沙门菌属和志贺菌属检验
沙门菌检验技术和方法
沙门菌的增菌液
四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)：含有胆盐，抑 制革兰氏阳性球菌和部分大肠埃希氏菌的生 长，而伤寒与付伤寒沙门菌仍能生长。
亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）：可对伤寒及 其他沙门菌作选择性增菌，亚硒酸与蛋白胨 中的含硫氨基酸结合，形成亚硒酸和硫的复 合物，影响细菌硫代谢，从而抑制大肠埃希 氏菌、肠球菌和变形杆菌的增殖。
➢ 现修改为：在接种TSI琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培 养基的同时增加一项营养琼脂（NA），经TSI琼 脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的选择后，可筛掉 大部分非沙门氏菌株，大大减少了工作量，同时 也满足了API 20E或 Vitek GNI鉴定的需要。
➢ 为保持与原标准的一致性，新标准也保留 了可以同时直接接种蛋白胨水 (供做靛基质 试验)、尿素琼脂 (pH7.2)、KCN 培养基的 内容。本部分还增加了对疑似菌落进行留 样确认的部分，以备必要时复查，这对生 化鉴定不确定的菌落进行进一步验证是非 常必要的。
沙门菌的菌落形态：产H2S的菌落为黑色 有金属光泽、棕褐色或灰色。菌落周围培 养基可呈黑色或棕色，有些不产H2S的菌 落，形成灰绿的菌落，周围培养基不变。
注：此培养基在制作过程中过分加热可使培 养基的选择性降低，与TTB或SC合用可获 得更高的检出率。
沙门菌的分离培养基
HE琼脂：在保证细菌所需营养的基础上，加 入了一些抑制剂，如：胆盐、柠檬酸盐、去 氧胆酸钠等，可抑制某些肠道致病菌和革兰 氏阳性菌的生长，但对革兰氏阴性的肠道致 病菌则无抑制作用。
样品液增加调整pH值。 选择性增菌：使用“TTB、SC”，取消“MM”。
分离培养基：使用BS、XLD、HE、科 玛嘉显色培养基。取消DHL、SS。
生化鉴定： 1.采纳API 20E或Vitek GNI为传统生化鉴定方法 的选择性替代方法。 2.生化鉴定项目进行调整：
肠道门诊大便三线培养简述
⑴ G-杆状或球杆菌，无芽胞，多有鞭毛，能运动，致病性菌株多数有菌毛，多 数具有F、R、COL等质粒，需氧或兼性厌氧，在普通和MAC培养基上生长 良好，在液体培养基内均匀混浊生长；
⑵ 发酵葡萄糖，产酸或产酸产气，氧化酶阴性，触酶阳性，硝酸盐还原试验阳 性；多年来乳糖发酵试验是区分致病性和非致病性肠杆菌科细菌的重要依据；
⑶ 表面抗原：是包绕在O抗原外侧的不耐热的多糖抗原，由黏液或荚膜多糖的 结构决定表面抗原的特异性，在不同的菌属中表面抗原有不同的专有名称， 如大肠埃希菌属的K抗原、沙门菌属的Vi抗原、志贺菌属的B抗原等；
变异性：主要有S-R变异、H-O变异
*沙门菌*
定义：是一群寄居于人类和动物肠道中，生化反应与抗原结构相关的革兰氏
卫生健康体检中大便三线培养：
与上面相比，检测范围比较小，属于预防性体检，一般主要针对： ⑴霍乱弧菌；⑵沙门菌；⑶志贺菌；⑷大肠埃希氏菌（o157血清型）
*肠杆菌科*
是一大群寄居在人和动物肠道中的生物学性状相似的G-无芽胞的短小杆菌， 其中4类常引起腹泻和肠道感染（埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、耶尔森菌 属）；8类常导致院内感染的条件致病菌（枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆 菌属、多源菌属、沙雷菌属、变形杆菌属、普罗威登菌属、摩根菌属）
*志贺菌性痢疾的革兰氏阴性短小
杆菌。可分为4个群，痢疾志贺氏（A群），福氏志贺氏（B群），鲍氏志贺 氏（C群），宋内氏志贺氏（D群），我国以B群最多见，占70%以上，其次 为D群和A群。
