影响限制性内切酶活性的因素5
在进行限制性酶切反应过程中，影响限制性酶切反应效果的因素较多
在进行限制性酶切反应过程中，影响限制性酶切反应效果的因素较多，要设计酶切反应，一般均应考虑诸如酶切系统、温度条件、反应体积、底物性质及星型反应等因素。
根据各种不同的条件，酶切反应的设计一般应注意以下问题：1. 大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。
当最终反应液中甘油浓度大于12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性，更高浓度的甘油会抑制酶活性。
因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。
（20ul体系酶量2ul是上限，如果切的底物量很大就请放大体系的体积，效果很好！！）2. 浓缩的限制酶可在使用前用1×限制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶失活，用水稀释的酶不能长期保存。
3. 反应体系中Mg2+是限制酶仅有的共同因子，当用其它二价阳离子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA时，酶活性会被抑制，或改变酶的特异性，导致星型反应4. 多种因素可引发星型反应：①非最适的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶浓度大于25u/ug；④盐浓度降低；⑤高浓度甘油的存在(>12%)；⑥有机溶剂的存在。
（呵呵，所以反应是底物一定要处理干净，用ddH2O溶解最好；另：酚会严重抑制梅切！！）5. 反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。
建议酶切反应的DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。
（比如XbaI在质粒浓度高时效果很差就是切不开啦）6. 酶切反应所加入的酶量应适中，根据底物的种类、量的多少和体积的大小而定，对不同的限制酶，各厂家均有一最大的消化量指标可参考。
7. 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时切割，如果这些酶所要求的缓冲液有所不同，则可采用以下两种替代方法：①先用在低离子强度的缓冲液中活性高的酶切割DNA，然后加入适量NaCl及第二种酶，继续反应；②使用能够使多数内切酶均表现较高活性的单种缓冲液。
简析限制性内切酶
简析限制性内切酶限制性内切酶（即限制酶）是基因工程中的必用操作工具之一。
基因工程是近年来高考中的热点，而对于限制酶的考查也是历年高考题中的常考知识点。
1限制酶的作用及影响因素1.1 作用：切割特定的核苷酸序列[高考赏析]（2008，全国I）已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。
现在多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是（）A.3B.4C.9D. 12【答案】C【解析】：每一种限制性内切酶切割DNA后会留下特征性的粘性末端，同时一次切割后，会把DNA分割成两个片段，且不同的内切酶切后的片段不一样。
若在3个酶切点切断，得到4种长度不同的DNA片段；若在2个酶切点切断，得到3种长度不同的DNA片段；若在1个酶切点切断，得到2种长度不同的DNA片段。
因此最多能产生4+3+2=9种长度不同的DNA分子。
1.2 作用结果：形成DNA片段末端黏性末端：错位切，切下后的两端形成一种回文式的单链末端。
平末端：平切，在两条链的特定序列的相同部位切割，形成一个无黏性末端的平口。
[高考赏析]（2008，江苏）将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。
以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。
请根据以下图表回答下列问题。
（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是。
（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。
表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。
请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？__________。
（3）图1步骤③所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求？。
基因工程知识点
名词说明1.基因工程：是将目的基因或DNA片段与适合的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因和蛋白质的活性表达，使转基因生物取得新的遗传性状的操作。
2.限制性内切核酸酶：能够识别双链DNA分子中的某一段特定核苷酸序列，并在此切割DNA 双链的内切核酸酶。
3.同切点酶：又称同裂酶，是一类来源于不同微生物、能识别相同DNA序列的限制性内切核酸酶。
4.同尾酶：是一类限制性内切核酸酶，它们来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同的黏性结尾。
