重组乙肝疫苗(汉逊酵母)的介绍(课堂PPT)
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乙肝疫苗生产发展简介 ppt课件
低于20%
新乡华兰 少
高于20%
乙肝疫苗生产发展简介
乙肝疫苗生产发展简介
•甲基营养型酵母：以甲醇为唯一能源和
炭源的酵母。
1,多个HBsAg基因拷贝被整合到染色体中，遗 传稳定性好。
2,发酵过程中不产生乙醇，黏度小，可实现高 密度培养。
乙肝疫苗生产发展简介
乙肝疫苗生产发展简介
菌种 小三角瓶 大三角瓶 种子发酵罐 生产发酵罐 细胞破碎
50mg/Lх500L=25g
• 纯化后所得抗原量25gх20%=5g • 可生产疫苗量
5,000,000/5=1,000,000支
乙肝疫苗生产发展简介
• 北京天坛的 弱项和不足：表达水平低，
抗原数量少，每剂疫苗只含5微克或 10微克的抗原，比华兰疫苗抗原含量 少一倍，所以抗体滴度低和抗体持续 时间较短。
乙肝疫苗生产发展简介
特异性乙肝免疫球蛋白（HBIG）
特异性乙肝免疫球蛋白是将anti-HBs 阳性供血者的血液经低温乙醇分段法而 制成，其中anti—HBs的含量是确定的， 所以对乙肝病毒暴露后的预防作用也是 确定的。经低温乙醇分段法而制备的特 异性乙肝免疫球蛋白是安全的，没有证 据表明它会传播AIDS。
母婴阻断效果不理想
• 重组牛痘病毒乙肝疫苗。表达水平低，1-3mg/L，
无法实现工业化生产。
n90年代初期---重组汉逊酵母乙肝疫苗。更先进的
基因工程乙肝疫苗。
乙肝疫苗生产发展简介
厂家
疫苗
美国默克公司 Merck
重组酿酒酵 kline
重组酿酒酵母乙肝疫 苗
法国巴斯德研究所 重组CHO细胞乙肝 Pasteur Merieux 疫苗
2,5 (ug) 0,5 10,0 (ug) 0,5
重组乙肝疫苗(汉逊酵母)的介绍
重组酵母的构建
获取目的基因
1.根据已经测定的编码乙肝病毒表面抗原决定簇基因序列，用化 学合成法直接合成目的基因
构建重组质粒 导入宿主细胞
2. 用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到质粒分子上， 构成DNA重组分子。
3.借组细胞转化手段将DNA重组分子导入酵母细胞内。
培养酵母细胞ຫໍສະໝຸດ 4.短时间培养转化酵母细胞，以扩增DNA重组分子。
2. 乙肝疫苗的发展： 第一代乙肝疫苗
（血源性乙肝疫苗）
第二代乙肝疫苗 （基因工程疫苗）
cho细胞乙肝疫苗
重组酿酒酵母乙肝疫苗 （第一代重组酵母乙肝疫苗 ） 重组汉逊酵母乙肝疫苗 （第二代重组酵母乙肝疫苗）
3.汉逊酵母为甲基营养型酵母，基因组易操作，培养基廉价，有分泌型表达模式，正确的 折叠和修饰，产量理想，发酵液产出杂蛋白少，产物易于纯化，无热源和其他病原体，安 全性好
疫苗保存
疫苗的稳定性较差，一般在2~8℃下能保存12个月，但当温度升高后，效力很快降低。 在37℃下，许多疫苗只能稳定几天或者几个小时，非常不利于在室温下运输。为了使疫苗 的稳定性提高，可用冻干的方法使之干燥。这样，疫苗的有效期往往可延长1倍或以上，在 室温下其效价的损失亦较慢。 冻干要点是： （1）冷冻，即将疫苗冷冻至共熔点以下。 （2）真空升华，即在真空状态下降水分直接由固态升华为气态。 （3）升温缓慢，即升温的过程尽量缓慢，不使疫苗在任何时间下有融解的情况发生。 （4）冻干好的疫苗应在真空或充氮气后密封保存，使其残余水分保持在3%以下。这样的 疫苗能保持良好的稳定性。
9.用丁基琼脂糖进行疏水层析，纯化后的抗原用硫氰酸盐处理以 完成二硫键的交联
10. 再与氢氧化铝共沉淀，此时抗原吸附在氢氧化铝上
乙肝疫苗生产发展简介PPT
基因工程技术
01
利用基因工程技术，提高疫苗的产量和纯度。
新型佐剂的研发
02