形态和培养特性：
1、G-短小杆菌，无鞭毛，有菌毛，一般无荚膜，均无芽胞，胞质内有两种 质粒，与侵袭力和耐药性相关。
凡患有痢疾、伤寒、病毒性肝炎等消化道传染病（包括病 原携带者）是不得参加接触直接入口食品的工作，或者治 愈前不得直接从事公共场所的服务工作。
沙门菌属和志贺菌属检验
结果判断、解释和报告：
①分离培养未发现可疑菌落或经鉴定不符合沙门菌属细菌鉴定依据者，可报告“未分离出沙门菌”。
②生化反应符合沙门菌、玻片凝集试验结果阳性，可初步报告为：“分离到××沙门菌”，或“×群沙门菌”。
表2-4志贺菌属和沙门菌属的基本生化反应
KIA
MIU
氧化酶
触酶
硝酸盐还原
斜面
底层
产气
H2S
动力
吲哚
脲酶
志贺菌
K
A
-/+
-
-
+/-
-
-
+
+
伤寒沙门菌
K
A
-
+/-
+
-
-
-
+
+
乙型副伤寒菌
K
A
+
+
+
-
-
-
+
+
最终鉴定：须做全面生化反应和血清学试验。
4．血清学试验
(1)志贺菌属的分型鉴定：凡生化反应符合志贺菌属者均需做血清学鉴定。取1环志贺菌四种多价血清于载玻片一端，再取少许待测菌与之混合，同时在玻片另一端取待测菌与生理盐水混合对照。结果：对照呈均匀混浊，待检菌与志贺菌四种多价血清混合后，数分钟内出现肉眼可见的颗粒状凝集物即为阳性。继之用A、B、C、D群最常见的单价血清凝集定种。
5．肥达试验
(1)原理：用已知的伤寒沙门菌O、H抗原，甲、乙型副伤寒沙门菌的H抗原(PA、PB)与肠热症患者血清做定量试管凝集试验，以出现“2+”凝集的最高血清稀释度为效价，测定相应抗体含量，用以辅助诊断肠热症。
肠杆菌科细菌的培养与鉴定
－
＋＋
－
－
普通变形杆菌 K/A ＋ ＋ ＋ F ＋ ＋ － －/+ ＋
＋
＋－
－
－
奇异变形杆菌 K/A ＋ ＋ ＋ F － ＋ +/－ +/－ ＋
＋
＋－
＋
－
志贺菌
K/A － － － F －/＋ ＋ － － ＋
－
－－
－
－
沙门菌
K/A ＋ ＋ ＋ F － ＋ － ＋ ＋
－
－＋
＋ +/－
注：A：产酸；K：产碱；+：90%以上菌株阳性；-：90%以上菌株阴性；+/-： （50-90）%菌株阳性；-/+：（50-90）%菌株阴性；沙门菌与志贺菌除鉴定到种以 外，还应进行和特异性血清凝集实验鉴定血清型。
大肠埃希菌生化鉴定反应结果
肺炎克雷伯菌(K. Peumoniae)
革兰染色为阴性杆菌，大小为(0.3-1.5) μm×(0.66)μm。单个、成双或短链状排列。可见透明环状荚膜。
革兰阴性杆菌荚膜
肺炎克雷伯菌(K. Peumoniae)
在血琼脂平板上培养18-24h，形成较大、粘、圆形、凸 起、灰白不溶血的大菌落。
沙雷菌属(Serratia)
血平板上形成光滑、湿润、圆形、中心呈颗粒状的菌落。 大多不透明，可呈现白色、粉色、红色菌落。
血平板上黏质沙雷 菌落形态
巧克力平板上黏质 沙雷菌落形态
总
结
肠杆菌科细菌生化鉴定反应选择：氧化酶、触酶、克氏双 糖铁、半固体、甲基红、V-P、枸橼酸盐、苯丙氨酸脱氨 酶、硝酸盐、尿素、赖氨酸脱羧酶(LYS)、鸟氨酸脱氨酶 (ORN)、精氨酸脱氨酶(ARG)。
肠杆菌科的鉴定
肠杆菌科的鉴定1、标本要求：1.1 尽量用药前采集标本。
1.2 痰液：病人清晨咳痰于无菌、防漏小塑料盒内，切勿唾液送检。
1.3 尿液：病人留取12h尿液，送检。
1.4 粪便：病人留取粪便5 10g，送检。
1.5 脑脊液及其它无菌体液：用无菌瓶直接送检。
血标本不要冷冻。
1.6 不可接受的标本：干的拭子、蜡盒、未消毒容器、留取24h后的尿或痰、破裂的瓶子、标本泄漏、标本无标签。
2、仪器35℃孵箱、普通光学显微镜3、试剂羊血平皿、麦康凯平皿、硝酸盐培养管、葡萄糖蛋白胨水、葡萄糖酸盐培养管、苯丙氨酸脱氨培养管、氨基酸脱羧培养管、拘橼酸盐培养管、尿素培养管、糖醇发酵管、湖南长沙天地人肠杆菌鉴定板。
4、试验方法及原理：4.1 硝酸盐还原试验：方法：将待检菌接种硝酸盐培养基中，孵育过夜，加入等量A、B液1～3滴，观察结果。
