枯草芽孢杆菌发酵过程控制及最优碳源筛选
饲用枯草芽孢杆菌发酵工艺的优化及菌剂制备
饲用枯草芽孢杆菌发酵工艺的优化及菌剂制备吴东;刘惠琴;徐力;田永强【摘要】[目的]为饲用枯草芽孢杆菌的大规模生产奠定基础.[方法]通过单因素试验和正交试验,对发酵培养基配方及其发酵条件进行优化.[结果]饲用枯草芽孢杆菌的最佳培养基为:葡萄糖3％、酵母浸膏1.5％、磷酸氢二钠0.2％、磷酸二氢钠0.1％、硫酸镁0.1％、酵母浸粉0.5％.饲用枯草芽孢杆菌的的最适发酵条件为:温度38℃,初始pH7.0 ～7.2,摇床转速180 r/min,接种量7％.选择木屑质量与发酵液体积(m/V)的混合比为3∶5,继续高温发酵16 h,芽饱产量可达到5.18×1010CFU/g.[结论]该研究可为饲用枯草芽孢杆菌的工业化生产提供了数据支持.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2015(000)019【总页数】4页(P134-137)【关键词】枯草芽孢杆菌;发酵工艺;优化;菌剂;制备【作者】吴东;刘惠琴;徐力;田永强【作者单位】兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070;兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070;兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070;兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070【正文语种】中文【中图分类】S816.6饲用抗生素的使用在我国过去的很多年内对养殖业的发展作出了突出的贡献。
但是，随着社会和科技的发展，人们对食品安全越来越重视，抗生素产生一系列负面问题(如耐药性)，引起饲料用药及治疗用药量越来越高，并且过量使用抗生素容易导致动物生产能力降低［1］。
枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，由于其在自然界广泛分布，枯草芽孢杆菌产生孢子时能分泌许多种酶类物质和生长因子，稳定性极好，具有耐氧化、抗挤压、耐高温、耐酸等特征［2］。
此外，枯草芽孢杆菌抗逆性很强，能够储藏的时间较长，它在颗粒或粉料中都有较强的稳定性，也能够很通顺地进入动物的大小肠道生存并且能够大范围繁殖，是在微生物饲料添加剂中应用最为广泛的益生菌。
饲用枯草芽孢杆菌发酵条件的优化
０ １ 大豆 粕 １ 淀 粉 ０３ ３０ ％浓 度 的硫 酸锰 ． ％、 ０ ％、 ．％、．８
７５ ７８ ８ ，在接 种 量 ５ ，温 度 ３ ℃ ，转 速 ２ ０ ．、 ．、 ． ０ ％ ０ ２
１ 材 料 与 方 法
１１ 材 ． 料
供 试 菌种 为枯 草 芽孢 杆菌 ， 由湖南
ｒ ｎ条 件下 培养 ２ ， 定其 Ｄ 鲫 值 。 ３转 速对 ／ ｍｉ ４ｈ 测 Ｄ （）
生长 量 的影 响 ： 取 １０ ２ ０ ２ ０ ２ ０ ３ ０ｒ ｉ 选 ５ 、０ 、２ 、５ 、０ ｍ ｎ５ ／
的优化培养基为 ： 葡萄糖 Ｏ５ 淀粉 ０３ 豆粕 ３ 磷酸氢二钾 ０３ 磷酸二氢钾 ０１％、 ．％、 ．％、 ％、 ．％、 ．５ 硫酸镁 ００ ％、 ． ５ 酵母膏 ００ ％、 ．２ 氯化铁 ０ １ 碳酸钙 Ｏ０ ％、．８ ． ％、 ０ ．１ ３０ ％硫酸锰 ０２ｍ 。最适 发酵条件为： ． Ｌ 发酵 温度 ３ ℃， Ｏ 初始 ｐ ．～ ．， Ｈ ７０ ７２ 摇床转速 ２ ０ｒ ｉ ， ２ ｍ ｎ 接种量 １ ％。 ／ ０ 发酵罐放大培养最佳放罐时间 ２ — ２ｈ 获得的菌体数量 约为 １８亿／ 。 ０ ２ ， ５ ｍＬ
７２基 础 发酵 培养 基 ： ．； 淀粉 ０１％、 ．５ 葡萄 糖 ０５ 尿 ． ％、 素 ０１ 磷 酸 氢二 钾 ０３ 磷 酸 二 氢钾 ０１％、 ． ％、 ．％、 ． ５ 硫
