛选法,用于检测ｃDNA文库中得蛋白与DＮA探针之间得相互作用。
其原理与实验流程如下图所示，首先就是用噬菌体(phagｅ)侵染大肠杆菌,然后将这些大肠杆菌涂到平板上。
接着进行转膜,将膜泡于ＩPTG水溶液中数小时,然后将该膜放于平板上,培养数小时(IPTG能诱导大肠杆菌表达文库蛋白）。
将膜取出,进行变性、复性与封闭(过夜），然后与放射性标记得DNA探针进行反应,最后洗膜、晾干并用胶片曝光。
如果胶片上出现了条带,说明该文库蛋白与DNA探针有相互作用；反之则说明两者无相互作用.
④酵母单杂交系统（iｎvｉvｏ）
酵母单杂交系统得原理与双杂交一样,不同得就是它主要用于考察ｃDNA文库中得蛋白与DNA(即特异得已知靶因子）就是否有相互作用。
其原理如下图所示.首先需要构建一段序列(黑框),它含有至少3个拷贝得特异得已知靶因子以及报告基因得序列。
将该序列整合到酵母得基因组中,得到重组酵母。
接着构建一个融合表达载体，它含有待考察蛋白得基因序列与转录激活结构域得序列。
将该融合表达载体转入酵母中，观察报告基因就是否能正常表达。
如果报告基因正常表达,说明该ｃDNA文库蛋白与已知得靶因子间可能有相互作用；反之，则说明两者无相互作用。