辣根过氧化物酶分光光度法测定 黄嘌呤氧化酶的活性
辣根过氧化物酶活性检测方法研究
辣根过氧化物酶活性检测方法研究张挺;何智敏;钟瑞敏;张世伟【期刊名称】《广州城市职业学院学报》【年(卷),期】2017(011)003【摘要】通过单因素实验和正交实验研究了辣根过氧化酶(HRP)活性测定条件:缓冲溶液种类、缓冲溶液离子浓度、pH值、温度对其影响.实验结果表明在25℃下,0.1mol/L,pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中反应,辣根过氧化物酶的酶活力达到最大值1.13×107 U/g;确定辣根过氧化物酶活性的最佳检测方法:1mg HRP溶解于1mL 0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH=7.0),反应温度为25℃,检测波长为436nm.该方法简单可靠,操作简便,可有效应用于实验室和常规生化检测.【总页数】4页(P73-76)【作者】张挺;何智敏;钟瑞敏;张世伟【作者单位】广州城市职业学院食品系,广东广州510405;韶关学院英东食品科学与工程学院,广东韶关512005;韶关学院英东食品科学与工程学院,广东韶关512005;深圳市计量质量检测研究院,广东深圳518055【正文语种】中文【中图分类】O657.32【相关文献】1.催化分光光度法测定辣根过氧化物酶新方法研究 [J], 魏永锋;阎宏涛2.基于多指标抗炎活性检测的注射用血塞通生物评价方法研究 [J], 马湘炜;蒋淑敏;赵筱萍3.季胺-辣根过氧化物酶-过氧化氢显色新体系及其在酶活性检测中的应用 [J], 李建国;刘颖;鞠熀先4.基于表面增强拉曼光谱的碱性磷酸酶活性检测方法研究 [J], 江蕾; 甘振飞; 陈华英; 常帅; 李家宾; 李大伟5.基于Ce-BDC的氧化物酶活性检测果汁中抗坏血酸的比色方法研究 [J], 杨阳;刘光勤;杨思龙;艾雪莲;梁秋红;罗林频;汪蓉;王建龙;张文涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制
过氧化物酶（POD ）活性测定【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H 202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。
【实验试剂】 愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L 磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL ，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL ，混合均匀保存在冰箱中]【方法步骤】（1）、粗酶液的提取 称取小麦叶片0.25g ，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL ，于研钵中研成匀浆，以4000r/min 离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL 提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。
（2）、酶活性的测定 取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL ，KH2PO41mL ，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL ，稀释后的酶液1mL （如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm 波长下测量OD 值，每隔1min 读数一次（4min ）。
以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD 值增加0.01定义为一个活力单位。
表1 紫外吸收法测定POD 酶活性配置表4.结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]表示之。
也可以用每 min内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。
POD 总活性[u/g(FW)]=式中：POD 总活性以酶单位每克鲜重表示。
其中 △470=ACK-AE比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。
ACK ——照光对照管的吸光度。
AE ——样品管的吸光度。
Vt ——样品液总体积，mL 。
辣根过氧化酶的表达和酶活性测定
辣根过氧化酶的表达和酶活性测定辣根(Garden radish)是一种食用根菜，辣根中含有大量的过氧化酶(peroxidase)，这种酶可以催化物质的氧化还原反应，具有重要的生物学意义和应用价值。
