不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割1
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。
2．类型：来自原核生物，有三种类型。
Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。
Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。
另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。
同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。
与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。
常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。
但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。
三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。
限制性内切核酸酶的酶切与鉴定实验原理及步骤、注意事项
实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定一、实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。
根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。
限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。
一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。
许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。
例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。
5′……GAATTC……3′3′……CTT AAG…… 5′这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由EcoR I产生的其它分子末端相连接。
限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。
根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。
根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。
小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为50～100 μl，DNA用量在10～30ug。
本实验为EcoR I对质粒pUC18的小量酶切。
在质粒的双链环状DNA分子上有多个限制性内切核酸酶酶切位点。
在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。
二、仪器与试剂1.仪器：水浴锅、离心管、移液器、吸头、电泳设备等。
2.试剂：质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。
实验2-设计性实验-不同限制性内切酶对质粒切割-指导讲解
实验二不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割（设计性实验）设计实验目的：培养学生独立完成实验设计、实验操作和撰写小论文的能力。
设计实验要求：选用1或2种内切酶，将所提供的质粒DNA切割为至少3-4个以上的片段。
设计实验过程：学生根据实验要求，运用学过的知识，先设计实验方案，提交老师批阅认可；再独立进行实验准备和实验；实验结束，撰写设计性实验报告，即小论文1篇。
小论文要求：字数不少于3000，包括论文题目、作者、摘要、关键词、引言、材料与方法、结果与分析、结论或讨论、参考文献等。
设计实验涉及知识点：1）质粒的限制性内切酶图谱；2）质粒酶切鉴定；3）DNA片段的琼脂糖凝胶电泳。
设计实验要求学生独立撰写小论文。
Digestion of plasmid DNA with different restriction endonuclease 不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割一、原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于A TP的存在。
Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子, 然后从底物上解离。
Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶, 它修饰同一识别序列。
Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。
绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ: 5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
限制性内切核酸酶习题及答案
6.通过限制性片段分析，可以对等位基因进行精确的分析比较，其原因是：( ) (a)限制性内切核酸酶只切割两个变异等位基因中的—个 (b)它利用限制性位点作为遗传标记 (c)一个特定细胞中等位基因的核苷酸序列不会是相同的 (d)它不依赖于变异等位基因产物的功能。 (e)限制性内切核酸酶的切点被限制在 DNA 的编码区域内