结果：红色为“+”，即还原硝酸盐。
注意点：（1）．培养基不应含亚硝酸盐，以避免假阳性。
（2）．某些肠杆菌还原硝酸盐的能力很强，还原硝酸盐为亚硝酸盐后，进一步将亚硝酸盐分解为氨、氮、氧化氮，造成假阴性。
所以，观察结果时，如无红色出现，应加少量锌粉，仍无色，说明亚硝酸盐进一步分解，硝酸盐反应为阳性。
若加锌粉后出现红色，说明锌使硝酸盐还原为亚硝酸盐，而待检菌无还原硝酸盐的能力，即硝酸盐还原试验阴性。
4.2 甲基红试验方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，孵育过夜，加甲基红试剂1～2滴，观察结果。
结果：红色为阳性，桔黄色为阴性。
4.3 尿素培养基方法：将待检菌穿刺接种于尿素培养基中，孵育过夜，观察结果。
结果：培养基变红为尿素阳性，不变色为阴性。
4.4 拘橼酸盐试验(Simmons法)方法：将待检菌接种于拘橼酸盐培养基中，孵育过夜，观察结果。
结果：有细菌生长培养基变蓝色为阳性，无颜色改变为阴性。
4.5 氨基酸脱羧试验方法：取待检菌接种于氨基酸脱羧培养基和对照管中，封石腊油，35℃培养过夜，观察结果。
结果：培养基变紫色为阳性，黄色为阴性。
最新整理沙门菌属和志贺菌属检验教学文案
以呈现2+凝集现象的血清最高稀释倍数作为该血清的凝集效价。
一般认为，伤寒沙门菌O抗体凝集价在1：80以上，H抗体在1：160以上，甲、乙、丙型副伤寒沙门菌凝集价在1：80以上才有诊断意义。
注意事项
1．加入诊断菌液时，由对照管开始往前，每管各加O．5ml。
2. 结果观察时不要振荡试管，先观察，必要时再轻摇试管使凝块从管底升起，最后按液体的清浊，凝块的大小进行记录，对照管(不凝集)与试验管同时对着光线往暗处看液体透明度和凝集块。
3.“H”凝集呈絮状，以疏松之大团铺于管底，轻摇试管即能荡起，而且极易散开。
4．“O”凝集呈颗粒状，以坚实凝片沉于管底，轻摇试管不易荡起，且不易散开。
沙门菌检验
科玛嘉 显色培 养基
菌落为紫红色
接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养 基的同时，可直接接种蛋白胨水 (供做靛基 质试验)、尿素琼脂 (pH7.2)、氰化钾 (KCN) 培养基，也可在初步判断结果后从营养琼 脂平板上挑取可疑菌落接种。于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h, 必要时可延长至48 h。
分别用接种环取增菌液1环, 划线接种于一 个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE 琼脂平板或显色培养基平板）。于36 ℃±1 ℃分别培养18 h～24 h (XLD琼脂平板、HE 琼脂平板、显色培养基平板) 或40 h～48 h (BS琼脂平板)，观察各个平板上生长的菌落。
沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的 菌落特征
甲型副伤寒沙门氏菌(要求血清 学鉴定结果) 沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ(要求符合本群 生化特性) 沙门氏菌个别变体(要求血清学 鉴定结果)
反应序号2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门菌靛基质阳性变体两项结 果均为阳性；
反应序号3：补做ONPG，ONPG阴性，同时赖氨酸脱羧酶阳性为沙门菌； 但甲型副伤寒沙门菌赖氨酸脱羧酶为阴性。
沙门菌检验
沙门菌概况
沙门菌是1885年由Salmon氏等在猪霍乱流行 时，分离出的猪霍乱沙门菌，由于Salmon氏 对本属细菌的发现贡献卓越，故定名为沙门 菌属。