本文将介绍辣根过氧化酶的表达和酶活性测定。
一、植物基因工程的原理和方法植物基因工程是将外源基因导入植物体内，使其表达所需的蛋白质，以达到改良植物性状和提高产量等目的。
主要方法包括以下几个步骤：1.选择载体：通常采用质粒作为载体，其优点是易于操作、成功率高、适用于多种植物等；缺点是获得的转基因植物往往存在多个拷贝数、位置不固定等问题。
2.克隆外源基因：从外源来源中克隆所需要的基因，通常采用PCR或酶切法进行操作。
3.构建基因转化载体：将外源基因与载体进行连接，构建基因转化载体。
4.基因转化：将构建好的基因转化载体通过农杆菌或基因枪等方法导入植物细胞，使其被转化。
经过选育和筛选后，可以选择对应的转化植株进行表达和性状分析。
二、辣根过氧化酶的表达过氧化酶是一种重要的生物催化剂，广泛存在于植物、动物和微生物等生物体内。
辣根中的过氧化酶具有比较高的催化活性，因此对于其表达成为了许多研究的重要方向。
下面就介绍几种常用的表达方法。
1. 转基因植物表达法通过外源基因的转入，使植物细胞内部合成所需的蛋白质。
相比细胞培养和分离提取等方式，这种方法更具有稳定性和可控性。
2. 细胞培养和分离提取法采用感光荧光素光反应，测定培养细胞或组织提取物中的过氧化物酶活性，以此测定过氧化酶的表达。
3. 重组工程菌表达法将辣根过氧化酶基因克隆到大肠杆菌等可表达目的蛋白质的菌株中，使其高效表达，从而为进行治疗和检测等方面提供重要基础。
三、辣根过氧化酶的酶活性测定方法1. 常规方法-光度法光度法是一种基于酶催化产物的吸光度变化的测定方法。
常用的基质是苯酚，产生硫酸化产物。
方法简单，测量结果准确，但是缺点是需要消耗大量的试剂和设备。
此外，在测定过程中也可能出现误差。
辣根过氧化物酶分光光度法测定 黄嘌呤氧化酶的活性
辣根过氧化物酶分光光度法测定黄嘌呤氧化酶的活性李忠琴1 许小平2 杨海麟1 王武#11（江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡214036） 2（福州大学化学化工学院，福州350002）摘 要 研究了以辣根过氧化物酶-苯酚-4-氨基安替比林反应显色新体系，检测黄嘌呤氧化酶（XOD ）活力的新方法。
确定该酶活性测定的最佳条件为：辣根过氧化物酶（HRP ）7000U /L ，4-氨基安替比林（AAP ）1mmol /L ，苯酚（PA ）6mmol /L ，黄嘌呤（XAN ）1mmol /L 溶于50mmol /L Tris-CL 缓冲液（pH 8.4）；反应温度为37℃，保温时间为20min ；检测波长为508nm 。
本方法测定XOD 酶活的线性范围为5.0～100.0U /L ，线性关系良好（r =0.9992），检出限为1.3U /L 。
该方法操作简单易行，测定结果准确可靠。
可有效应用于普通实验室和临床常规生化检测。
关键词 黄嘌呤氧化酶，辣根过氧化物酶，酶的活力测定，分光光度法2005-08-30收稿；2005-12-05接受本文系福建省自然科学基金（No.C0410006）和工业生物技术教育部重点实验室基金（No.KLIB-KF200502）资助项目1 引 言黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase ，XOD ，EC 1. 2. 3.22）是一种钼羟类胞质缀合酶。
主要用于痛风、心肌梗塞和细胞损伤后次黄嘌呤和黄嘌呤水平的检测［1～3］。
目前测定黄嘌呤氧化酶活力主要采用NBT /MTS-PMS 比色法、紫外分光光度法、电化学法及放射化学法［4～8］等方法。
但比色法形成的显色物溶解度低，PMS 对XOD 活性有一定的抑制，且NBT 、MTS 和PMS 试剂昂贵。
紫外分光光度法中黄嘌呤和尿酸的紫外吸收波长较接近，直接进行紫外检测，干扰严重。
其余两种方法操作繁琐，仪器设备要求高而难于推广。
本实验根据辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase ，HRP ）［9］和黄嘌呤氧化酶的反应特性，提出了用XOD 偶联辣根过氧化物酶，直接测定黄嘌呤氧化酶活力的新方法。
抗氧化酶活性测定方法
抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类对抗氧化反应具有重要作用的酶。
其主要功能是清除体内的自由基，抑制过氧化物形成和脂质氧化反应，从而保护细胞免受氧化应激的伤害。
测定抗氧化酶活性有助于评估生物体内的氧化应激水平，为疾病的诊断和治疗提供重要的指导。
本文将介绍几种常见的抗氧化酶活性测定方法。
1.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法：SOD能够催化超氧阴离子（O2-）的还原反应，将其转化为较为稳定的氧气和过氧化氢。
常见的SOD活性测定方法有：-标准醛缩法：根据SOD催化的还原反应，利用NBT（硝基蓝盐）和醛缩剂的变色反应来测定SOD活性。