(a)S1 单链核酸酶 (b)末端转移酶 (c)碱性磷酸酶 (d)Bal31 核酸酶
16 限制性内切核酸酶可以特异性地识别： ( )
(a)双链 DNA 的特定碱基对 (b)双链 DNA 的特定碱基序列
(c)特定的三联密码
(d)以上都正确
17 在下列酶中，催化反应不需要 ATP 的是( )
(a)EcoK (b)EcoB (c)T4DNA 连接酶 (d)BamHI
7.限制性片段长度多态性(RFLP)是：( ) (a)用于遗传的“指纹结构”模式分析的技术 (b)二倍体细胞中的两个等位基因限制性图谱的差别 (c)物种中的两个个体限制性图谱间的差别 (d)两种物种个体间的限制性图谱差别 (e)两种酶在单个染色体上限制性图谱的差别
8.为了正确地构建一个真核基因组的物理图谱：( )。 (a)必须有可能清晰地分离各个染色体(通过脉冲场凝胶电泳)
18 下列关于限制性内切核酸酶的表示方法中，正确一项的是(
(a)Sau 3A I (b)E．coR I (c)hindⅢ (d)Sau 3A 1
19 限制性内切核酸酶的星号活性是指：( )
(a)在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性
(b)活性大大提高
(c)切割速度大大加快
实验五 DNA的限制性内切酶酶切反应(定稿)
实验五DNA的限制性内切酶酶切反应DNA restriction enzyme digestion一、实验目的通过本实验掌握DNA的限制性内切酶酶切反应的基本原理与实验过程。
二、实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA 序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP 的存在。
Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA 分子,然后从底物上解离。
Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。
绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4 至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA 片段(如Sma:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA 片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3' →5'…G AATTC…3' ；3'…CTTAA↑G …5' →3'…CTTAA G…5' 。
Pvu I 的识别序列5'…ＣＧＡＴ↓ＣＧ…3' →5'…ＣＧＡＴＣＧ…3'三、实验仪器与设备水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉,紫外透射仪,凝胶成像系统四、实验材料与试剂pUC18质粒：2686bp，0.5μg/μl，40μl/管（日本东洋纺织株式会社） Pvu I 酶及其酶切缓冲液：10U/μl，200U/管（北京鼎国昌盛生物技术有限公司），在pUC18质粒上有两个酶切位点，分别为酶切第一个碱基位是276（896bp）、2066（1790bp)10X的酶切反应体系（使用时酶切反应体系为1X）琼脂糖(Agarose) 溴化乙锭：5×TBE 电泳缓冲液：（使用时稀释10倍）6×电泳载样缓冲液：五、实验步骤1.将清洁干燥并经灭菌的eppendorf 管(最好0.2ml)编号,用微量移液枪分别加入pUC18质粒2μl（1μg）和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水15μl（使总体积为19μl）, 用手指轻弹管壁使溶液混匀,然后加入1μl 酶液,用吸头轻轻抽吸数次混匀酶切反应物，用微量离心机2000rpm数秒,使溶液集中在管底。
ｄｎａ的限制性酶切反应
ＤＮＡ的限制性酶切反应实验目的学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性核酸内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
通过对DNA的酶切，学会设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
实验原理核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等动物的免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。
限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。
根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。
Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。
Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。
故Ⅰ类和Ⅲ类酶在基因工程中基本不用。
Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶。
它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段；Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序；Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。
