辣根过氧化物酶标记
超敏感型DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒
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DAB，即3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride，是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶的催化 下，DAB会产生棕色沉淀。该棕色沉淀不溶于水和乙醇。因此在DAB显色后，还可以使用溶于乙醇的染料进行后续染色。
本试剂盒可以用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，也可以用于Western等结合有辣 根过氧化物酶的膜的显色检测。同时也可以用于细胞或组织内源性的辣根过氧化物酶显色。
2. 没有显色或显色太弱。 a. 可以考虑适当提高一抗或二抗的浓度。检测二抗效果，滴一滴稀释二抗在膜上，检测二抗是否可以被正常显 色。 b. 可以考虑使用更加灵敏的放大检测体系，例如使用生物素检测体系。 c. 可以适当延长显色时间，另外确定抗原修复是否对于使用的一抗是必需的。
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免疫组化(SP法)原理步骤及试剂
免疫组化原理步骤及试剂原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。
2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
辣根过氧化物酶结构式
辣根过氧化物酶结构式辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase）是一种被广泛应用于生物化学和分子生物学研究领域的酶类分子。
它由辣根（Armillaria genus）植物中提取得到，具有非常高的催化活性和稳定性。
辣根过氧化物酶在生物学研究、临床诊断和食品加工等领域中有着广泛的应用和重要的地位。
1. 辣根过氧化物酶的结构辣根过氧化物酶是一种非常复杂的蛋白质，其结构由多个亚基组成。
这些亚基包括一个基质结合亚基、一个过氧基结合亚基以及几个其他辅助亚基。
辣根过氧化物酶的分子量大约为44-46千道尔顿（kDa）。
这个酶的活性主要由其基质结合亚基所决定。
该亚基主要由氨基酸组成，如苏氨酸、赖氨酸和酪氨酸等。
2. 辣根过氧化物酶的催化机制辣根过氧化物酶的催化机制与其他过氧化物酶类似，都是通过还原辅助基团来氧化底物。
具体来说，它在存在过氧化物的条件下，将底物与过氧化物反应，生成对应的氧化产物。
这个过程涉及到催化剂的不断变化和再生，从而实现酶的持续催化。
3.辣根过氧化物酶的应用辣根过氧化物酶的广泛应用主要得益于其高催化活性和广泛的底物适应性。
它可以用于生物学研究，如DNA检测、蛋白质定量和酶反应动力学等方面。
辣根过氧化物酶也常用于临床诊断，例如用于检测肿瘤标志物、血液疾病和免疫疾病等。
辣根过氧化物酶还常见于食品加工中，如漂白、防腐和脱毒等领域。
4.我对辣根过氧化物酶的个人观点和理解辣根过氧化物酶作为一种重要的酶类分子，具有广泛的应用领域和潜在的研究价值。
我认为其高催化活性和多功能性使得它在生物化学和分子生物学研究中扮演着重要的角色。
无论是在基础科学研究中还是在应用实践中，辣根过氧化物酶都展示了其重要性和优越性。
总结回顾：通过本文的论述，我们了解了辣根过氧化物酶的结构、催化机制以及应用领域。
辣根过氧化物酶是一种重要的酶类分子，其结构复杂且具有高催化活性。
其催化机制涉及到底物与过氧化物的反应，并通过催化剂的变化和再生来实现持续催化。
辣根过氧化物酶分光光度法测定 黄嘌呤氧化酶的活性
辣根过氧化物酶分光光度法测定黄嘌呤氧化酶的活性李忠琴1 许小平2 杨海麟1 王武#11（江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡214036） 2（福州大学化学化工学院，福州350002）摘 要 研究了以辣根过氧化物酶-苯酚-4-氨基安替比林反应显色新体系，检测黄嘌呤氧化酶（XOD ）活力的新方法。
确定该酶活性测定的最佳条件为：辣根过氧化物酶（HRP ）7000U /L ，4-氨基安替比林（AAP ）1mmol /L ，苯酚（PA ）6mmol /L ，黄嘌呤（XAN ）1mmol /L 溶于50mmol /L Tris-CL 缓冲液（pH 8.4）；反应温度为37℃，保温时间为20min ；检测波长为508nm 。
本方法测定XOD 酶活的线性范围为5.0～100.0U /L ，线性关系良好（r =0.9992），检出限为1.3U /L 。
该方法操作简单易行，测定结果准确可靠。
可有效应用于普通实验室和临床常规生化检测。
关键词 黄嘌呤氧化酶，辣根过氧化物酶，酶的活力测定，分光光度法2005-08-30收稿；2005-12-05接受本文系福建省自然科学基金（No.C0410006）和工业生物技术教育部重点实验室基金（No.KLIB-KF200502）资助项目1 引 言黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase ，XOD ，EC 1. 2. 3.22）是一种钼羟类胞质缀合酶。
主要用于痛风、心肌梗塞和细胞损伤后次黄嘌呤和黄嘌呤水平的检测［1～3］。
目前测定黄嘌呤氧化酶活力主要采用NBT /MTS-PMS 比色法、紫外分光光度法、电化学法及放射化学法［4～8］等方法。