酸 镁 ００ ％ 、 母 膏 ００ ％、 化 铁 ００ ％、 酸 钙 ． ５ 酵 ．２ 氯 ．１ 碳
养 ２ ， ４ｈ测定其 Ｏ 鲫值。（ ） Ｄ ４ 接种量对生长量 的影 响 ：选 取 接 种 量 １ 、 ％ 、％ 、％ 、０ 、５ ， ％ ３ ５ ７ １ ％ １ ％ 在 ３ ℃ ， 始 ｐ ．， 速 ２０ｒａｎ条 件 培 养 ２ ， Ｏ 初 Ｈ ７２ 转 ２ ／ ｉ ｒ ４ｈ
枯草芽孢杆菌的发酵过程优化及产物提取技术探究
枯草芽孢杆菌的发酵过程优化及产物提取技术探究枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然界中的细菌，具有良好的生物学特性和产物应用潜力。
本文将探讨枯草芽孢杆菌的发酵过程优化以及产物提取技术的相关研究。
首先，枯草芽孢杆菌的发酵过程优化是实现高产产物的关键。
发酵过程中的温度、pH值、培养基组分以及氧气供应等因素对产物生成具有重要影响。
在温度方面，研究表明最适合枯草芽孢杆菌生长和产物生成的温度是37°C。
此外，维持适宜的pH值（通常在6-8之间）有助于促进产物的生成。
培养基组分方面，通常采用含有碳源、氮源、矿物盐和生长因子等成分的培养基。
合理设计培养基组分的配比及优化培养条件，可以提高产物的产量和质量。
此外，提供充足的氧气供应也是枯草芽孢杆菌发酵过程的关键环节，通过调节搅拌速度和增加氧气传递效率，可以最大限度地提高产物产量。
其次，产物提取技术是从发酵液中纯化并得到目标产物的重要步骤。
产物提取的目标是高效、高纯度地获得目标产物，并保证较低的成本和良好的产物质量。
常用的产物提取技术包括有机溶剂提取、沉淀法、离子交换法、超滤法等。
有机溶剂提取是最常用的方法之一，通过将发酵产物与合适的溶剂相混合，在适当的温度和压力下进行搅拌和分离，从而得到相对纯度较高的目标产物。
沉淀法是利用添加特定的盐类或聚合物使产物发生沉淀，利用离心或过滤等方式将沉淀物分离出来。
离子交换法则通过将产物溶液通过具有相应固定相的离子交换树脂柱，利用产物与树脂之间的吸附和解吸作用来完成分离和纯化。
超滤法则是利用不同分子量的孔膜实现对产物的分离和提纯。
根据产物的特性和需求，选择合适的提取方法来实现产物的高效提纯是非常重要的。
此外，为了进一步提高产物的产量和质量，还可以通过辅助策略来优化枯草芽孢杆菌的发酵过程以及产物的提取技术。
常用的辅助策略包括基因工程技术、发酵反应动力学研究、传质芯片技术等。
基因工程技术可以通过改造枯草芽孢杆菌的菌株，使其具有更高的产物生产能力。
枯草芽孢杆菌固体发酵条件优化
枯草芽孢杆菌固体发酵条件优化杨婷;廖美德;贺玉广;刘偲嘉【摘要】为研究初始pH、蛋白胨浓度和不同发酵底物对枯草芽孢杆菌生长的影响,对不同发酵底物进行液态和固态发酵试验,结果发现,pH为6.5～7.0时,细菌生长最快,pH为7.5～8.0时,蛋白酶的活性最强;蛋白胨1.6 g·L-1的LB培养基,枯草芽孢杆菌的生长状况最好,蛋白酶的活力也最强;豆粕是优质氮源,能显著促进枯草芽孢杆菌的生长和蛋白酶活性,豆粕20％、豆渣10％、麸皮60％和玉米粉30％作为固态发酵底物,枯草芽孢杆菌的生长速度最快,豆粕10％、豆渣10％、麸皮50％和玉米粉10％为固态发酵底物,枯草芽孢杆菌分泌的蛋白酶活力最强.【期刊名称】《饲料博览》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】4页(P5-8)【关键词】枯草芽孢杆菌;发酵;正交实验【作者】杨婷;廖美德;贺玉广;刘偲嘉【作者单位】华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室,广州510642;华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室,广州 510642;华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室,广州 510642;华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室,广州 510642【正文语种】中文【中图分类】S816.6枯草芽孢杆菌是一类广泛分布于各种不同生活环境中的革兰氏阳性好氧型细菌，常作为益生菌添加在幼小动物日粮中，能够起到改善动物肠道菌群结构、提高消化酶活性、改善机体免疫功能以及提高生产性能的作用，对人畜无毒害作用，不污染环境[1-2]。