沙门菌属是肠杆菌科中最重要的病原菌。它 是一群抗原结构、生化特性相似的革兰氏阴 性杆菌。血清型繁多，目前已发现的沙氏菌 有2500多个血清型和变种。我国自1911年至 90年代初已有255个血清型。
沙门菌的分离培养基
亚硫酸铋琼脂（BS）：含有煌绿、亚硫酸铋 能抑制大肠杆菌、变形杆菌和革兰氏阳性菌的 生长，但对伤寒、副伤寒等沙门菌的生长无影 响。伤寒杆菌及其他沙门菌能利用葡萄糖将亚 硫酸铋还原成硫酸铋，形成黑色菌落周围绕有 黑色和棕色的环，对光观察可见有金属光泽。 该培养基制备过程不宜过分加热，以免降低其 选择性，应在临用时配制，超过48h不宜使用。
沙门菌属检验
文件页码：1/21．概述沙门菌属是一类分布广泛、血清型较多、抗原复杂的肠道病原菌，分为6个亚属、2200种以上的血清型。
伤寒沙门菌属亚属I，多价O抗血清D群，是临床上最为重要的沙门菌。
2. 标本类型粪便、血液等标本。
3. 鉴定3.1 形态与染色革兰阴性杆菌，菌体细长。
有周鞭毛。
3.2 培养特性在麦康凯琼脂平板上35℃培养18～24小时，形成无色、透明的菌落。
SS 琼脂平板上呈无色、透明菌落，但大部分菌落中央呈黑色（产H2S）。
3.3 生化反应氧化酶试验阴性，发酵葡萄糖，不发酵乳糖，三糖铁琼脂（TSI）为K/A，动力、赖氨酸脱羧酶和硝酸盐还原试验阳性，大多数菌株H2S试验阳性，IMViC-+--或-+-+。
3.4 鉴别要点3.4.1 本菌属特征选择SS平板上无色透明、半透明或中心黑色的菌落，TSI为K/A，H2S阳性或阴性，动力试验阳性，，IMViC-+--或-+-+，氧化酶、脲酶试验阴性。
符合上述特征者，可通过血清凝集试验作出诊断。
3.4.2 与志贺菌属的鉴别少数伤寒沙门菌在TSI上H2S阴性，动力不明显，易与志贺菌属相混淆，可用血清凝集试验相鉴别。
3.5 操作步骤3.5.1 观察菌落特征，挑取可疑菌落，做TSI试验。
参见《三糖铁试验标准操作规程》。
3.5.2 血清学鉴定参见《沙门菌血清学检测标准操作规程》。
3.5.3 鉴定从SS琼脂平板上挑取纯菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。
4. 药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》。
5. 质量控制参见《质量管理程序》。
6. 检验结果解释与分析沙门菌属的鉴定应依赖于传统或商品化系统生化反应和血清学两种方法。
若生化反应符合沙门菌，但A-F多价血清不凝集，首先考虑是否存在表面抗原（Vi抗原），因为Vi抗原能阻断O抗原与相应抗体发生凝集，加热可将其破坏。
应将细菌制成菌悬液，放入沸水中加热15-30分钟，冷却后再次做凝集试验。
若去除Vi抗原后仍不凝集，此时应考虑是否为A-F以外菌群，应送专业实验室进行鉴定。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
沙门菌属和志贺菌属检验
步骤和方法
1 .形态观察
(1)革兰染色：沙门菌属细菌为革兰阴性细长杆菌。
志贺菌属细菌为革兰阴性杆菌，散在分布。
(2)观察鞭毛染色标本片：镜下可见沙门菌属细菌具有周鞭毛。
志贺菌属细菌无鞭毛。
2•菌落观察
(1)沙门菌属：将本菌接种在SS MAC平板上经35 'C孵育18〜24h。
由于本菌不分解乳糖并产碱，故在SS和MAC 平板上形成无色、半透明、光滑湿润、凸起的小菌落，产生H2S的菌落可在SS平板上形成中心带黑褐色的小菌落。
(2)志贺菌属：将本菌接种在SS和MAC平板上经35C孵育18〜24h。
由于志贺菌不分解乳糖，宋内志贺菌某些菌株可迟缓发酵乳糖，故其在SS平板和MAC平板上形成无色透明的、中等大小的菌落。
除宋内志贺菌菌落外均为光滑型菌落。
3.生化反应氧化酶试验：方法同大肠埃希菌。
沙门菌属和志贺菌属细菌氧化酶试验均为阴性。
初步试验鉴定：挑取志贺菌和沙门菌的单个菌落分别接种在KIA、MIU和硝酸盐培养基上，经35C孵育18〜24h，同时做触酶试验。
其结果见表2—4。