但比色法形成的显色物溶解度低，PMS 对XOD 活性有一定的抑制，且NBT 、MTS 和PMS 试剂昂贵。
紫外分光光度法中黄嘌呤和尿酸的紫外吸收波长较接近，直接进行紫外检测，干扰严重。
其余两种方法操作繁琐，仪器设备要求高而难于推广。
本实验根据辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase ，HRP ）［9］和黄嘌呤氧化酶的反应特性，提出了用XOD 偶联辣根过氧化物酶，直接测定黄嘌呤氧化酶活力的新方法。
磁免疫化学发光
化学发光磁酶免疫（MCEIA）
1.简介：
化学发光磁酶免疫检测法是将化学发光分析法，磁性分离技术以及免 疫学方法三者有机结合起来而建立的一种新型快速检测方法。方法中，磁 珠表面包被单克隆抗体后可以特异性地与靶物质(如细菌、病毒、细胞和酶 等)结合，利用磁性粒子所具有的磁响应性，在外加磁场作用下结合磁珠的 靶物质就会被磁场吸附，从而与其它成分分离，达到纯化、富集或消除靶 物质的作用。
2.化学发光类型：
闪光型（flash type）：发光时间很短；只有零点几秒到几秒；样品必须 立即测量，需要配全自动化的加样及测量仪器 辉光型（glow type）：发光时间从几分钟到几十分钟，或几小时至更久； 样品的测量可以使用通用型仪器，也可以配有全自动化仪器
化学发光酶免疫 (Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)
CEIA
MCEIA
MS
化学发光磁酶免疫（MCEIA）
2.原理：
2.1双抗夹心法（直接法）
化学发光磁酶免疫（MCEIA）
2.2 双抗夹心法（二）
化学发光磁酶免疫（MCEIA）
3.技术路线
半抗原
半抗原
FITC
抗体
抗体
FITC抗体
磁珠包被 FITC抗体 FITC标记抗体 酶标记抗体
磁珠包被抗体 酶标记抗体
2.相对于微孔板包被，免疫磁珠引入到定量分析方法后其优势在于：
更好的选择性：免疫磁珠有着大的多的活性比表面积，能提供更多的结合位点， 可以在溶液中较为均一的分散，易于结合位点充分暴露； 更高的灵敏度：免疫磁珠可以利用磁分离器方便地对所形成的复合物富集分离， 使得洗涤结果更彻底、干扰物浓度极大降低和靶物质浓度有效富集，进而提高分 析方 法的信噪比和灵敏度； 更快的反应速度：免疫磁珠可均匀分布在样品溶液中，更易于接近靶物质，从 而加快抗体与靶物质的结合速度。
酶联免疫吸附试验常用的酶和底物
酶联免疫吸附试验常用的酶和底物
酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种常用的免疫学检测方法，其中常用的酶包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
辣根过氧化物酶在底物存在下可以将无色的供氢体转化成有色产物，而碱性磷酸酶可以将底物转化成有色产物。
此外，根据实验需求，还可以选择其他种类的酶，如β-半乳糖苷酶等。
在选择酶时，需要考虑其底物类型、反应速度、稳定性以及成本等因素。
同时，还需要选择合适的底物，以与酶结合并产生颜色反应。
常用的底物包括酚类、硝基苯磷酸盐等，这些底物可以在酶的作用下产生颜色变化，从而用于检测抗原或抗体。
总之，在选择酶和底物时，需要综合考虑实验需求、反应速度、稳定性以及成本等因素。
免疫组织化学技术-1
技术种类： 技术种类：
免疫荧光细胞化学技术 免疫酶细胞化学 免疫胶体金细胞化学技术 亲和免疫细胞化学技术
标本的处理 抗 体的选购 免疫组织化学染色过程
标本的处理
取材 固定 包埋 切片
免疫组织化学染色
（一） 取材
体外培养细胞标本的取材
实验动物、人体材料标本 实验动物、
1. 细胞标本的取材
（1）印片法：将载玻片轻贴在暴露的病 ）印片法： 变区，使脱落细胞粘附于玻片上。 变区，使脱落细胞粘附于玻片上。
缺点
细胞抗原在酶消化过程中暴露某些抗原 决定簇的同时，将破坏部分抗原。 决定簇的同时，将破坏部分抗原。 酶消化对某些膜抗原、激素受体、 酶消化对某些膜抗原、激素受体、癌基 因及部分淋巴细胞抗原，不但没有增强， 因及部分淋巴细胞抗原，不但没有增强， 相反有破坏作用，重者细胞结构受损， 相反有破坏作用，重者细胞结构受损， 增加某些抗原的弥散。 增加某些抗原的弥散。
PLP液 液
赖氨酸-多聚甲醛固定液 （过碘酸-赖氨酸 多聚甲醛固定液） 过碘酸 赖氨酸 多聚甲醛固定液）
适合富含糖类组织的固定，对超微结构 和许多抗原的保存均较好。 配方：分A、B液，需保存在40C冰箱内， 2周内使用。
A液：赖氨酸盐 蒸馏水 赖氨酸盐+蒸馏水 蒸馏水+Na2HPO4+PBS B液：多聚甲醛 蒸馏水 液 多聚甲醛+蒸馏水
石蜡包埋
脱水、 脱水、透明等过程应尽量在温度较低的 环境下进行， 环境下进行，以尽量减少组织抗原的损 失。 组织块可尽量修整得小，使能充分脱水、 组织块可尽量修整得小，使能充分脱水、 透明和浸蜡。 透明和浸蜡。 浸蜡包埋的温度应保持在60 以下 以下。 浸蜡包埋的温度应保持在 0C以下。
abc elisa原理
abc elisa原理ABC ELISA原理ABC ELISA（Avidin-Biotin Complex Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的酶联免疫吸附实验方法，用于检测特定抗原或抗体的存在。
该方法利用亲合性较高的生物素与亲合性较高的亲和素（例如抗体）结合，形成稳定的复合物，从而实现对目标分子的检测。
ABC ELISA的原理是基于酶标记的间接免疫法。
在实验中，首先将待测样品加入到酶标板孔中，使目标抗原或抗体与酶标抗体结合。