体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性核酸内切酶都不能在目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或者两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能够得到完整的目的基因。
其次，选择具有相应的单一酶切位点的质粒、噬菌体等载体分子作为克隆的载体。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
实验五 质粒DNA酶切(质粒限制性内切酶消化酶切)
p C A M B IA 1 3 0 2
10549 bp
Kan
Eco RV (6218)
大p肠BR杆3菌22复or制i 起始位点
pVS1-REP 农杆菌复制起始位点
二、限制性内切酶
1) 概念 2) 命名原则 3) 类型 4) 基本特性及用途 5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素 6)Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项
实验原理
• 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为 限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附 近的特异位点上，并切割双链DNA。
限制性内切酶EcoR Ⅴ 特异性识别位点为：
GATATC CTATAG
产生平末端：
GAT ATC CTA TAG
则pCAMBIA1302经EcoR Ⅴ酶切后产生大小分别为：1600bp、 2624bp和6325bp的三条DNA 片段
属名
种名 株系
Haemophilus influenzae d
流感嗜血杆菌d株
HindⅡ HindⅢ
同一菌株中所含的多个不同的限制性核割特性、催化条件及是否具有修饰酶活 性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三类。
4) 基本特性及用途
Ⅱ限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切 方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′ 端为OH，识别序列一般为4～6个碱基对，通常是反转录重复 顺序，具有180°的旋转对称性即迴文结构。Ⅱ限制性核酸内切 酶切割双链DNA产生3种不同的切口。
第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源 基因的插入。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源 DNA片段。 一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
酶切鉴定实验报告
一、实验目的1. 掌握限制性核酸内切酶的酶切原理和应用；2. 学习质粒DNA的提取、纯化方法；3. 掌握琼脂糖凝胶电泳技术及其在DNA分析中的应用；4. 通过酶切鉴定，验证目的基因的插入和表达。
二、实验原理限制性核酸内切酶（Restriction Enzyme）是一种特殊的核酸酶，能够识别特定的DNA序列并在这些序列上切割双链DNA。
根据识别序列的长度和切割方式，限制性核酸内切酶分为两类：I类酶和II类酶。
其中，II类酶在分子生物学实验中应用最为广泛，如EcoRI、BamHI、HindIII等。
酶切鉴定实验的原理是：通过将目的基因与载体连接，构建重组质粒。
然后，利用限制性核酸内切酶对重组质粒进行酶切，观察酶切后的DNA片段长度，以判断目的基因是否成功插入载体。
三、实验材料1. 试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液、T4 DNA聚合酶、dNTPs、琼脂糖、电泳缓冲液、DNA分子量标准等；2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、紫外分光光度计等；3. 样品：重组质粒、载体DNA、目的基因DNA等。
四、实验步骤1. 质粒DNA的提取和纯化（1）取含有重组质粒的细菌，用碱裂解法提取质粒DNA；（2）将提取的质粒DNA进行酚-氯仿抽提和乙醇沉淀，得到纯化的质粒DNA。
2. 重组质粒的构建（1）取目的基因DNA和载体DNA，分别进行PCR扩增；（2）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定目的基因和载体DNA的大小；（3）利用DNA连接酶和T4 DNA连接酶，将目的基因连接到载体上；（4）转化大肠杆菌，筛选阳性克隆。
3. 酶切鉴定（1）取重组质粒和载体DNA，分别进行酶切反应；（2）将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切后的DNA片段长度；（3）根据酶切结果，判断目的基因是否成功插入载体。
4. 结果分析根据琼脂糖凝胶电泳结果，比较重组质粒和载体DNA的酶切产物。
若重组质粒在目的基因插入位点附近出现新的酶切位点，则说明目的基因成功插入载体。
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不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割——PvuⅡ和HindⅢ对pUC19-P35S:ARF8双酶切费欢 1014100060广州大学生命科学学院生物科学2010级摘要为加深对限制性内切核酸酶切割质粒DNA的位点特异性和其专一性的认识，采用PvuⅡ和HindⅢ两种酶双酶切质粒DNA，从而验证不同限制性核酸内切酶对质粒DNA具有不同的切割结果。