5.酶的星号活性（Star activity）：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的酶的星号活性现象。
连接酶：是能催化双链DNA片段靠在一路的3’羟基结尾与5’端磷酸基团结尾之间通过形成磷酸二酯键，使两结尾连接的一种核酸酶。
7.载体：在基因克隆中能携带外源基因进入受体细胞复制、整合或表达的工具称为载体。
8.多克隆位点：是包括多种同一个限制性酶切点的一段很短的9. α互补：为质粒DNA编码β—半乳糖苷酶的α亚基，宿主细胞可编码β亚基尽管宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们能够融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象叫α互补。
10.黏粒载体（考斯质粒载体）：是一类人工构建的含有λ-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。
11.质粒：是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳固遗传的一类核酸分子12.探针：当用一个标记的核酸分子与核酸样品杂交,即可查明该样品中是不是存在与该标记核酸分子具有同源性的核酸分子。
那个标记的核酸分子称为探针(probe)，能够是DNA，也能够是RNA，或合成的寡核苷酸.13、SD序列：是存在于原核生物起始密码子上游7-12个核苷酸内的一种4-7个核苷酸的保守片段，它与16SrRNA3’端反向互补，因此可将mRNA的AUG起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译作用。
酶切事项
影响限制性内切酶活性的因素包括DNA的纯度、缓冲液、温度及酶本身。
不同的限制性内切酶对缓冲液中盐浓度的要求各不相同。
一般配制高、中、低盐3种缓冲液，用于酶反应。
DNA甲基化，附有蛋白质或高分子量DNA胶体溶液太粘稠均会降低内切酶的消化效率。
由于在限制性内切酶消化反应中，甘油浓度超过5％（V/V）会抑制内切酶活性，因此在20μl 反应体系中，甘油浓度应少于lμl。
用2种酶消化DNA时，各种酶所需盐浓度相同，则消化可同时进行；若需要的盐浓度不相同，则必须先用低盐浓度的限制性内切酶消化完后，再调整到高盐缓冲系统，加入高盐浓度的限制性内切酶，继续消化。
由于loadingbuffer中有高浓度的甘油，因此加入loadingbuffer后会是酶失活。
酶切实验中的注意事项:1)反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在温室的放置时间。
2)反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整。
3)反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底4）DNA或酶切试剂中混有DNase，在一定的温度或缓冲液的作用下，激发DNase的作用，将DNA降解。
如果楼主得试剂和步骤是正确，既排除了其他因素（试剂，体系，有没有混匀等）。
因为大多数内切酶失活，都是因为酶蛋白本身结构得不可逆改变，各种亚基团不稳定至分离等（如甘油得浓度增大，温度增大65度以上）。
所以，向楼主说得在室温放置一个小时，一般不会失活，只是酶切效率降低而已，但反应还是进行得，这样酶就在消耗，酶本身得活性基团在分离，再拿到37度，效率肯定会低，甚至没活性，导致酶切看不到条带（如果你的酶切片断小得话，拿PAGE跑，可能会看到带）。
基因工程复习题
基因工程复习题一、名词解释 201.转导：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程。
2.转染：以噬菌体为载体，不经过蛋白包装成病毒颗粒，而是用DNA连接酶使噬菌体DNA 环化，再通过质粒转化方式导入受体菌的过程。
3.质粒：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。
4.基因库：特定生物体全基因组的集合（天然存在）。
5.转化率：每μgDNA转化成功的细菌克隆数。
6.同尾酶：来源和识别序列不同，但能切出相同的粘性末端的限制性内切酶。
7.同裂酶：来源不同，识别位点的序列相同的限制性内切酶。
8.Ti质粒：在根瘤土壤杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的环形双链DNA分子，它控制根瘤的形成，可作为基因工程的载体。
9.SD序列：mRNA的核糖体结合位点，含有一个启始密码子和一段同核糖体16S RNA3’末端碱基互补的序列，3-9个核苷酸,富含嘌呤,位于起始密码子上游3-11个核苷酸处10.cos位点：DNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为cos位点。
11.基因工程：通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。
12.报告基因：编码产物能够被快速测定、不依赖于外界压力的一类基因。
13.平台效应：PCR反应经过一定数量的循环后，随着产物的对数积累趋于饱和，DNA片段不再呈指数积累，而是进入线性增长期或静止期，此过程称为平台效应。
14.受体细胞：是能摄取外源重组DNA并使其稳定维持和表达，或有待于实施遗传改良的细胞。