-自动化测定法：利用包含其中一种还原物质和pH染料的较为稳定的底物，通过测定底物的氧化程度来确定SOD活性。
-XTT法和WST-1法：由于SOD具有还原型的性质，可以通过测定细胞培养基中的还原型琼脂糖（XTT）或水溶性四硝基噻唑盐（WST-1）的还原动力学来测定其活性。
2.过氧化氢酶（CAT）活性测定方法：CAT主要参与还原过氧化氢（H2O2），将其转化为氧和水。
常见的CAT活性测定方法有：-色素法：利用黄曲霉素作为还原剂，观察黄曲霉素的消费量来测定CAT活性。
-光度法：通过测定样品中H2O2浓度的下降程度来间接测定CAT活性。
-氧化还原电极法：通过测定样品中H2O2浓度的下降速度来测定CAT活性。
3.过氧化物酶（POD）活性测定方法：POD主要参与氧气与还原型供体之间的氧化还原反应，转化为过氧化物（ROO-）。
常见的POD活性测定方法有：-色谱法：利用酚类底物的氧化反应，测定产生的醌类产物的含量来测定POD活性。
-酶标法：POD催化氧化反应会形成有色产物，通过测定产物的吸光度来测定POD活性。
4.谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性测定方法：GPx主要参与还原过氧化物，将其转化为相对稳定的醇和水。
常见的GPx活性测定方法有：-碳酸盐法：根据GPx还原底物中的碳酸盐，观察样品溶液pH值的变化来测定GPx活性。
抗氧化酶活性测定方法
抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类能够帮助生物体减轻或消除自由基对细胞和组织的损伤的酶。
其中三个主要的抗氧化酶分别是超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)。
测定这些抗氧化酶的活性可以帮助我们了解细胞和组织内抗氧化能力的变化，从而评估对抗氧化应激的能力。
以下是常用的测定这些抗氧化酶活性的方法。
1.NBT法：超氧化物歧化酶能够催化过氧化脱氢麦角酮（NBT）被还原成紫色水溶性产物，通过测定产物的吸光度来确定SOD的活性。
具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的NBT缓冲液。
（2）开始反应：置于适当的温度和时间下。
（3）停止反应：加入硝酸，停止NBT的还原反应。
（4）测定吸光度：使用分光光度计测量产生的相对吸光度。
2.氰化硝酸法：该方法是通过抑制SOD对自由基的清除作用，使过氧化物离子被产生，进而通过测定过氧化物离子的吸光度来间接测定SOD的活性。
具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的氰化钾和亚硝酸钠。
（2）开始反应：加入适量的氧化剂，使之和SOD反应生成过氧化物。
（3）测定吸光度：使用分光光度计测量过氧化物离子产生的相对吸光度。
1.亚硫酸盐法：过氧化物酶能够催化亚硫酸盐氧化成差二价铁离子，通过差二价铁离子与硫酸铵生成蓝色络合物来测定POD的活性。
具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的亚硫酸铵和硫酸。
（2）开始反应：加入适量的H2O2，使之和POD反应生成差二价铁离子。
（3）停止反应：加入硫酸铵，停止POD对H2O2的催化作用。
（4）测定吸光度：使用分光光度计测量产生的相对吸光度。
2.过氧化氢法：过氧化物酶能够催化过氧化氢分解成氧气和水，通过测定生成的O2的相对浓度来测定POD的活性。
具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的过氧化氢。
（2）开始反应：加入过氧化物酶，使之和过氧化氢反应。
一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法[发明专利]
![一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/cf5bb17ee418964bcf84b9d528ea81c758f52ebc.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710011208.7(22)申请日 2017.01.06(71)申请人 北京物资学院地址 101149 北京市通州区富河大街1号(72)发明人 陈静 沈丽 王超 (51)Int.Cl.G01N 21/33(2006.01)G01N 1/34(2006.01)(54)发明名称一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法(57)摘要本发明公开了一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法，涉及一种次黄嘌呤的检测方法。
本发明的方法简单，完成速度快，设计合理，准确度高，数据参考性强，操作容易，无须特制实验仪器，即使用现有检测仪器就能达到检测目的，有利于大面积推广和使用。