开发新型佐剂，增强疫苗的免疫原性。
细胞培养技术
03
利用细胞培养技术，实现疫苗的连续生产。
疫苗生产的国际化合作与交流
国际合作项目
参与国际合作项目，共 同研发和推广乙肝疫苗 。
技术交流与转让
加强技术交流与转让， 促进疫苗生产的国际合 作。
BIG DATA EMPOWERS TO CREATE A NEW
ERA
新疫苗的研发方向
1 2
新型疫苗的研发
针对乙肝病毒变异株，研发更有效、更安全的疫 苗。
联合疫苗的研发
将乙肝疫苗与其他疫苗结合，减少接种次数，提 高接种率。
3
免疫策略的优化
研究更合理的免疫接种程序，提高疫苗的保护效 果。
疫苗生产技术的创新与突破
乙肝疫苗的重要性
控制乙肝传播
乙肝疫苗是预防HBV感染的最有 效方法，通过接种疫苗可以降低 感染风险，控制乙肝的传播。
预防慢性肝炎
接种乙肝疫苗可以预防慢性肝炎 的发生，避免因感染HBV而导致 的长期健康问题。
提高人口素质
乙肝疫苗的接种可以保护广大人 群，特别是儿童和青少年，提高 人口素质和健康水平。
乙肝疫苗生产发展简介
BIG DATA EMPOWERS TO CREATE A NEW
ERA
汇报人：可编辑 2024-01-11
• 乙肝疫苗的起源与背景 • 乙肝疫苗的生产技术 • 乙肝疫苗的生产现状 • 乙肝疫苗的未来发展 • 乙肝疫苗的安全性与监管
目录
CONTENTS
01
乙肝疫苗的起源与背景
中国疫苗生产现状
乙肝疫苗接种培训课件
科学准确
宣传内容要科学准确，不 得夸大宣传效果，误导公 众。
注重隐私保护
在宣传过程中要注重保护 个人隐私，不得泄露个人 隐私信息。
06
总结与展望
对乙肝疫苗接种工作的总结
乙肝疫苗接种的背景 和意义
乙肝疫苗是一种预防乙型肝炎病毒感 染的重要措施，通过对新生儿、儿童 和成人等不同人群的接种，可以有效 地保护个体健康，减少乙肝病毒的传 播。
利用媒体宣传
通过电视、广播、报纸等媒体广泛宣传乙肝疫苗接种的意义和作 用，提高公众的认知度和接种意愿。
开展专题讲座
组织乙肝疫苗接种相关专题讲座，邀请专家学者进行讲解，增强宣 传的说服力和可信度。
针对不同人群的宣传策略与技巧
针对不同年龄段
针对不同年龄段的人群，采用不同的宣传内容和方式，如针对儿童和青少年可以采用图文 并茂的方式，针对中老年人可以重点强调乙肝疫苗接种的预防作用。
要加强乙肝疫苗接种工作。制定相应的管理和宣传措施，确保这些人
群能够及时接种乙肝疫苗。
03
加强疫苗研发和创新
为了更好地预防和控制乙肝病毒的传播，需要加强疫苗研发和创新。
通过引进和创新技术，开发更为有效、安全和便捷的疫苗，以满足不
同人群的需求。
对下一步工作的建议与期望
加强培训和教育
为了提高公众对乙肝疫苗接种的认识和接受程度，需要加强对相关医务人员和公 众的培训和教育。通过开展培训讲座、发放宣传资料、制作宣传片等方式，普及 乙肝疫苗接种知识，减少误解和疑虑。
有过敏史、发热、急性疾病等人群应暂缓接种，孕妇、哺乳期妇女等特殊人群应咨询医生意见。
接种后的护理与观察
护理
接种后应保持接种部位的干燥和清洁，避免剧烈运动和沾水 ，避免用手触摸接种部位。
疫苗和乙肝疫苗相关知识简介ppt课件
乙肝小常识
1、3、5三项 同时是阳 性，就叫 “大三阳”； 1、4、5三项 同时是阳 性，就叫 “小三阳”。
5.核心抗原
4.e抗体
3.e抗原 2.表面抗体 1.表面抗原
7.乙肝疫苗注射注意事项
肝炎患者以及发热、急性传染病者，严重慢 性病患者，有免疫缺陷的人、严重过敏体质者和
正在使用免疫抑制剂的人不可接种乙肝疫苗。
谢 谢 ！
一般安全可靠，很少有不良反应。极个别人 可能有中、低度发热，或注射部位微痛，这种疼 痛与疫苗中含有的吸附剂有关。这些轻微反应一 般在24小时内消失。 注射疫苗侧上臂避免剧烈运动。
8.乙肝疫苗发展前景