枯草芽孢杆菌可产生蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等，对提高动物的饲料转化率、促进营养的消化吸收和预防疾病起到重要作用[3-5]。
目前，在工业化生产中，仍然存在发酵周期长、芽孢形成率低、成本高等问题。
本文在前人的研究基础上，以玉米粉、麸皮、豆粕、豆渣为原料，旨在寻找出一种高效经济的发酵底物，获得较高的枯草芽孢杆菌产量和酸性蛋白酶活力。
枯草芽孢杆菌B47菌株高产抗菌物质的培养基及发酵条件优化
微生物学通报SEP 20, 2011, 38(9): 1339−1346 Microbiology China© 2011 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@*通讯作者：Tel: 86-771-3235674; : qqli5806@ 收稿日期：2011-01-10; 接受日期：2011-04-25研究报告枯草芽孢杆菌B47菌株高产抗菌物质的培养基及发酵条件优化叶云峰1,2黎起秦1*袁高庆1付岗3缪剑华2林纬1(1. 广西大学农学院广西南宁 530005)(2. 广西壮族自治区药用植物园广西南宁 530023)(3. 广西农业科学院微生物研究所广西南宁 530007)摘要: 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis B47菌株为番茄内生细菌, 也是玉米小斑病拮抗菌, 能产生对玉米小斑病菌有强烈抑制作用的抗菌物质。
以B47菌株发酵液的无菌滤液对玉米小斑病菌的抗菌活性为检测指标, 测定B47菌株产抗菌物质培养所需的最佳碳、氮源和无机盐, 并通过正交试验法对该菌株产抗菌物质的培养基配方和摇瓶发酵条件进行优化。
研究结果表明, B47菌株产抗菌物质最佳碳、氮源和无机盐分别为蔗糖、酵母浸膏和MgSO4⋅7H2O, 最优培养基是YSB (Yeast extract-sucrose-beef extract)培养基, 其配方为: 蔗糖2%, 酵母浸膏2%, 牛肉浸膏1.5%, MgSO4⋅7H2O0.06%, FeSO4⋅7H2O 0.000 9%, 最优发酵条件组合为: 30 °C, pH 7.0, 170 r/min摇床培养6 d, 接种量为1%, 装液量为40 mL/200 mL。
关键词:枯草芽孢杆菌, 抗菌物质, 正交试验, 发酵条件优化Optimization of culture medium and fermentation conditions for high production of antimicrobial substance byBacillus subtilis strain B47YE Yun-Feng1,2LI Qi-Qin1* YUAN Gao-Qing1 FU Gang3 MIAO Jian-Hua2LIN Wei1(1. College of Agriculture, Guangxi University, Nanning, Guangxi 530005, China)(2. Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant, Nanning, Guangxi 530023, China)(3. Microbiology Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning, Guangxi 530007, China)Abstract: Bacillus subtilis strain B47 is an endophytic bacterium of tomato and can produce substance to inhibit the growth of Bipolaris maydis which can cause southern corn leaf blight. The optimal nitro-1340微生物学通报2011, Vol.38, No.9/wswxtbcngen source, carbon source and salt for the production of antimicrobial substance by strain B47 were tested. The medium composition and fermentation conditions were optimized by orthogonal experi-ments. The results showed that the optimal nitrogen source, carbon source and salt were yeast extract, sucrose and MgSO 4⋅7H 2O, respectively. The best medium was YSB (Yeast extract-sucrose-beef extract). The composition of the medium was 2% (W/V ) sucrose, 2% (W/V ) yeast extract, 1.5% (W/V ) beef ex-tract, 0.06% (W/V ) MgSO 4⋅7H 2O and 0.000 9% (W/V ) FeSO 4⋅7H 2O. The optimal fermentation condi-tions were the combination of temperature 30 °C, initial pH 7.0, incubation time 6 d, 1% inoculum volume percentage and medium volume 40 mL/200 mL.Keywords: Bacillus subtilis , Antimicrobial substance, Orthogonal experiment, Optimization of fermentation condition由玉米小斑离蠕孢菌Bipolaris maydis 引起的玉米小斑病曾于1968年在我国和1970年在美国大流行, 造成严重的经济损失[1−2]。
枯草芽孢杆菌菌株发酵生产工艺优化
３ 结论 风干燥箱 ，上海产，型号 Ｉ Ｏ １ Ａ 一 ３ ；电热恒温培养箱 ，上海产 ，型号 对于培养基的选择应该遵循原料取材方便 ， 来源广泛 ， 价格低廉的 Ｄ Ｈ Ｐ 一 ９ １ ６ ２ ； 垂直流超净工作 台， 上海产 ， 型号 ２ Ｈ Ｊ Ｈ 一 １ １ １ ２ ； 显微镜 ， 日 原则， 酵母膏、 酵母粉这类药品成本较高， 不适用于工业化生产。 本研究 本产 ， 型号 Ｎ ｉ ｋ ｏ ｎ — Ｙ Ｓ １ ０ ０ ； 手提式高压灭菌锅 ， 哈尔滨市医疗器械厂制 在通用培养基中添加了不同比例的的工农业副产品——豆饼粉和麸子 造； 可控温式摇床， 哈尔滨市东联科学仪器厂制造。 即适量的碳源和氮源 ， 根据发酵过程中枯草芽孢杆菌菌体数量的变 １ ． ４方法 。１ Ａ ． １ 菌种活化。 将保存的枯草芽孢杆菌移接到斜面试管 粉 ， 化 ， 得到最佳培养基配方， 即通用培养基 ＋ １ ． ５ ％豆饼粉 ＋ １ ｍ 麸皮 ， 利用 培养基 中， 在恒温培养箱 ３ ７ ±１ 。 ｃ 培养 ２ ４ ｈ 。１ ． ４ ． ２种子液的制备。 