植物生物技术实验课程安排

《植物生物技术》实验课程安排实验内容：

实验一、培养基母液的配制

实验二、愈伤诱导培养基的配制

实验三、外植体的剥离与农杆菌侵染

实验四、愈伤组织继代培养

实验五、愈伤分化培养基的配制及继代

实验六、愈伤苗继代与观察

实验七、愈伤苗生根与再生

实验八、阳性苗的鉴定与培养

实验一、培养基母液的配制

(一)知识要点讲解

培养基的主要成分、灭菌方式、注意事项等。

(二)实验前期准备

试剂：

MnSO4•H2O，ZnSO4•7H2O，H3BO3，Na2MoO4•2H2O，CuSO4•5H2O，CoCl2•6H2O，KI，KNO3，(NH4)2SO4，KH2PO4，MgSO4•7H2O，Na2-EDTA•2H2O，FeSO4•7H2O，CaCl2•2H2O，肌醇，脯氨酸，维生素B1水溶，微生物B6水溶，甘氨酸，烟酸。

器材：

500 ml烧杯2个，200 ml 烧杯5个，100 ml烧杯1个；需已灭菌的如下玻璃瓶，500ml 玻璃瓶2个，250 ml 玻璃瓶5个，100ml玻璃瓶1个；玻璃棒8根；0.22um滤头若干。

万分之一天平，千分之一天平。

(三)分组实验操作

全班分成六组，每组分别配制如下母液：

1)CI/R 100× stock 200 ml

100 mg/L维生素B1，35 g/L 肌醇，69 g/L脯氨酸

2)T 100× stock 200ml

40 mg/L维生素B1，10 g/L 肌醇

3)CuSO4 1000× stock 100 ml

125mg CuSO4. 5H2O溶于100 ml ddH2O

4)MS（微量元素）100× stock 500 ml

5)N6（大量元素）40× stock 500 ml

6)N6（铁盐）200× stock 200 ml

7)B5（有机成分）250× stock 200 ml

8)CaCl2 200× stock 200 ml

4-8配方见附表。

在超净台上过滤灭菌或高压灭菌，储存于4 ℃。

(四)小组讨论与总结

附表一、培养基母液配方

实验二、愈伤诱导培养基的配制

(一)知识要点讲解

培养基配制的要点、抗生素的作用、注意事项及其他。

(二)实验前期准备

试剂：麦草畏，2,4-D，6-BA，潮霉素，特泯菌，MS培养基，麦芽糖，干酪素水解物，植物凝胶，0.1 M NaOH，1M NaOH，无水乙醇，上周所配母液。

器材：千分之一天平，500 ml烧杯6个，500ml 三角锥形瓶6个，1L三角锥形瓶6个，9cm组培培养皿200付等。

(三)分组实验操作

全班分成六组，每组分别配制1L CI培养基或1L CIS培养基。

1)抗生素的配制

a.Dicamba：2.5mg溶于1ml ddH2O，配成2.5 mg/ml母液。

b.2,4-D：2.5mg溶于1ml 无水乙醇，配成2.5 mg/ml母液。

c.6-BA：1 mg溶于1ml ddH2O（含几滴1M NaOH），配成1.0 mg/ml母液。

2)CI培养基成分

Callus Induction：4.3 g/L MS培养基，30 g/L麦芽糖（Maltose），1.0 g/L干酪素水解物，350 mg/L肌醇，690 mg/L脯氨酸，1.0 mg/L盐酸硫胺（VB1），

2.5 mg/L麦草畏（Dicamba），1.25mg/L 五水硫酸铜，

3.5 g/L植物凝胶。pH=5.8，

0.1M NaOH调节。

3)培养基的配制

a)配制2×植物凝胶，121℃，20min，高压灭菌。

b)以2×浓度添加其他培养基成分，溶解，调节pH到5.8，用过滤

器灭菌。

c)将2×植物凝胶和2×培养基成分在60℃水浴锅加热。

d)在超净台上将储存液逐一添加到热的培养基成分中。

e)混合2×植物凝胶和2×培养基成分。

f)倒入9 cm平板。

4)CIS培养基的配制

CI过滤灭菌培养基+潮霉素50mg/L+特泯菌160mg/L。于4 ℃保存。

(四)小组讨论与总结

实验三、外植体的剥离与农杆菌侵染

(一)知识要点讲解

农杆菌侵染愈伤组织再生成苗的技术要点，以大麦为例。

(二)实验准备材料

实验材料

大麦幼胚若干

试剂器材

50%(v/v)次氯酸钠，70%乙醇；

尖头镊子一对/组、50 ml离心管一个/组、无菌滤纸、超净台等。

(三)分组实验操作

全班两两一组，在超净台无菌操作。

1)幼胚消毒与分离

2)幼胚无菌培养

3)农杆菌侵染与共培养

4)幼胚转移与筛选

详情见实验操作讲解。

(四)小组讨论与总结

实验四、愈伤组织继代培养

(一)知识要点讲解

阳性愈伤的判断、继代培养技术要点；

介绍其他植物遗传转化技术要点。

(二)实验准备材料

实验材料

上周所转化的愈伤。

试剂器材

CIS培养基，镊子，无菌滤纸等。

(三)分组实验操作

全班两两一组，在超净台无菌操作。

详情见实验操作讲解。

(四)小组讨论与总结

实验五、愈伤分化培养基的配制及继代

(一)知识要点讲解

分化培养基配制要点、抗生素的作用、注意事项及其他。

(二)实验准备材料

材料：之前所转化的愈伤。

试剂：2,4-D与6-BA储存液，潮霉素，特泯菌，MS培养基，麦芽糖，硝酸铵，脯氨酸，干酪素水解物，肌醇，植物凝胶，0.1 M NaOH，之前所配母液。

器材：千分之一天平，500 ml烧杯6个，500ml 三角锥形瓶6个，1L三角锥形瓶6个，9cm玻璃培养皿60付，9cm塑料培养皿60付，250ml组培瓶30个等。

(三)分组实验操作

全班分成六组，分别配制2L T培养基、2L B13M培养基、2L R培养基。

1)培养基成分

Transition：2.7 g/L MS培养基（不含NH4NO3），20 g/L麦芽糖，165 mg/L NH4NO3，750 mg/L谷氨酰胺，100 mg/L肌醇,0.4 mg/L盐酸硫胺，2.5 mg/L 2,4-D，0.1 mg/L 6-BA，1.25mg/L 五水硫酸铜，3.5 g/L植物凝胶。pH=5.8，

0.1M NaOH调节。

Regeneration: 4.3 g/L MS培养基，20 g/L麦芽糖，1.0 g/L干酪素水解物，350 mg/L肌醇，690 mg/L脯氨酸，1.0 mg/L盐酸硫胺，3.5 g/L植物凝胶。pH=5.8，

0.1M NaOH调节。

B13M：按比例添加母液成分，0.65g/L脯氨酸，0.5 g/L干酪素水解物，0.1g/L 肌醇，30 g/L麦芽糖。

2)培养基的配制见实验二

3)继代培养转移

全班两两一组，在超净台无菌操作。