我国已将乙肝疫苗纳入计划免疫中，新生儿均 应在出生后24小时内接种乙肝疫苗。 乙肝疫苗的趋势是由预防性疫苗向治疗性疫苗 发展。 每年我国在乙肝治疗方面的医疗支出是300 亿—500亿，目前我国有乙肝病毒携带者1.2亿多， 患者超过3000万，而仅有19%的患者接受以抗病 毒为主的方法进行治疗，因而治疗性乙肝疫苗一 旦研制成功并应用，面对的将是个庞大的市场。
2.我国乙肝现状
4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 3.8
乙肝携带者统计
1.2
乙肝携带者
全世界
中国
3.正确对待乙肝患者和携带者
乙肝病毒携带者 相同点 携带乙肝病毒 乙肝患者 携带乙肝病毒
肝病症状
肝功能 是不是病人 如何应对
没有
正常 不是；一般难以发病，保持良好心 态，80%-90%可平安一生。 健康生活，注意肝脏保护；定期检 查肝功能，不需要治疗。
无保护的性行为传播：乙肝病毒可以通过精液和阴道 分泌物进行传播。
5.乙肝疫苗
切断乙肝病毒传播的有效途径 2.10%
乙肝疫苗PPT课件
9
注意事项：幼儿出生时有严重脏器畸形、新生儿窒息、黄 疸、急性严重疾病、妊娠期妇女、对该疫苗所含成分过敏 者等应暂缓接种。
10
谢谢！
11
•
.
12
2
适应证: 用于预防乙型肝炎。乙型肝炎易感者，主要 用于婴幼儿。
接种第一针乙肝疫苗后，只有30%的人产生乙肝表面 抗体，而且抗体效果很不稳定；接种第二针后，有90%的 人产生抗体；接种第三针后抗体的阳性率可达96%以上． 而且抗体效果持续维持在较高水平。
接种时间：新生儿第一针必须在出生后24小时内接种 ，越早越好。如出生后摇不散的凝块或异物，吴标签或标签不清，瓶体有裂
纹或收到冻结的液体疫苗，一律不得使用。
2.疫苗应避免受阳光直接照射，使用前方可从冰箱取出。
3.尽量减少开启冰箱的次数并及时关严
4.注射前必须半安瓶内的疫苗摇匀，变成透明乳白色。
5.接种前询问过敏史和病史，过敏性体质和患有变态反应性
疾病者慎用 。
7
8
3
4
临床应用： 乙型肝炎易感者，主要用于婴幼儿。 部位：上臂三角肌肌肉内注射。
免疫程序均按0、1、6个月各注射一针，每针10μg。 其他高危人群，如肾透析以及其他职业性与乙肝密切接 触者，每针30μg。
5
6
疫苗使用：
1.检查疫苗，接种疫苗前必须严格核对要接种的疫苗种类、
检查外观质量、批号、有效期等。凡过期、变色、污染、发
不良反应：接种乙肝疫苗后，大多数婴幼儿都不会出现任何症 状。但是，少数婴幼儿可能会有以下不良反应： 1.接种部位红肿、发痒、硬结等，一般在接种后24小时左右出 现，1～3天内症状就会消失。 2.出现不同程度的发热，还伴有恶心、食欲不振、精神不好、 腹痛、腹泻等不良反应。但是一般在24小时以内就会消退。如 果发热特别严重，达到39℃以上，可以给婴幼儿服退烧药，若 持高烧不退或有其他异常，尽快到医院就诊。
注意事项：幼儿出生时有严重脏器畸形、新生儿窒息、黄 疸、急性严重疾病、妊娠期妇女、对该疫苗所含成分过敏 者等应暂缓接种。
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谢谢！
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适应证: 用于预防乙型肝炎。乙型肝炎易感者，主要 用于婴幼儿。
接种第一针乙肝疫苗后，只有30%的人产生乙肝表面 抗体，而且抗体效果很不稳定；接种第二针后，有90%的 人产生抗体；接种第三针后抗体的阳性率可达96%以上． 而且抗体效果持续维持在较高水平。
接种时间：新生儿第一针必须在出生后24小时内接种 ，越早越好。如出生后摇不散的凝块或异物，吴标签或标签不清，瓶体有裂
纹或收到冻结的液体疫苗，一律不得使用。
2.疫苗应避免受阳光直接照射，使用前方可从冰箱取出。