取一 这一配方， 生产 出了成本低廉 、 菌活数达 １ ８ 亿 ／ ｍｌ 以上的枯草芽孢杆菌 环 已活化完成斜 面菌种接人到三角瓶种子培养基 中， ５ ０ ０ ｍＬ三角瓶 达到了促进枯草芽孢杆菌菌株生长的目的， 增加了发酵液中菌体 中，装量为 １ ０ ０ ｍ Ｌ种子培养基 ， ３ ７± １ ｏ Ｃ ， １ ８ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ， 摇床 中震荡培养 菌剂 ， 数 量 和代谢 产物 ， 为 工业 化发 酵生 产 和大 面积 推广应 用 提供 充足 的 、 廉 ２ ４ ｈ 。１ ． ４ ． ３ 菌株发酵培养。取 ｌ ｍ Ｌ培养好的种子液， 以２ ％的接菌量ｆ 即 价 的微 生物 菌体及 发酵 菌液 。 在每 ｌ Ｏ Ｏ ｍｌ 的液体培养基 中接入 ２ ｍ ｌ 浓度为 ｌ ｘ ｌ Ｏ ｇ ｅ ｆ ｕ ／ ｍ ｌ 的发酵液汾 参 考文 献 别接入到 ｌ ５ 个（ 每种培养基 ３ 个） 装有 １ ０ ０ ｍ Ｌ发酵培养基的 ５ ０ ０ ｍＬ １ 阿 红， 蔡 学清， 洪永聪等． 辣椒内生细菌的分 离及拮抗菌的筛选ｌ Ｊ １ ． 中国 三角瓶 中， ３ ７ ±１ ℃， １ ８ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ ， 摇床中振荡培养 。 １ Ａ ． ４ 测定方法。 将各摇 ［
一株枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵条件优化
一株枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵条件优化一、引言枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种常见的芽孢形成细菌，广泛存在于土壤、水体、植物表面等环境中。
枯草芽孢杆菌具有良好的免疫调节、抗菌、促生长等生物学特性，被广泛应用于农业、食品、医药等领域。
针对不同用途的需求，分离鉴定枯草芽孢杆菌并优化其发酵条件，能够提高其生物活性和产量，为其在实际应用中发挥更好的效果。
二、枯草芽孢杆菌的分离鉴定1.样品采集与处理首先，从自然环境、农田土壤或其他植物表面等样品中采集含有枯草芽孢杆菌的样品。
将样品带回实验室后，进行分离和处理，避免混杂其他细菌或真菌。
2.菌株分离将处理后的样品进行稀释，接种于富含培养基中，利用传统分离方法（如平板分离法、稀释平板法等）进行分离。
通过观察不同菌落形态和颜色，筛选出枯草芽孢杆菌单菌株。
3.生理生化鉴定对分离到的枯草芽孢杆菌进行生理生化鉴定，包括形态学观察、生长特性、氧化还原反应、产酶活性等。
利用生化试剂盒进行相关检测，确定菌株的生物学特性。
4.分子鉴定通过16SrRNA序列分析或蛋白质质谱鉴定等分子生物学方法，确认所分离到的枯草芽孢杆菌的属种分类，并与数据库中的已知菌株进行比对验证。
5.枯草芽孢杆菌存取将鉴定完成的枯草芽孢杆菌单菌株保存在甘油保存流质中，存放在-80°C低温冰箱中备用。
1.发酵基质的选择选择适宜的发酵基质对枯草芽孢杆菌的生长和代谢具有重要影响。
常用的基质包括葡萄糖、大豆粉、玉米粉等，可以根据具体需求进行配比调整。
2.发酵菌种培养条件通过扩种培养，将枯草芽孢杆菌预培养至指数生长期，然后接种至发酵罐中，保持较高的菌液浓度，有利于产酶和生长。
3.发酵条件的控制在发酵过程中，通过控制温度、pH值、通气速率、发酵时间等因素，调节菌体生长、产酶效率和产物生成速率。
通常，较适宜的发酵条件为温度37°C-42°C，pH值6.0-8.0，通气速率1.0-2.0L/min。
枯草芽孢杆菌发酵培养基及发酵条件优化
枯草芽孢杆菌发酵培养基及发酵条件优化焉兆萍，宋士良，陆克文(上海邦成生物工程有限公司，上海 201506)中图分类号：TQ920.6 文献标志码：A文章编号：1001-0769(2019)01-0051-05枯草芽孢杆菌是嗜温、好氧、产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，且不污染环境；能产生多种抗菌物质和酶，具有广谱抗菌活性。