本发明方法是取鱼肉制样品液，用辣根过氧化物酶和黄嘌呤氧化酶偶联催化样品液后用紫外分光光度计进行检测获取次黄嘌呤的含量。
本发明用于判断鱼的新鲜度。
权利要求书1页 说明书6页CN 106855508 A 2017.06.16C N 106855508A1.一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法，其特征在于该检测方法是按下述步骤进行的：步骤一、取鱼肉研磨至泥状，离心取上清液，用过滤膜过滤后去除沉淀蛋白；步骤二、然后离心取上清液，用辣根过氧化物酶和黄嘌呤氧化酶偶联催化，再用紫外分光光度计进行检测获取次黄嘌呤的含量。
2.根据权利要求1所述一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法，其特征在于步骤一中取5g 鱼肉研磨。
3.根据权利要求2所述一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法，其特征在于步骤一中所述去除沉淀蛋白是按下述步骤制备的：向用过滤膜过滤的滤液中加入0.1mL 10％(质量)三氯醋酸，搅拌混匀。
4.根据权利要求3所述一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法，其特征在于步骤二中偶联催化是：向上清液中依次加入3mL的苯酚、3mL 4-氨基安替比林、3mL Tris-HCL缓冲液、3mL 叠氮钠和3mL辣根过氧化物酶，加100μL黄嘌呤氧化酶和10mL样品液，置于37℃的恒温水浴锅内保温8min，然后煮沸2min后加入1mL浓度为71.389mg/mL的Na 2CO 3溶液，放入冰水中冷却，用紫外分光光度计测量。
过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制
过氧化物酶（POD）活性测定【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。
【实验试剂】愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L 磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀保存在冰箱中]【方法步骤】（1）、粗酶液的提取称取小麦叶片0.25g，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL，于研钵中研成匀浆，以4000r/min离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。
（2）、酶活性的测定取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL，KH2PO41mL，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL，稀释后的酶液1mL（如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔1min读数一次（4min）。
以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD值增加0.01定义为一个活力单位。
表1 紫外吸收法测定POD酶活性配置表管号S0（对照）S1（实验）S2（实验）反应混合液(ml) 3.0 3.0 3.0KH2PO4 (ml) 1.00.00.0酶液 (ml)0.0 1.0 1.04.结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]表示之。
也可以用每min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。
POD总活性[u/g(FW)]=FWtV.VA T⨯⨯⨯⨯147001∆式中：POD总活性以酶单位每克鲜重表示。
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辣根过氧化物酶分光光度法测定黄嘌呤氧化酶的活性李忠琴1 许小平2 杨海麟1 王武#11（江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡214036） 2（福州大学化学化工学院，福州350002）摘 要 研究了以辣根过氧化物酶-苯酚-4-氨基安替比林反应显色新体系，检测黄嘌呤氧化酶（XOD ）活力的新方法。
确定该酶活性测定的最佳条件为：辣根过氧化物酶（HRP ）7000U /L ，4-氨基安替比林（AAP ）1mmol /L ，苯酚（PA ）6mmol /L ，黄嘌呤（XAN ）1mmol /L 溶于50mmol /L Tris-CL 缓冲液（pH 8.4）；反应温度为37℃，保温时间为20min ；检测波长为508nm 。