3.尽量减少开启冰箱的次数并及时关严
4.注射前必须半安瓶内的疫苗摇匀，变成透明乳白色。
5.接种前询问过敏史和病史，过敏性体质和患有变态反应性
疾病者慎用 。
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临床应用： 乙型肝炎易感者，主要用于婴幼儿。 部位：上臂三角肌肌肉内注射。
免疫程序均按0、1、6个月各注射一针，每针10μg。 其他高危人群，如肾透析以及其他职业性与乙肝密切接 触者，每针30μg。
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疫苗使用：
1.检查疫苗，接种疫苗前必须严格核对要接种的疫苗种类、
检查外观质量、批号、有效期等。凡过期、变色、污染、发
不良反应：接种乙肝疫苗后，大多数婴幼儿都不会出现任何症 状。但是，少数婴幼儿可能会有以下不良反应： 1.接种部位红肿、发痒、硬结等，一般在接种后24小时左右出 现，1～3天内症状就会消失。 2.出现不同程度的发热，还伴有恶心、食欲不振、精神不好、 腹痛、腹泻等不良反应。但是一般在24小时以内就会消退。如 果发热特别严重，达到39℃以上，可以给婴幼儿服退烧药，若 持高烧不退或有其他异常，尽快到医院就诊。
基因工程乙肝疫苗ppt课件
接种第三针。为达到最佳的效果，应按时全程接种。
接种乙肝疫苗的人群
• 处于HBV感染高度危险状态的易感者（未 感染过HBV的人）应接种乙肝疫苗。主要 包括： ①全部新生儿及幼儿园未接种过 乙肝疫苗的孩子； ②传染科、口腔科、 血液室、透析室和经常接触血液的工作 人员； ③新加入某一群体的人员，如新 入伍的战士、新入学的大学生； ④从事 食品服务行业者及保育工作人员； ⑤发 育障碍者，收容所中的患者和工作人员 ； ⑥血液透析患者； ⑦使用血液制品 者； ⑧器官移植前的患者；需长期应用 免疫抑制剂者； ⑨乙肝病毒携带者的家 庭接触者； ⑩注射毒品成瘾者；长期教 养机构中的犯人。
Bye bye~
部专门下发57号文件，具体部署用基因工程乙肝疫苗取代血源乙肝疫
苗事宜。
乙肝疫苗的制备
目的基因的获取
编码乙型肝炎表面抗原的基因的获取
一般的目的基因的获取方法有：
反转录法 化学合成法
反转录—聚合酶链反应法
工程菌的构建
CHO(中国仓鼠卵巢）细胞的特点 ①具有准确的转录后修饰功能 ,表达的糖基化药 物蛋白在分子结构、 理化特性和生物学功能方面最 接近于天然蛋白分子 ②具有产物胞外分泌功 能 ,便于下游产物分离纯化; ③具有重组基因的高效 扩增和表达能力; ④具有贴壁生长特性 ,且有较高的 耐受剪切力和渗透压能力 ,可以进行 悬浮培养 ,表达fibrob2last) ,很少分泌自身的内源蛋白 ,利 于外源蛋白的后分离
自身无法克服的缺点：
•
其一，乙肝表面抗原携带者由于已感染乙肝病毒，在此情况下，
再抽取其血浆作为乙肝疫苗原料，对携带者的身体健康有损害；
•
其二，疫苗的生产受到乙肝病毒表面抗原携带者血浆来源和质量
重组(酵母)乙型肝炎疫苗
重组（酵母）乙型肝炎疫苗
【组成与性状】
本品系由重组酵母表达的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，经纯化加佐剂吸附后制成。
疫苗为白色混悬液体，可因沉淀而分层，易摇散，不应有摇不散的块状物。
【规格】
本品每安瓿为0.5ml。
每次人用剂量0.5ml，含HbsAg5ug。
【质量标准】
本品依据《中国生物制品规程》(2000版)标准生产和检定，符合质量要求。
【作用与用途】
本疫苗接种后，可刺激机体产生对乙型肝炎病毒的免疫力，用于预防乙型肝炎。
【接种对象】
本疫苗适用于乙型肝炎易感者，尤其下列人员：
(1)新生儿、特别是母亲为HBsAg、HBeAg阳性者；
(2)从事医疗工作的医护人员及与接触血液的实验人员。