15.cDNA library：将生物特定的组织器官或特定发育时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的转录本。
16.穿梭质粒载体：人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。
分子生物学问答题
分⼦⽣物学问答题问答题第⼆章⼀、⽤于基因重组的载体需要具有哪些条件？1）具有⾃主复制能⼒，保证重组DNA分⼦可以在宿主细胞内得到扩增2）具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染⾊体DNA分开，便于分离提纯3）分⼦质量相对较⼩，易与操作，并能够容纳较⼤分⼦质量的⽬的基因4）具多个单⼀限制性内切酶位点，便于⽬的基因克隆5）有⼀个或多个筛选标记（如对抗⽣素的抗性、营养缺陷型或显⾊表型反应等）6）具有较⾼的遗传稳定性⼆、限制性内切酶主要分为⼏个类型？各有什么特点？限制性内切酶主要分为三种类型，即Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。
Ⅰ型和Ⅲ型酶⼀般都是⼤的、多亚基的蛋⽩质复合物，同时具有内切酶活性和甲基化酶活性。
均需ATP ⽔解供能。
Ⅰ型酶能够识别特异的核苷酸序列，但是切割位点是随机的，Ⅲ型限制酶从距离识别位点⼀侧约25bq处单链切割DNA分⼦。
识别序列是⾮对称的，现在已知的酶数量相当少。
Ⅰ型和Ⅲ型酶在DNA重组技术中⽤处不⼤。
Ⅱ型限制性核酸内切酶只有⼀种多肽，通常以同源⼆聚体形式存在，核酸内切酶活性和甲基化作⽤活性是分开的。
⽆需ATP⽔解供能，仅需Mg2﹢参与。
具有序列特异性，可对靶DNA进⾏精确切割，在DNA 重组技术中有特别⼴泛的⽤途。
三、影响限制性内切酶作⽤的因素有哪些？DNA第底物的纯度、DNA的甲基化程度、DNA分⼦的结构、酶切反应的温度、酶切反应的时间、酶切反应的缓冲体系等四、DNA连接酶主要有哪些应⽤？1）作为DNA重组技术的重要⼯具酶，催化两个具有黏性末端或平末端的DNA⽚段5’-P和3’-OH之间形成磷酸⼆酯键，组成新的重组DNA分⼦。
2）在DNA复制中发挥接合缺⼝的作⽤，这种单链缺⼝是由复制叉上的不连续性所产⽣3）在DNA损伤修复、遗传重组、及DNA链的剪接中起缝合缺⼝的作⽤五、反转录病毒载体有哪些优点？1）具有⼴泛的哺乳动物细胞宿主2）可主动感染分裂细胞3）感染细胞后，病毒基因组反转录⽣成双链DNA，可整合到宿主染⾊体中，与染⾊体同时复制，持续表达外源基因4）基因组⾃⾝含有完整⾼效的调控元件六、腺病毒载体有哪些优点？1）可插⼊⼤⽚段外源基因，可达35kb2）宿主范围⼴，尤其⼈类是腺病毒的⾃然宿主3）不仅可感染分裂期细胞，也可感染⾮分裂细胞4）病毒滴度⾼，可达10^9-10^11pfu/ml5）可原位感染组织，如肺等6）重组载体进⼊细胞后并不整合到宿主染⾊体DNA上，⽽是游离于染⾊体外瞬时表达，安全性好七、腺病毒载体有哪些不⾜？①病毒基因组较⼤，构建载体较复杂②⼏乎可感染所有细胞，缺乏特异性③载体不发⽣整合，导致⽬的基因只能短暂表达，因此需要重复应⽤，可能诱发机体的免疫反应第三章①化学合成法已知⽬的基因的核苷酸序列，或根据基因产物的氨基酸序列推导出其核苷酸序列，可利⽤全⾃动DNA合成仪化学合成该⽬的基因。
限制性内切酶的说明
限制酶使用说明一、分类目前，已被发现的限制酶，根据其反应的必须因子和切断点等特性，被分为以下三大类：类别反应必须因子切点酶例 I 型 s-腺苷基蛋氨酸、ATP、Mg2+识别部位和切点不同，切断部位不定Eco B、Eco KII 型 Mg2+切断识别部位或其附近的特定部位Eco R I、Bam H I III 型 ATP、Mg2+识别部位和切点不同，但切断特定部位Eco P I、Hin f III 应用于基因工程研究用的限制酶，一般全是II型酶，现在市场上销售的酶都属于II型酶, 这些限制酶由于其反应条件和底物DNA种类的不同，其切断状况及出现Star活性的频率等各有不同，并且其程度也根据酶的不同而千差万别。
因而在使用限制酶时，必须对这些要素充分注意，确保目标序列的切断反应能顺利进行，下面具体介绍一下使用限制酶时的一些注意点。
二、注意事项1. 甲基化的影响从带有DNA甲基化酶基因的宿主菌中制备的DNA，其碱基的一部分已经被甲基化，因此即便使用能够识别、切断被甲基化部分的序列的限制酶，也几乎无法切断被甲基化的部分。
被甲基化的部位，根据底物DNA及宿主种类的不同而不同。
例如宿主菌为大肠杆菌的情况下，根据宿主的种类有以下两种情况：在进行转化时，通常使用的菌株为C600、HB101、JM109等，因为都带有dam、dcm甲基化酶，所以使用这些菌株制备的DNA时，必须注意。
另外，动物由来的DNA，CG序列多为5m CG；植物由来的DNA，CG及CNG序列多为5m CG和5m CNG。
2. Star活性限制酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性可能降低。
即可以把与原来识别的特定的DNA序列不同的碱基序列切断，这个现象叫Star活性。
Star活性出现的频率，根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同，可以说几乎所有的限制酶都具有Star活性。
并且，它们除了识别序列的范围增大之外，还发现了在DNA的一条链上加入切口的单链切口活性，所以为了极力抑制Star活性，一般情况下，即使会降低反应性能，我们也提倡在低甘油浓度、中性pH、高盐浓度条件下进行反应。
限制性内切酶酶切的常见问题及解决...