然后，通过一系列洗涤步骤去除未结合的物质，以减少背景信号的干扰。
接下来，加入生物素标记的二抗（biotinylated secondary antibody）。
生物素与亲和素（例如亲和素化酶标抗体）结合，形成稳定的复合物。
这样，目标分子就被生物素标记，便于后续的检测。
随后，加入辣根过氧化物酶标记的亲和素（例如辣根过氧化物酶标记的亲和素化酶标抗体）。
辣根过氧化物酶（HRP）能够与生物素结合，在酶标抗体的作用下，HRP会与基质反应产生显色产物。
加入底物溶液，通过底物与HRP的反应，产生可见的颜色变化。
根据颜色的强度可以判断样品中目标抗原或抗体的含量或活性。
ABC ELISA方法具有高灵敏度、高特异性和较低的背景信号，被广泛应用于医学、生物学和生物化学等领域。
它可以用于检测血清中的抗体水平、病毒或细菌感染的诊断以及药物研发等。
然而，ABC ELISA方法也存在一些限制。
首先，该方法需要多个步骤和试剂，操作较为繁琐，需要一定的实验技术。
其次，由于标记物的加入，可能会影响目标分子的结构和活性，造成检测结果的偏差。
此外，该方法对样品的处理和存储条件要求较高，以避免样品中其他物质的干扰。
ABC ELISA是一种常用的酶联免疫吸附实验方法，通过亲合素的结合和酶标记的作用，实现对特定抗原或抗体的检测。
该方法具有高灵敏度和高特异性，被广泛应用于生命科学研究和临床诊断中。
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酶制剂及其底物
◆ 凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均 可作为标记用。但作为标记抗体用的
◆ 酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2) 比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能
◆ 用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶 为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶
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（2）辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的原理
a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ）
HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结 合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为 40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差 异，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP的辅 基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以 OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯 度。
法。 辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含
糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗 体分子上的氨基形成Schiff碱而结合。后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺) 还原生成稳定的酶标记抗体。
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在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。游离酶理论上不影响最 终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从而 减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此需要对制备的酶结合物进行 纯化，去除游离的酶和抗体。纯化的方法很多，硫酸铵盐析法最为简便， 但效果并不理想。用离子交换层析、分子筛法可得到最佳的分离效果， 但费用较贵。
◆
HRP
◆
DH2＋H2O2────→D＋2H2O
◆
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物
为
◆ 不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸) 早
◆ 期曾用于ELISA，T(邻 联
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（5）加0.2 mL 新配的5 mg/mL NaBH４液，混匀，再置4 ℃, 2h。 （6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4 ℃ 1h。 （7）3000 r/min 离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗 二次，最后沉淀物溶于少量0.15moL/L pH7.4 的PBS中。 （8） 将上述溶液装入透析袋中，对0.15 moL/L pH7.4的PB缓冲 盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000 r/min 离心30 min 去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