【用法与剂量】
(1)本疫苗注射时要充分摇匀。
(2)注射部位为上臂三角肌肌内。
(3) 新生儿第1针在出生后24小时内尽早注射。
1个月及6个月后注射第2、3针，其他人群免疫程序为第0、1、6个月，剂量均为5ug/支。
【禁忌】
患有发热、急性或慢性严重疾病者及对酵母成分过敏者禁止使用。
【副反应及处理】
本品很少有不良反应，个别人可有中、低度发热或注射局部微痛，24小时内即自行消失。
【注意事项】
(1)用前摇匀。
(2)安瓿破裂、有摇不散的块状物时不得使用。
(3)应备有肾上腺素，以防偶有过敏反应发生时使用。
【保存、运输及使用期限】
保存于2-8℃暗处，严防冻结。
在盒签或瓶签标明的失效期前使用。
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9.用丁基琼脂糖进行疏水层析，纯化后的抗原用硫氰酸盐处理以 完成二硫键的交联
10. 再与氢氧化铝共沉淀，此时抗原吸附在氢氧化铝上
6
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纯度测定
乙肝疫苗是通过肌肉注射的方式进入人体系统，为了降低疫苗内杂质含量对人体产生的 不良影响，必须进行疫苗的纯度检测。
乙肝疫苗表面抗原的纯度检定是疫苗质量控制的关键手段之一。目前分析测定重组乙 型肝炎疫苗纯度的HPLC常用方法是应用TSK-G5000PW分子筛。中国药品生物制品检定所 疫苗二室曾报道应用该系统对Merck酿酒酵母重组乙肝疫苗和CHO细胞重组乙肝疫苗进行 纯度分析，可获得良好的分离效果。对重组汉逊酵母乙肝疫苗，现有的HPLC检测系统应用 0.1mol/L DTT与1:50吐温80等量混合处理后能有效地检测不同类型重组乙肝疫苗表面抗原 的纯度。
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疫苗保存
疫苗的稳定性较差，一般在2~8℃下能保存12个月，但当温度升高后，效力很快降低。 在37℃下，许多疫苗只能稳定几天或者几个小时，非常不利于在室温下运输。为了使疫苗 的稳定性提高，可用冻干的方法使之干燥。这样，疫苗的有效期往往可延长1倍或以上，在 室温下其效价的损失亦较慢。 冻干要点是： （1）冷冻，即将疫苗冷冻至共熔点以下。 （2）真空升华，即在真空状态下降水分直接由固态升华为气态。 （3）升温缓慢，即升温的过程尽量缓慢，不使疫苗在任何时间下有融解的情况发生。 （4）冻干好的疫苗应在真空或充氮气后密封保存，使其残余水分保持在3%以下。这样的 疫苗能保持良好的稳定性。
4.细胞破碎后加入表面活性剂使抗原溶解。
5.粗细胞裂解物用0.2微米中空纤维柱进行微滤。抗原和大部分 低分子量宿主细胞内含物通过滤膜，细胞碎片被膜拦截。
6.滤液再进行超滤，此时抗原被膜拦截而低分子浪宿主细胞内含 物通过滤膜除去
7.残留的表面活性剂通过吸附在聚苯乙烯小珠上除去
8.再用硅胶吸附抗原，用热硼发酵
重组酵母细胞 小三角瓶 大三角瓶 种子发酵罐
生产发酵罐
用成功构造的基因工程菌进行扩大培养，经过逐级放大至发 酵罐。原料以碳水化合物为主，不含有毒物质，并加入少量有机 和无机氮源；能容易进行大量有效的乙肝病毒表面抗原的生产； 生产过程中，通常常温进行，操作温和，不考虑防爆问题；生产 过程中考虑防止杂菌的污染。
5
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分离纯化
发酵液
过滤
蛋白酶抑制剂
细胞破碎
表面活性剂
微滤
滤液
超滤
硅胶吸附
热硼酸
疏水层析
硫氰酸盐处理
氢氧化铝共沉淀
1.发酵结束后，通过过滤或离心，使酵母与发酵液分离，
2. 加入蛋白酶抑制剂以防抗原在细胞破碎时被分解。