本方法测定XOD 酶活的线性范围为5.0～100.0U /L ，线性关系良好（r =0.9992），检出限为1.3U /L 。
该方法操作简单易行，测定结果准确可靠。
可有效应用于普通实验室和临床常规生化检测。
关键词 黄嘌呤氧化酶，辣根过氧化物酶，酶的活力测定，分光光度法2005-08-30收稿；2005-12-05接受本文系福建省自然科学基金（No.C0410006）和工业生物技术教育部重点实验室基金（No.KLIB-KF200502）资助项目1 引 言黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase ，XOD ，EC 1. 2. 3.22）是一种钼羟类胞质缀合酶。
主要用于痛风、心肌梗塞和细胞损伤后次黄嘌呤和黄嘌呤水平的检测［1～3］。
目前测定黄嘌呤氧化酶活力主要采用NBT /MTS-PMS 比色法、紫外分光光度法、电化学法及放射化学法［4～8］等方法。
但比色法形成的显色物溶解度低，PMS 对XOD 活性有一定的抑制，且NBT 、MTS 和PMS 试剂昂贵。
紫外分光光度法中黄嘌呤和尿酸的紫外吸收波长较接近，直接进行紫外检测，干扰严重。
其余两种方法操作繁琐，仪器设备要求高而难于推广。
本实验根据辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase ，HRP ）［9］和黄嘌呤氧化酶的反应特性，提出了用XOD 偶联辣根过氧化物酶，直接测定黄嘌呤氧化酶活力的新方法。
2 实验部分2.1 仪器和试剂U-300型紫外-可见分光光度仪（日本日立公司）；H.H.S 11-2R 恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）；高速冷冻离心机（日本Hitachi CR22G 型）。
0.67U /mg 黄嘌呤氧化酶（Sigma 公司）；250U /mg 辣根过氧化物酶（上海双向西巴斯科技有限公司）；4-氨基安替比林（AR ，华东师范大学化工厂）；苯酚（AR ，国药集团上海化学试剂公司）；黄嘌呤（99%，Fluka ）；Tris （BR ，国药集团化学试剂有限公司）；HCL （AR ，国药集团上海化学试剂公司）；叠氮钠（BR ，厦门新隆达试剂有限公司）。
2.2 实验方法配制反应显色液：4-氨基安替比林（4-Aminoantipyrine ，AAP ），1mmol /L ；苯酚（phenic acid ，PA ），6mmol /L ；Tris-HCL 缓冲液，50mmol /L ；叠氮钠，0.02%；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase ，HRP ），7000U /L 。
在具塞试管中，依次加入3mL 反应显色液，黄嘌呤（xanthine ，XAN ）溶液100µL ，黄嘌呤氧化酶（XOD ）酶液50µL 。
混匀，在37℃下加热20min ，煮沸5min 终止反应。
以不加XOD 反应体系作为参比，测定UV-Vis 谱。
2.3 样品处理Arthrobacter g-X 菌株液体发酵48h 后，在10000r /min 转速下离心15min ，收集细胞。
再将其悬浮于50mmol /L Tris-HCL 缓冲液（pH 7.5）中，采用250W 超声处理15min 。
然后用12000r /min 转速离心10min ，取其上清液测定酶活。
第34卷2006年6月分析化学（FENXI HUAXUE ） 研究简报Chinese Journal of Analytical Chemistry第6期821～8243 结果与讨论3.1 酶法测定原理黄嘌呤氧化酶在催化黄嘌呤氧化的反应过程中，每氧化1mol 黄嘌呤，将消耗1mol 分子氧和水，产生1mol 尿酸和1mol H 2O 2。
H 2O 2再经过氧化物酶作用分解，可使4-氨基安替比林与苯酚形成亚醌类呈红色的化合物（chromogen ）［10］。
在可见光范围内测定该显色化合物的吸光度，即可推算出XOD 的酶活。
总反应式如下：Xanthine +O 2+H 2O 7%XODUric acid +H 2O （1）H 2O 2+AAP +PA 7%HRD chromogen +H 2O（2）3.2 反应体系主要参数的确定3.2.1 吸收光谱全波长扫描分析 按实验方法依次加入除XOD 的所有试剂，以Tris-HCL 缓冲液为参比，扫描该体系的UV-Vis 图谱。
如图1曲线1所示，仅在紫外区有1个吸收峰。
加入XOD 反应后再扫描体系的UV-Vis 谱。
从谱图曲线2可看出产物在可见光区450～650nm 之间只有1个吸收峰，选择吸收峰值最高的波长508nm 作为XOD 酶活检测波长，可降低干扰。