采用限制性内切酶PvuⅡ和HindⅢ共同对pUC19-P35S:ARF8进行切割，再用琼脂糖凝胶电泳加以分离，得到电泳图谱，对照分子量标样加以鉴定。
结果获得6条带，大小分别为2366bp,2264bp,499bp,436bp,370bp,179bp。
关键词限制性核酸内切酶PvuⅡ和HindⅢ、质粒DNA、双酶切、琼脂糖凝胶电泳引言：限制性核酸内切酶主要存在于原核生物，它能将外来的DNA 切断，即能够限制异源DNA 的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA 却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。
它不同于一般的脱氧核糖核酸酶（DNase），限制性核酸内切酶的切点大多很严格，要求专一的核苷酸序列。
限制性核酸内切酶按其性质可分为三大类，即所谓Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型酶。
[1]其中Ⅰ型和Ⅲ型水解核酸要消耗ATP，它既特异性切割核酸又能给特殊碱基加上甲基基团进行修饰，但特异性弱，切割位点不固定; Ⅱ型水解核酸不需要消耗ATP，它只特异性切割核酸并不修饰碱基，其特异性强，切割位点固定。
[2]限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA 分子特异性核酸序列的DNA水解酶。
它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。
本实验可加深对限制性内切核酸酶切割质粒DNA的位点特异性的认识，通过实践充分了解PvuⅡ和HindⅢ两种酶双酶切质粒DNA产生的片段。
研究人员通过使用15种限制性内切酶酶切重组质粒pBKrsv-MLCK，探讨了限制性内切酶的应用和限制性内切酶酶切图谱分析的方法。
[3]近几年，各种动物体内线粒体DNA的酶切分析的研究十分广泛，并取得了一定的成果(宋平,李小迎,熊全沫,1994[4]；戴建华,殷文莉，2004 [5]；关海红,石连玉,刘明华等，2000 [6])，采用Tru 9Ⅰ/EcoRⅠ和TaqⅠ/Pst Ⅰ两种限制性内切酶酶切组合对细鳞鱼的遗传多样性进行研究同样有所帮助（王荻,徐革锋,刘洋等，2009）[7]。
没有限制性核酸内切酶的发现和应用，就没有分子生物学的兴旺发展，在基因工程和分子生物学中，限制性核酸内切酶起着其足轻重的作用。
因此研究限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割具有重要的意义。
1.材料和方法1.1材料1.1.1实验材料重组质粒pUC19-P35S:ARF8由广州大学生命科学学院生化楼分子生物学实验室构建；限制性内切酶：EcoRI购自TaKaRa等生物工程公司；琼脂糖：进口分装。
1.1.2实验设备水平式电泳装置，电泳仪，台式高速离心机，微量移液枪，PCR热稳定仪，微波炉，凝胶成像系统等。
1.1.3试剂5 x TBE电泳缓冲液；无菌水；M缓冲液；10×loading buffer；溴化乙锭溶液母液：将EB配置成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温；DNA分子量标准：从小到大为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。
1.2方法1.2.1 DNA酶切反应1.2.1.1将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管编号，用微量移液枪分别加入DNA 10µl和M缓冲液2µl，再加入无菌水使总体积为19µl，将管内溶液混匀后加入酶液PvuⅡ和Hind Ⅲ各1µl，用微量离心机离心数秒使溶液混匀并集中在管底。
1.2.1.2混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上，37℃水浴保温3小时，使酶切反应完全。
1.2.1.3每管加入5µl10×loading buffer，混匀，以停止反应。
1.2.2 琼脂糖凝胶的制备1.2.2.1取5xTBE缓冲液20ml加水至200ml，配置成0.5xTBE稀释缓冲液，待用。
1.2.2.2胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入50ml 0.5xTBE稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部融化，取出摇匀，此为0.8%琼脂糖凝胶液。
加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。
加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发。
1.2.2.3胶板的制备：将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应于胶槽底面保持1mm左右的间隙。
向冷却至0-60℃的琼脂糖液中加入溴化乙锭（EB）溶液使其终浓度为0.5μg/ml。
用移液枪吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。
倒胶时的温度不可太低，否则凝固部均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。
待胶完全凝固后拔出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后想槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。
因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽总，所以要注意包装样品槽中应注满缓冲液。