3.然后细胞通过高压匀浆机破碎释放出抗原。酵母细胞较 厚，比大肠杆菌难破碎，可在高压匀浆机内施加几千个大气压， 通过针型阀突然降压到零使细胞破碎。
发酵过程中，可采用分批补料或连续流加补料以保证最优生 长和维持细胞浓度、生长速度和营养供应之间的适当平衡。可添 加诱导剂如乳糖到发酵液中去以诱导可调节启动子的表达。
发现在碳源中降低葡萄糖浓度，补充甘油和蔗糖能较明显地 改善比活值和HBsAg的相对浓度。将发酵前期、中期和后期温度 分别控制在27℃、33℃、25℃；发酵从pH4.5开始，逐步上升到 pH6；以及维持溶氧浓度在最适水平（70%饱和度），都可以提 高重组质粒的稳定性和HBsAg在发酵液中的积累。
2. 乙肝疫苗的发展：
3.汉逊酵母为甲基营养型酵母，基因组易操作，培养基廉价，有分泌型表达模式，正确的 折叠和修饰，产量理想，发酵液产出杂蛋白少，产物易于纯化，无热源和其他病原体，安 全性好
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重组酵母的构建
获取目的基因
1.根据已经测定的编码乙肝病毒表面抗原决定簇基因序列，用化 学合成法直接合成目的基因
重组乙肝疫苗（汉逊酵母） 制备
Staff:
1
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目录
1.背景介绍 2.重组酵母构建 3.菌种制备和发酵 4.分离纯化 5.纯度测定工艺 6.疫苗的保存
2
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背景介绍
1.乙肝病毒的感染可导致慢性肝脏疾病甚至肝癌的发生。我国乙肝感染率为60%，乙肝表 面抗原携带率约为10%，有约1.2亿人携带乙肝病毒。乙肝病毒中决定乙肝病毒抗原性的蛋 白是乙型肝炎病毒（HBV薄膜蛋白），主要包括，乙肝病毒表面抗原（HBsAg）,前S1抗 原和前S2抗原
构建重组质粒 导入宿主细胞
2. 用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到质粒分子上， 构成DNA重组分子。
3.借组细胞转化手段将DNA重组分子导入酵母细胞内。
培养酵母细胞
4.短时间培养转化酵母细胞，以扩增DNA重组分子。
检测正确表达目的产 物的酵母
5.筛选和鉴定经转化处理的酵母细胞，获得外源基因高效表达的 基因工程菌。
10. 再与氢氧化铝共沉淀，此时抗原吸附在氢氧化铝上
6
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纯度测定
乙肝疫苗是通过肌肉注射的方式进入人体系统，为了降低疫苗内杂质含量对人体产生的 不良影响，必须进行疫苗的纯度检测。
乙肝疫苗表面抗原的纯度检定是疫苗质量控制的关键手段之一。目前分析测定重组乙 型肝炎疫苗纯度的HPLC常用方法是应用TSK-G5000PW分子筛。中国药品生物制品检定所 疫苗二室曾报道应用该系统对Merck酿酒酵母重组乙肝疫苗和CHO细胞重组乙肝疫苗进行 纯度分析，可获得良好的分离效果。对重组汉逊酵母乙肝疫苗，现有的HPLC检测系统应用 0.1mol/L DTT与1:50吐温80等量混合处理后能有效地检测不同类型重组乙肝疫苗表面抗原 的纯度。
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疫苗保存
疫苗的稳定性较差，一般在2~8℃下能保存12个月，但当温度升高后，效力很快降低。 在37℃下，许多疫苗只能稳定几天或者几个小时，非常不利于在室温下运输。为了使疫苗 的稳定性提高，可用冻干的方法使之干燥。这样，疫苗的有效期往往可延长1倍或以上，在 室温下其效价的损失亦较慢。 冻干要点是： （1）冷冻，即将疫苗冷冻至共熔点以下。 （2）真空升华，即在真空状态下降水分直接由固态升华为气态。 （3）升温缓慢，即升温的过程尽量缓慢，不使疫苗在任何时间下有融解的情况发生。 （4）冻干好的疫苗应在真空或充氮气后密封保存，使其残余水分保持在3%以下。这样的 疫苗能保持良好的稳定性。