该菌已被我国农业农村部列入饲料添加剂目录名单，越来越多地被研制成微生物制剂，其制剂作为“绿色”饲料添加剂，在畜牧养殖业、饲料加工业中得到广泛应用，成为现代养殖业的一种常规添加剂，具有广阔的发展前景[1]。
枯草芽 孢杆菌在动物肠道内具有较强的生物夺氧能力，这对动物的营养物质利用、生长、防病起到重要作用[2]；其还可以通过产生抗体和提高嗜菌作用等，刺激免疫，激发体液免疫与细胞免疫，从而提高动物的生产性能和饲料利用率[3]。
由于枯草芽孢杆菌生长速度快、营养需求简单、易于存活、无致病性，具有良好的发酵基础，国内外已有众多学者对此菌进行了大量研究[4]。
本文通过单因素试验与正交试验，对枯草芽孢杆菌的发酵培养基和发酵条件进行了研究，确定其最佳发酵培养基和最适发酵条件，以最大限度地提高枯草芽孢杆菌的发酵菌数，降低生产成本，满足工业化发酵生产的要求。
1 材料与方法1.1 供试菌种枯草芽孢杆菌，由上海邦成生物工程有限公司菌种保藏室提供。
1.2 培养基LB固体培养基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖5 g、氯化钠10 g、琼脂粉20 g、水1 000 mL，pH 7.2。
LB液体种子培养基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖5 g、氯化钠10 g、水 1 000 mL，pH 7.2。
1.3 种子液的制备将菌种接种于LB固体培养基中，37 ℃恒温培养箱活化18 h后，挑取单菌落接入装有100 mL LB液体种子培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃条件下180 r/min振荡培养24 h。
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枯草芽孢杆菌发酵过程控制及最优碳源筛选=========（+++++农业与生物技术学院++ 111111）摘要：本实验通过福林试剂法检测枯草芽孢杆菌中碱性蛋白酶的活性，旨在筛选出培养枯草芽孢杆菌时的最优碳源和掌握培养枯草芽孢杆菌基本的发酵过程控制，为今后进一步提高枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶提供可靠地参考数据。
关键词：酶活、最优碳源、碱性蛋白酶。
引言：碱性蛋白酶是指在pH值为碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类,其最适pH值一般为9～11,属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类,除可催化蛋白质水解为氨基酸外,在有机溶剂中还可催化多肽的合成[1]。
它在商业中的巨大应用前景及在基础研究中的重要作用,吸引着国际国内的许多公司及研究单位竞相对其进行多方面的研究[2]。
微生物蛋白酶均为胞外酶,与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,同时易于实现工业化生产[3]。
而且碱性蛋白酶比中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力,有较大耐热性且有一定的酯酶活力[4]。
枯草芽孢杆菌是生产碱性蛋白酶的传统菌株,具有产蛋白酶量大,耐高温、高碱等特点,因此对枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究成为蛋白酶研究的热点[5]。
我国研究和生产的碱性蛋白酶的活力水平虽然不断提高,但大多数采用进口的碱性蛋白酶制剂,并且大规模工业生产中用的碱性蛋白酶还是主要依赖进口[6]。
本实验通过碳源优化枯草芽孢杆菌发酵培养基和探究培养枯草芽孢杆菌基本的发酵过程控制,以期进一步提高枯草芽孢杆菌所产碱性蛋白酶粗酶的活力。