1.2.3 电泳分离DNA片段1.2.3.1加样：用微量移液枪取13µl酶解液小心加入样品槽一上样孔，再取9.5µl酶解液加入另一上样孔。
上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
1.2.3.2电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。
控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上，电泳28分钟。
1.2.3.3观察和拍照：在长波长紫外灯下观察已加有EB的电泳胶板，DNA存在处显示出肉眼可辨的荧光条带。
2.结果和分析双酶切质粒DNA 电泳图谱观察0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1213 14 15 16 17图1 限制性核酸内切酶Pvu Ⅱ和Hind Ⅲ对质粒pUC19-P35S:ARF8的双酶切电泳图谱 （栏0：DNA Maker ; 栏2：本实验的酶切图谱）2.1 结果如图1所示，用限制性核酸内切酶Pvu Ⅱ和Hind Ⅲ对质粒pUC19-P35S:ARF8进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，可以看出6条带图谱，通过与DNAMarker 进行比对，判断其片段大小由上至下分别为：2366bp,2264bp,499bp,436bp,370bp,179bp ，而理论上Pvu Ⅱ在质粒DNA 上存在4个切割位点，Hind Ⅲ在质粒DNA 上存在3个切割位点，且两者的位点无重复，因此 Pvu Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切应该产生7个完整清晰的条带图谱，其中129bp 片段由于分子量太小，电泳中跑得太快，与拖尾的杂质部分有部分重叠，模糊或没切到无法辨认。
其中176bp 片段也由于分子量过小，电泳过程中跑太快而有点模糊。
499bp,436bp,370bp 三个片段，由于分子量较小且较相近，以致三个条带不够清晰。
2.2 分析根据限制性内切核酸酶特性可知，Pvu Ⅱ为第Ⅱ类酶，可以切割某一特异的核苷酸序列，是重组DNA 的基础。
本实验中Pvu Ⅱ在质粒pUC19-P35S:ARF8上有4个识别位点，完全酶切可把质粒DNA 切割成4个分子量大小不同的片段，大小分别为2057bp,4500bp,4676bp,5981bp 。
Hind Ⅲ也属于第Ⅱ类酶，可以切割某一特异的核苷酸序列，是重组DNA 的基础。
本实验中Hind Ⅲ在质粒pUC19-P35S:ARF8上有4个识别位点，完全酶切可把质粒DNA 切割成3个分子量大小不同的片段，大小分别为2236bp,5112bp,5611bp 。
Pvu Ⅱ和Hind Ⅲ两种酶所识别质粒DNA 位点都不一致，因此两种酶对质粒pUC19-P35S:ARF8进行双酶切可产生7个大小不同片段，大小分别为：2366bp,2264bp,499bp,436bp,370bp,179bp ，129bp 。
但是，从图1电泳图谱可知，本次实验不成功，最下面出现一个较亮而大的团带，可能是质粒DNA 中含有杂质且分子量比DNA 小导致其在电泳条带图谱的尾部出现。
只可看出6个条带而非7个条带且不够清晰或酶切不完全，经讨论，出现此现象的原因可能有以下：1. 加样时，由于操作不佳，实验者把样品槽底部凝胶刺穿或损坏，影响了DNA 片段的移动。
2. 选择双酶切的两种酶的组合搭配得不好，Pvu Ⅱ和Hind Ⅲ识别的位点多数相近，以致双100bp2000bp 500bp 250bp 750bp 1000bp酶切得到的片段大小较接近且部分较小，电泳中分子量小的跑太快与尾部重叠，片段大小相近的电泳条带不够分离。
3.电泳时间过短，导致酶切的DNA片段跑得不够开。
4.制备反应混合液时没有加入BSA溶液，导致限制性内切核酸酶不稳定，酶活性下降或其酶切机理受到了破坏。
5.加入反应的酶的量过多，导致酶的活性受到了抑制，酶切不完全。
6.反应液混匀后，在室温条件下放置时间过长，影响了酶的活性。
另外，与其他同学和一班的电泳图谱比较，使用单酶切的电泳图谱条带要比双酶切的清晰完整，且选用EcoRⅠ进行单酶切得到的电泳图谱条带较多而清晰。
3.讨论本次实验采用PvuⅡ和HindⅢ对质粒pUC19-P35S:ARF8进行双酶切得到的DNA的电泳图谱不太好，我认为主要是酶的选择不太好，且应该选一种酶进行单酶切，得到的实验结果会更好。
其次，添加试剂的量要把握好，由于添加的试剂的量都是微量，稍微稍加或多加一点，都会对实验结果有较显著的影响。
除此之外，我们对加样操作不够熟练，还是容易出错，导致电泳结果不理想，所以加样时一定要特别地小心谨慎，使用的移液枪枪头要确保没被污染。
4.参考文献[1].陶志坚.限制性核酸内切酶相关知识总结.学知报.2011,01(8):1-3.[2].王智新，王昌留.限制性核酸内切酶及其显带研究进展.鲁东大学学报[J].2011，27( 2) : 154—157.[3].熊江霞,朱华庆,王雪等.限制性内切酶酶切及限制性内切酶酶切图谱分析[J].安徽医科大学学报. 2003, 38 (2):147-148 .[4].宋平，李小迎，熊全沫.鲢鳙线粒体DNA的九种限制性内切酶酶切图谱的比较[J].水产学报.1994,18(3):221-230.[5].戴建华,殷文莉. 丰鲤及其双亲线粒体DNA限制性酶切图谱的研究[J]. 南京师大学报（自然科学版）, 2004, 27 (3)：332-336 .[6] 关海红,石连玉,刘明华等. 黑龙江野鲤线粒体DNA限制性内切酶酶切分析[J]. 水产学杂志, 2000, 13 (1)：256-260.[7].王荻,徐革锋,刘洋等. 两种双酶切组合在细鳞鱼AFLP体系中的比较分析[J]. 大连水产学院学报, 2009, 24 (5)：178-183.致谢在此论文完成之际，我要对论文完成过程中所有的人们表示衷心的感谢。