4.细胞破碎后加入表面活性剂使抗原溶解。
5.粗细胞裂解物用0.2微米中空纤维柱进行微滤。抗原和大部分 低分子量宿主细胞内含物通过滤膜，细胞碎片被膜拦截。
6.滤液再进行超滤，此时抗原被膜拦截而低分子浪宿主细胞内含 物通过滤膜除去
7.残留的表面活性剂通过吸附在聚苯乙烯小珠上除去
8.再用硅胶吸附抗原，用热硼发酵
重组酵母细胞 小三角瓶 大三角瓶 种子发酵罐
生产发酵罐
用成功构造的基因工程菌进行扩大培养，经过逐级放大至发 酵罐。原料以碳水化合物为主，不含有毒物质，并加入少量有机 和无机氮源；能容易进行大量有效的乙肝病毒表面抗原的生产； 生产过程中，通常常温进行，操作温和，不考虑防爆问题；生产 过程中考虑防止杂菌的污染。
5
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分离纯化
发酵液
过滤
蛋白酶抑制剂
细胞破碎
表面活性剂
微滤
滤液
超滤
硅胶吸附
热硼酸
疏水层析
硫氰酸盐处理
氢氧化铝共沉淀
1.发酵结束后，通过过滤或离心，使酵母与发酵液分离，
2. 加入蛋白酶抑制剂以防抗原在细胞破碎时被分解。
3.然后细胞通过高压匀浆机破碎释放出抗原。酵母细胞较 厚，比大肠杆菌难破碎，可在高压匀浆机内施加几千个大气压， 通过针型阀突然降压到零使细胞破碎。
发酵过程中，可采用分批补料或连续流加补料以保证最优生 长和维持细胞浓度、生长速度和营养供应之间的适当平衡。可添 加诱导剂如乳糖到发酵液中去以诱导可调节启动子的表达。
发现在碳源中降低葡萄糖浓度，补充甘油和蔗糖能较明显地 改善比活值和HBsAg的相对浓度。将发酵前期、中期和后期温度 分别控制在27℃、33℃、25℃；发酵从pH4.5开始，逐步上升到 pH6；以及维持溶氧浓度在最适水平（70%饱和度），都可以提 高重组质粒的稳定性和HBsAg在发酵液中的积累。
2. 乙肝疫苗的发展：
3.汉逊酵母为甲基营养型酵母，基因组易操作，培养基廉价，有分泌型表达模式，正确的 折叠和修饰，产量理想，发酵液产出杂蛋白少，产物易于纯化，无热源和其他病原体，安 全性好
3
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重组酵母的构建
获取目的基因
1.根据已经测定的编码乙肝病毒表面抗原决定簇基因序列，用化 学合成法直接合成目的基因
重组乙肝疫苗（汉逊酵母） 制备
Staff:
1
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目录
1.背景介绍 2.重组酵母构建 3.菌种制备和发酵 4.分离纯化 5.纯度测定工艺 6.疫苗的保存
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背景介绍
1.乙肝病毒的感染可导致慢性肝脏疾病甚至肝癌的发生。我国乙肝感染率为60%，乙肝表 面抗原携带率约为10%，有约1.2亿人携带乙肝病毒。乙肝病毒中决定乙肝病毒抗原性的蛋 白是乙型肝炎病毒（HBV薄膜蛋白），主要包括，乙肝病毒表面抗原（HBsAg）,前S1抗 原和前S2抗原
构建重组质粒 导入宿主细胞
2. 用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到质粒分子上， 构成DNA重组分子。
3.借组细胞转化手段将DNA重组分子导入酵母细胞内。
培养酵母细胞
4.短时间培养转化酵母细胞，以扩增DNA重组分子。
检测正确表达目的产 物的酵母
5.筛选和鉴定经转化处理的酵母细胞，获得外源基因高效表达的 基因工程菌。