限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法（The common problems and solutions of restriction endonuclease digestion）The common problems and solutions of restriction endonuclease digestionRestriction enzyme digestion of the common problems and solutions, personally feel very well summed up, specially posted for you to share.Enzyme digestion problems, see enzyme instructions, the corresponding reagent company directory. The enzymes produced by different companies, the source of strains, the preparation process, purity, viability and enzymatic activity may be optimized differently,.Can be found in the above definition, unit of enzyme preservation conditions, enzyme system of [buffer and other enzymes such as buffer, double cut enzyme reaction temperature [some enzymes in 50, 55 or 30 temperature reaction, whether methylation affects the enzyme activity and whether there is an asterisk, asterisk may appear live factors and protective base, isocaudarner, isoschizomer1. enzymes can not be cut or incompleteThe 1.1 plasmid is the most common or poorly expressed inhibitor. The presence of miscellaneous proteins can affect enzyme digestion, showing A260/A280 below 1.8; inhibitors are common in phenols, salts, and ethanol; [re DNA, using reliable kits or reliable manual extraction reagents,1.2 enzyme problems: make sure the enzyme is effective [although many enzymes have expired time, but expired as long as the enzyme can be effectively cut, available. Make sure the enzyme is not effective. Mark it and replace it.[note] topic: by endonucleaseA. endonuclease, if no special requirement, keep -20~-30 degrees. Is not as low as possible, the enzyme is usually preserved in 50% glycerol buffer, when the temperature is too low, will freeze (enzyme transport process exception, because the enzyme requires low temperature transport, so the convenient situation is the use of dry ice, the enzyme will freeze, but the freezing times is limited, is a relatively better choice), if is often used, the enzyme will be repeated freezing and thawing, thereby reducing the activity. Of course, if the temperature is too high, ha ha, you want to go.B. enzyme should be used in ice box for enzyme extraction. It's clear to everyone, but it's no harm putting too much emphasis on it. Some of the students because the lab is put out, the enzyme in the ice box, but there are two ignored: when taking the enzyme, the hand does not hold the upper end of the pipe, and the grip at the bottom, equivalent to hand in to the enzyme by heating; some enzymes are placed in the ice box, but the absorption of the enzyme when will the enzyme take out. Once or twice a day, it can affect enzyme activity.C. enzyme should be tightened as soon as possible after the lid. Sometimes we can find that even if -20~-30 degrees are placed,the enzyme will freeze. That is because of personal reasons may be cut in the configuration when the enzyme reaction, enzyme tube lid open for a long time, glycerol will absorb moisture in the air, for large packaging commonly used enzyme sometimes arise freezing phenomenon. In addition, sometimes, because of careless operation, some of the broken ice congealed on the ice box fell into the enzyme tubes. (I appeared two times myself. SweatD. uptake of enzymes by tips. We used to take the enzyme tips is the smallest of the kind, suitable for 2ul and 10ul guns, but tips usually has two kinds, one is the most commonly used short tips, with it next to the enzyme, tips enzyme, the gun is almost to be inserted into the pipe, sometimes stained with enzyme in the gun body. Therefore, it may cause pollution. Then, we need to pay great attention to the action, or change to another long tips, specially for the enzyme solution.1.3 buffer problem. Some enzymes cut buffer, adding a number of easier to precipitate or dissolved components [ligase buffer is more like this], and sometimes when the enzyme buffer is not completely melted, the concentration of buffer is heterogeneous. The new buffer melts first, and the salt ion concentration is high. After a period of time, the concentration of the ions in the melt decreases. Normally, this has little effect, but problems arise if you use some enzymes that are sensitive to the concentration of ions.1.4 double enzyme buffer selection: make sure the correct buffer and reaction temperature are used [refer specifically to the enzyme buffer cut from the manufacturer and double enzymecut buffer, where NEB is availableHttp://www.neb-china.COM / CN /技术/重/ double_digests.htm1.5酶切位点的甲基化影响：有时甲基化会影响酶切，常见的有Xba I、Bcl I等。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