◆ (AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、 溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
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• 由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯 酶容
• 易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白 和棕
◆ 者可高4倍以上。
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• 另外，还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3乙基苯并噻吡咯啉-6磺
• 酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均 好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，
◆ 甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大， 而且
◆ 由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是： OPD
◆ (邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝 绿
◆ 色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比 前
• 色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为 40,000,等
• 电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于 水和
• 58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和 275nm，一
• 般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的 酶RZ值应
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四
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操作步骤
（1）称取5mgHRP溶解于0.5ml蒸馏水中。
（2）向溶液中加入0.5ml新配的0.1M NaIO４溶液，混匀， 4℃静置30 分钟。
（3）加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混匀， 静置30分钟。（4）加入含 5mg抗体的水溶液1ml，混匀装入透析袋，pH9.5 碳酸盐缓冲液透析， 4℃过夜。
实验原理
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（1）免疫标记技术
免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性 的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标 记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的 性质与含量。常用的标记物包括荧光素、酶和放射性 核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称 为3大免疫标记技术。目前，使用的免疫标记物还有化 学发光物质、铁蛋白和胶体金等。
• 在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表 示酶活
• 性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。
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◆ HRP的催化反应需要底物过氧化氢资料(仅H供2参考O,不2当)和之处供，请氢联系体改正(。DH2)。供氢体多为无色的还原型
◆ 染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下:
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢 体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。
HRP DH2＋H2O2────→D＋2H2O
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b. 辣根过氧化物酶标记方法 酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化