图中曲线3在可见光区没有任何吸 图1 XOD 检测反应体系的UV-Vis 扫描图谱Fig.1 Absorption spectra for system of anthine oxidase catalyzing reaction1.加黄嘌呤氧化酶前的体系（without xanthine oxidase ）；2.加黄嘌呤氧化酶后的体系（with xanthine oxidase added ）；3.不加辣根过氧化物酶的体系（without horseradish peroxidase ）；检测条件（determination conditions ）：辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase ，HRP ）7000U /L ，4-氨基安替比林（4-aminoanti-pyrine ，AAP ）1mmol /L ，苯酚（phenic acid ，PA ）6mmol /L ，黄嘌呤（xanthine ，XAN ）1mmol /L ，黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase ，XOD ）49.3U /L 。
收峰，说明若不添加辣根过氧化物酶，体系无法形成红色亚醌类化合物，即不能进行XOD 的检测。
3.2.2 酶促反应温度的确定 在相同反应条件下，考察了不同反应温度对XOD 酶活的影响。
结果表明（表1），随着温度的升高，体系吸光度先增大后减少，即显色物的生成量先增后减。
在37℃时，显色物的吸光度最高。
因而选择37℃作为检测温度，可获最佳反应效果。
表1 温度对XOD 酶促反应体系的影响Table 1 The effect of temperature on the XOD reaction system温度（℃）Temperature3235374048A 5800.23280.27970.31930.28050.2631反应条件（reaction conditions ）：t =20min ；pH 8.6。
3.2.3 酶催化反应动力学性质 分别按3.2实验方法同时进行反应，在反应后1、3、6、9、10、12、13、18、20、25及30min 时终止反应，测其吸光度，结果见图2。
由图2可以看出，在XOD 加入测定体系后，吸光度值随反应时间增加逐渐增大。
在20min 后，吸光度值达到最大，用A max 表示。
用一级动力学方程描述吸光度与时间之间的关系曲线得到图3，结果显示该体系反应很好地符合一级反应，动力学方程为：ln （A max -A t ）=-0.1724t -1.2326，相关系数r =0.9973。
虽然体系中包含两步酶反应，但是由于HRP 的催化效率极高，H 2O 2一经生成立刻分解出初生态氧，而且H 2O 2氧化苯酚反应比黄嘌呤的氧化反应要快得多，故该体系的综合反应是准一级反应。
3.2.4 酶促反应体系pH 的选择 在XOD 和HRP 两种酶的稳定pH 范围内，考察了6个不同pH 对酶活力的影响。
结果表明（表2），pH 对反应体系有明显的影响。
在pH8.0～8.4范围内，随着pH 的提高，显色吸光度增大。
故确定该反应体系的最适pH 为8.4。
表2 体系pH 对XOD 酶活检测的影响Table 2 The effect of pH on the determination of XOD reac-tion systempH 7.58.08.28.48.69.0A 5080.13390.13850.17540.18010.15270.1262反应条件（reaction conditions ）：T =37℃，20min 。
228分析化学第34卷图2 反应体系测定XOD 的吸光度随时间变化的曲线Fig.2Curve of absorbance versus time in reaction system反应条件（reaction conditions ）：T =37℃，pH 8.6。
图3 XOD-HRP-PA-AAP-XAN 反应体系的动力学曲线Fig.3 Kinetic curve of the XOD-HRP-PA-AAP-XAN re-action system反应条件（reaction conditions ）：T =37℃，pH 8.6。
3.2.5 根据米氏常数选择黄嘌呤底物浓度 分别以0.062、0.099、0.308、0.615和1.231mmol /L 等不同浓度的黄嘌呤为基质对相同浓度XOD （49.3U /L ）的酶活进行测定，观察底物对酶促反应速度的影响。
根据Lineweaver-Burk 双倒数作图法，线性方程为（1/S ）=2.9619×（1/V ）+60.896，相关系数r 为0.9987，求得黄嘌呤氧化酶的米氏常数为K m =0.049mmol /L 。
在酶活测定中，要求底物浓度过量，一般应大于10倍K m 值［11］。
根据该实验结果说明在本文中采用的1mmol /L 黄嘌呤作为测定体系的底物浓度是适宜的。
3.2.6 测定方法的建立 首先取3mL 反应显色液（pH8.4）于具塞试管中，加入100µL 黄嘌呤溶液（1mmol /L ），在37℃水浴中预热1min 。
然后加入50µL 标准XOD 酶液或发酵XOD 酶提取液，混匀保温20min ，沸水煮5min 终止反应。