3. 功能
自我保护作用
细菌的限制和修饰系统（R/M体系）
任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制
寄主的限制与修饰现象
phage λ (B) EOP=1
E.O.P 成斑率 efficiency of plating
EOP=10-4（限制作用）
大肠杆菌B
大肠杆菌K
EOP=10-4（限制作用） 修饰的phage λ (K)
实际应用中，R常被省略。
Escherichia
Coli
Ry13
EcoR I
属名 种名 株系 编号
若种名头 2个字母相同则其中一个可用种名的第一和
第三个字母。
限制性内切酶的类型
目前鉴定出四种不同类型的限制性内
பைடு நூலகம்
切酶。据限制性核酸内切酶的识别切割
特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，
可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。
5、限制性内切酶对DNA的消化作用
限制性核酸内切酶概念
限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp)，
并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。
1. 来源 2. 性质
主要来源于原核生物
内切酶
即在核酸分子链的内部制造切口的酶。 形成5’-P和3’-OH末端
工具酶
基因工程的操作，是在分子水平上的
操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，
连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行 人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些 酶称之为“工具酶”。
第一节
限制性核酸内切酶
1、限制-修饰系统
2、限制性核酸内切酶的命名和类型
3、II型限制性核酸内切酶的基本特性
4、影响限制性内切酶活性的因素
个字母的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基
本名称。
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示；
流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示
2. 如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株
名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因 位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母 表示此染色体外遗传成分。 如
限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA， 维护宿主遗传稳定的保护机制。
（2）修饰（Modification）
细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保
护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。
① Dam甲基化酶(DNA Adenine Methylase) GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基
② Dcm甲基化酶(DNA cytosine Methylase) CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上 引入甲基 修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自 身遗传物质和外来遗传物质的目的。
EOP=1（修饰作用）
人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所 谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系类 似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。
（1）限制（Restriction）
限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分 解，切成小片断。
二、限制性内切酶的类型
据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修 饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。
基因工程中使用 主要特性 限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列 切割位点 Ⅰ型 双功能（具甲基化） 异源三聚体 ATP Mg2+ SAM 距识别序列1kb处 随机性切割 Ⅱ型 单一功能 同源二聚体 Mg2+ 4-6bp回文序列 识别序列内或附近 特异切割 Ⅲ型 双功能（具甲基化） 异源二聚体 ATP Mg2+ 距识别序列下游 24-26bp处 随机性切割
Hind Ⅱ：d菌株
EcoR I ：抗药性R质粒
3. 如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修
复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的
先后次序。
如Hind Ⅱ：d菌株中发现的第二个酶
4. 所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名
称。限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。 如 R.Hind Ⅲ表示限制性内切酶 M.Hind Ⅲ 表示相应的甲基化酶
• 根据作用的核酸底物不同:
特异水解断裂RNA分子，核糖核酸酶（RNase） 特异水解断裂DNA分子，脱氧核糖核酸酶（DNase） 非专一性酶，底物或者为DNA或者为RNA • 按水解断裂核酸分子的方式:
从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫外切核酸酶 从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫内 切核酸酶
第一节
限制性核酸内切酶
1、限制-修饰系统
2、限制性核酸内切酶的命名和类型
3、II型限制性核酸内切酶的基本特性
4、影响限制性内切酶活性的因素
5、限制性内切酶对DNA的消化作用
限制性内切酶的命名
1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，
命名原则如下： 1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3
第二章
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节
基因工程的酶学基础
限制性内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶和反转录酶 DNA修饰酶 外切核酸酶 单链内切核酸酶 RNA酶
基本概念及其生物功能
核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸 二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的 蛋白酶。
（3）限制与修饰系统相关的三个基因
① hsd R: 编码限制性内切酶 这类酶能识别DNA分子上的特定位点，并将双 链DNA切断 ② hsd M: 编码限制性甲基化酶 这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化， 即起修饰 DNA的作用。 ③ hsd S: 编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达 作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。
限制和修饰作用的分子机制
1.大肠杆菌宿主细胞 K株，B 株 ，有各自的限制和 修饰系统。 2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K株，B株
中，
1 ）宿主细胞甲基化酶，将染色体 DNA 和噬菌体
DNA特异性保护.
2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点 --
----（修饰）
3. 外来 DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降 解 ------（限制） 4. 由于降解不完全，外来少数 DNA分子在宿主细胞中 繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外 来却不被降解。 5．接受了新宿主菌甲基化修饰的同时，丧失了原宿主 菌修饰的标记，丧失在原宿主细胞中的存活能力。 基因工程中，应采用缺少限制作用的菌株作为受体。