最终鉴定：须做全面生化反应和血清学试验。
4 .血清学试验
(1)志贺菌属的分型鉴定：凡生化反应符合志贺菌属者均需做血清学鉴定。
取1环志贺菌四种多价血清于载玻片
一端，再取少许待测菌与之混合，同时在玻片另一端取待测菌与生理盐水混合对照。
结果：对照呈均匀混浊，待检菌
与志贺菌四种多价血清混合后，数分钟内出现肉眼可见的颗粒状凝集物即为阳性。
继之用 A B、C D群最常见的单价
血清凝集定种。
结果判断、解释和报告：
①分离培养未见可疑菌落或经鉴定不符合志贺菌属鉴定依据者可报告“未分离到志贺菌属细菌”。
②经分离鉴定后符合鉴定依据者，可报告“分离岀XX志贺菌”，若进一步做多种生化反应及因子血清分型后，可报告：“分离岀XX志贺菌X型”。
(2)沙门菌属的分型鉴定：如果生化反应及形态学检查疑为沙门菌，可选用沙门菌的多价诊断血清进行玻片凝集。
首先选用A〜F组多价“ O诊断血清做玻片凝集试验。
在试验时应以生理盐水作对照。
血清凝集试验在5〜10min内不
岀现凝集者可确定为阴性。
但若生化反应比较典型，应考虑选用Vi凝集试验。
若凝集，则用无菌生理盐水将菌洗下，
制成浓厚的悬液，加热100 C、30min，再与A〜F组多价“ O诊断血清做凝集试验。
若与A〜F组多价“ O血清发生凝集，应再与沙门菌单价因子血清分别做玻片凝集试验，以确定该菌株属于哪一组。
一般先选用本地区检岀率最高菌型的相应血清做玻片凝集反应。
若已确定哪一沙门菌种后，再分别先用H因子血清检查第I相抗原，然后检查第H相抗原，最后确定该菌种属
于哪一型沙门菌。
结果判断、解释和报告：
①分离培养未发现可疑菌落或经鉴定不符合沙门菌属细菌鉴定依据者，可报告“未分离岀沙门菌”。
②生化反应符合沙门菌、玻片凝集试验结果阳性，可初步报告为：“分离到XX沙门菌”，或“X群沙门菌”。
5 •肥达试验
（1）原理：用已知的伤寒沙门菌O H抗原，甲、乙型副伤寒沙门菌的H抗原（PA、PB）与肠热症患者血清做定量
试管凝集试验，以岀现“ 2+”凝集的最高血清稀释度为效价，测定相应抗体含量，用以辅助诊断肠热症。
（2）试验方法：为单管稀释法。
准备4排小试管，每排7支并标记，另取中号试管1支，加生理盐水3. 8ml及
被检血清O. 2ml，混匀，即为1 : 20稀释，总量为4ml。
然后取出2ml按每管分别放人各排小试管中的第1支试管中。
再于上述中号试管内加生理盐水2ml混匀，此种血清即为1 : 40稀释，吸取此稀释度血清2ml，按每管分别加到各排
小试管中的第2支试管中。
以此类推连续稀释到各排小试管第6支试管为止，第7支小试管只加入生理盐水做阴性对
照。
然后按表2-5操作。
振荡片刻，置于C水浴箱中或C水浴箱，取出置室温或放冰箱中过夜，次日观察并记录结果。
（3）结果判断解释和报告：先观察对照管，正确结果应无凝集反应，再分别与对照管比较观察各试管凝集情况。
根据液体透明度和凝集块多少，以4+、3+、2+、+、-符号记录。
4+:上清液完全澄清，细菌凝集块全部沉于管底。
3+:上清液澄清度达75%，大部分细菌凝集成块沉于管底。
2+:上清液澄清度达50%，约50%细菌凝集成块沉于管底。
+ ：上清液体混浊，管底仅有少部分细菌凝集成块，上清液澄清度仅有25 %。
-:液体均匀｝昆浊，无凝集块。
以呈现2+凝集现象的血清最高稀释倍数作为该血清的凝集效价。
一般认为，伤寒沙门菌0抗体凝集价在1: 80
以上，H抗体在1 : 160以上，甲、乙、丙型副伤寒沙门菌凝集价在1: 80以上才有诊断意义。
注意事项
1 •加入诊断菌液时，由对照管开始往前，每管各加O. 5ml。
2.结果观察时不要振荡试管，先观察，必要时再轻摇试管使凝块从管底升起，最后按液体的清浊，凝块的大小进
行记录，对照管（不凝集）与试验管同时对着光线往暗处看液体透明度和凝集块。
3.“H'凝集呈絮状，以疏松之大团铺于管底，轻摇试管即能荡起，而且极易散开。
4 .“O'凝集呈颗粒状，以坚实凝片沉于管底，轻摇试管不易荡起，且不易散开。