1.材料与方法1.1菌株：枯草芽孢杆菌1.2材料与试剂酪氨酸、福林试剂、三氯乙酸、无水碳酸钠、干酪素、氯化钙、酵母浸粉、柠檬酸钠、磷酸氢二钾、蛋白胨1.3仪器与设备恒温水浴锅、分光光度计、高速离心机、摇床、超净工作台、15L 发酵罐、PHS-25型酸度计、振荡培养箱、压力灭菌锅。
1.4 培养基种子培养基(g/L)：胰蛋白栋5g/L、葡萄糖10g/L、酵母浸粉5g/L、K2HPO4 18g/L ,pH 值自然，121℃蒸气灭菌20min；发酵培养基(g/L)：酵母浸粉10 g/L、糊精100 g/L、柠檬酸钠3 g/L、蔗糖20 g/L 、K2HPO4 18g/L 、CaCl2 3 g/L, pH 值自然，115℃与发酵罐一起进行实消，20min。
1.5方法1.5.1 不同碳源对枯草芽孢杆菌的影响1.5.1.1配制培养基（20mL/150mL）准确秤取0.2g酵母浸粉、0.06g柠檬酸钠、0.2g磷酸氢二钾、0.06g 氯化钙5份分别加入0.6g蔗糖、0.6g麦芽糖、0.6g葡萄糖、1.1g乳糖、1.1g糊精，最后取20mL自来水，PH自然，配制成20ML/150mL 的培养基，塞好棉塞，包扎后进行高压真气灭菌（121℃蒸气灭菌20min）1.5.1.2 接种用移液枪吸取0.62mL菌种至培养基上，置摇床35℃，200r/min 恒温培养48h。
将发酵液12000r/min离心10min，上清液即为粗酶液。
1.5.1.3 酶活力的测定1.5.1.3.1标准曲线的制作取12支试管，按表1加入试剂（每支重复一次），混匀，再加入1mL福林试剂摇匀，置40℃水浴20min，于分光光度计680nm处测定样品的A680值。
以不含酪氨酸的0号管作为空白。
表1 标准曲线制备试剂管号酪氨酸浓度酪氨酸使用水/mL0.4moL/L( µg/ML )溶液( µg/ML )NaCO30 0 0.0 1.0 51 10 0.1 0.9 52 20 0.2 0.8 53 30 0.3 0.7 54 40 0.4 0.6 55 50 0.5 0.5 51.5.1.3.2样品酶活测定方法取碱性蛋白酶的菌种发酵液10mL于离心管中，12000r/min离心15min后，分别吸取上清液1mL稀释至10、25、50倍。
取试管7支（一支为空白管，样品重复2次），各加入稀释好的样品1mL，40℃水浴预热3min,再加入同样预热过的1%酪蛋白液1mL,精确反应10min,加0.4moL/L三氯乙酸2mL终止反应混匀，水浴沉淀15min后过滤，吸滤液1ML,加入0.4moL/L Na2CO3 5mL混匀，再加入1mL福林试剂摇匀，置40℃水浴20min。
空白测定同上，但在加酪蛋白之前先加0.4moL/L三氯乙酸2mL。
以空白对照，用分光光度计680nm波长下测样品的A680，选出最优碳源。
1.5.2 对枯草芽孢杆菌发酵过程控制的探究1.5.2.1按实验材料中种子培养基的组分制备好种子培养基，控温到接菌温度时，进行接菌。
接菌后置于摇床上培养24h，备用。
1.5.2.2按实验材料中发酵培养基的组分制备好发酵培养基，进行电极（PH电极、溶氧电极）标定。
将制备好的发酵液由进料口加料，然后在115℃下实消20min。
1.5.2.3降温到接菌温度接菌，控制变温恒溶氧条件进行发酵。
1.5.2.4 发酵过程控制前基本参数记录，发酵过程直接参数记录，发酵离线参数记录。
1.5.2.5根据记录数据进行发酵全过程分析，得出结论。
2.结果与分析2.1 图1为碱性蛋白酶活力测定标准曲线，由R2=0.9996可知该标准曲线置信度高，能用它的方程y=0.0092x-0.0015求吸光常数K。
图中的y即为吸光度，当y=1时，由酶活计算公式X= A680×K×4×N/10得x=108.86µg/mL。
2.2 表1 为枯草芽孢杆菌生长在5种碳源下的A680值，由酶活计算公式X= A680×K×4×N/10得乳糖为最优碳源，蔗糖次之。
表1 5种碳源下的A680值碳源稀释50倍时的A680值稀释50倍时的A680值麦芽糖0.379 0.250糊精0.355 0.259乳糖0.466 0.268葡萄糖0.374 0.256蔗糖0.390 0.2622.3.1图2枯草芽孢杆菌发酵过程部分参数图（因为接种后12h，才开始对发酵数据进行记录并整理分析，所以该图只反映发酵过程的部分）。
2.3.2发酵罐从接种开始发酵，前14h无数据记录，为了作图方便将第14h，在图1横坐标标为00：01，特此说明。
2.3.3发酵过程控制的是最优碳源次之的蔗糖在变温恒溶氧条件下，进行的枯草芽孢杆菌发酵碱性蛋白酶的探究。
2.3.4图2中的OD600可以反映发酵过程菌体的生长情况，酶活可以反映菌体的生产情况。
本实验将溶氧和转速偶联在一起，所以转速的高低也就反映了菌体呼吸强度的大小。
实验中的所有参数分析如下：2.3.4.1 OD600反映菌浓。
当第一次（也即开始发酵第14h）记录数据时，OD600达到0.983。
第二次记录数据时OD600突然减小到0.273，缘于发酵开始第12h，加入消泡剂（植物油）过量，大多菌因为猛然的供氧不足造成大批菌体死亡。
随着基质中蔗糖的浓度降低经历了4h后部分菌开始利用消泡剂作为碳源，致使第三次OD600又显著上升至0.988。
之后，OD600又逐渐下降，但并非消泡剂被耗光。
若消泡剂耗光菌体发酵产生的酶蛋白必然使得发酵罐中泡沫上升，但在后续试验中并未观察到这一现象。
说明氮源或者其他营养成分短缺，成为了菌体生长的限制因子。
2.3.4.2酶活反映菌的生产能力。
酶属于初级代谢产物，主要产生于对数期。
由于受消泡剂影响，歪打正着，为我组实验创造了新的对数期（图1中的02：06~04：03），此时，随着OD600上升，酶活也在上升，再次验证了酶属于初级代谢产物，主产于对数期。
之后随着培养条件恶化，酶开始失活。
再后来，酶又开始上升的原因是部分菌发生变异，开始利用产物酶作为氮源（也即证实了大批量菌死亡的缘故是培养基中可利用氮源酵母浸粉的匮乏），菌体浓度OD600和酶活又开始缓慢上升。
2.3.4.3转速反映菌体代谢强度。
对数生长期是进行物质大量合成的时期，枯草芽孢杆菌为需氧型菌，需要氧化反应提供ATP的合成，发酵后期的呼吸强度应有所降低，但后期菌体量大，所以耗氧量也大。
2.3.4.4本实验DO%与转速偶联，再不必分析。
从记录数据时温度恒定，也不比分析。
2.3.4.5本实验中的PH由表2发酵过程各项参数可知，总体来看从5.56~7.39，说明碱性蛋白酶对培养基PH有较为显著的提高，今后做实验要慎重考虑。
表2 发酵过程各项参数时间温度℃转速r/min OD600×10-3 DO% PH 稀释倍数酶活U/ML 00:01 32 257 0.983 28.6 5.56 25 319.8502:06 31.9 603 0.273 27.6 6.25 25 499.2304:03 32 751 0.988 24.4 6.67 25 847.2506:00 31.8 583 0.853 28.3 7.03 25 377.2808:00 31.9 551 0.228 27.4 7.66 25 422.1910:01 31.9 509 0.087 28.8 7.54 25 396.1311:58 31.9 487 0.114 29 6.97 25 391.5613:48 31.9 451 0.247 30.5 6.98 25 444.0622:00 31.9 325 0.136 33.7 6.43 25 531.1223:59 31.9 366 0.212 34.1 7.39 25 651.883.结论3.1采用枯草芽孢杆菌为发酵菌株，用枯草芽孢杆菌生长在5种碳源下的A680值，由酶活计算公式X= A680×K×4×N/10得乳糖为最优碳源，蔗糖次之。
3.2 确定了最佳培养基配方和最适发酵条件，最后得到最佳培养基为酵母浸粉10 g/L、糊精100 g/L、柠檬酸钠3 g/L、蔗糖20 g/L 、K2HPO4 18g/L 、CaCl2 3 g/L, pH 值自然，最佳培养条件为变温恒溶氧发酵36h，碱性蛋白酶酶活力可达847.25U/mL。