亚细胞器分离纯化技术的发展
生物大分子分离与纯化技术

生物大分子分离与纯化技术是生物学、生物医学和生物工程领域中非常重要的技术之一。
它可以用于提取和分离生物大分子,从而达到纯化的目的。
本文将着重探讨的原理、方法和应用。
一、原理在生物细胞中,不同的生物大分子有着不同的形态、结构和性质。
为了分离和纯化这些生物大分子,需要利用它们的理化性质差异。
例如,蛋白质可以通过电泳分离,根据电荷、分子量等差异分离出不同的成分;核酸则可以通过浓度梯度离心分离,根据密度差异分离出单独的成分。
还有一些生物大分子,如多肽、糖类、脂质等,可以通过其他特殊方法分离。
二、方法1. 柱层析法柱层析法是中常用的重要方法之一。
它利用固定相(柱子中的树脂)和流动相(洗脱缓冲液)之间的相互作用来分离和纯化生物大分子。
根据固定相和洗脱缓冲液的不同性质,可以选择不同的柱层析方法,例如离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。
2. 电泳法电泳法是基于生物大分子的电荷差异和分子量差异的原理,将不同的生物大分子分离并捕获的技术。
根据电泳介质、运行方式以及电场的不同条件,可以选择不同的电泳方法,如蛋白质电泳、DNA电泳、脂质电泳等。
3. 超滤法超滤法是利用微孔过滤膜的不同截留分子量,将生物大分子按照大小分离纯化的技术。
超滤法分为正压式和负压式,正压式是通过液体压力将生物大分子向膜孔内压缩,从而分离得到小分子;负压式是通过负压将大分子向膜孔内吸附,难以通过的是大分子。
4. 溶剂萃取法溶剂萃取法是将生物大分子从混合物中溶解到特定的有机溶剂中,然后通过反萃取、扩散等工艺,使它在不同相中转移、分离和纯化的方法。
5. 其他方法生物大分子的分离和纯化方法还有一些其他方法,例如磁性珠法、浓缩法、冷冻干燥法等。
三、应用在生物医学、生物工程、食品工业、环境保护和新能源开发等领域中有广泛的应用。
具体来说,1. 生物医学领域生物医学领域的应用主要是分离和纯化蛋白质和多肽类物质,如酶、抗体、激素、血浆蛋白等。
这些物质可以作为药物、诊断试剂、生物治疗的原材料等。
密度梯度离心法的原理解析

密度梯度离心法的原理解析密度梯度离心法是一种广泛应用于生物化学、分子生物学和医学领域的实验技术,用于分离和纯化生物大分子、细胞和次细胞结构。
该方法基于样品中不同组分的密度差异,利用离心力和密度梯度分离的原理来实现。
密度梯度离心法的原理可以简单概括为以下几个步骤:1. 密度梯度制备:制备一个由多个密度层构成的梯度液体。
这些密度层是根据密度逐渐增加或减少排列的,通常由离心管或离心管中的夹层形成。
常用的密度梯度制备物质包括蔗糖、葡萄糖或碘化物等。
2. 样品处理:将待分离的样品加入到密度梯度中。
样品可以是生物大分子如蛋白质、核酸或多肽,也可以是细胞或次细胞结构如细胞核或线粒体等。
3. 离心分离:通过高速离心设备,施加离心力将密度梯度中的样品分离。
离心过程中,样品中的各个组分受到的离心力不同,根据其密度的差异在密度梯度中上下移动。
离心力越大,移动距离越远。
4. 提取和分析:离心分离后,不同密度层中的组分被提取出来,然后进一步进行分析。
这可以是采用分光光度法、蛋白质电泳、质谱分析或核酸杂交等技术。
通过分析不同密度层中的组分,可以获取样品中各种生物大分子或细胞结构的纯度和数量信息。
密度梯度离心法的优点是可以实现高分辨率和高效率的分离和纯化。
这是因为,不同密度的组分在离心力的作用下可以根据其密度差异均匀地分布在梯度液体中,从而实现准确分离。
该方法对样品体积和细胞大小没有特别严格的要求,适用于分离和研究多种不同类型的生物样品。
密度梯度离心法还可以用于研究细胞功能和结构的多个方面。
它可以用于分离不同亚细胞器如线粒体、内质网和高尔基体等,进一步研究它们的功能和组成。
该方法还可用于分离和纯化蛋白质复合物、染色体和病毒等,为进一步研究它们的生理和生化特性提供有力的工具。
总结和回顾上述内容,密度梯度离心法是一种基于样品中不同组分密度差异的分离和纯化技术。
它可以通过制备密度梯度、施加离心力和分析不同密度层中的组分来实现。
该方法具有高分辨率、高效率和广泛适用性的优点,可用于研究多种生物样品的分离和纯化,以及细胞和亚细胞结构的功能和组成研究。
生物制药分离纯化技术

学习情景一
子情景一 子情景二 子情景三
发酵液的预处理
降低发酵液的黏度 凝聚沉降分离悬浮物 絮凝法沉降分离悬浮物
四、实施准备
1.知识和技能准备 (1)PH的调节
发酵液的酸度对降低发酵液黏度有影响,可调节发酵液PH
值,当产生絮凝物时即可。
(2)薄力飞黏度计的使用方法 以说明书为准 2.器材和原料准备 精密PH计、黏度计、蒸汽发 生器、冷热缸、青霉素发酵液
五、实施项目
1.设备清洗 2.设备组合及管道安装
3.向冷热缸输送发酵液
பைடு நூலகம் 三、计划决策
1.采用方法: 明矾凝聚法 2.产品指标: 澄清液浊度 3.制定工作流程: (1)检查黏度和固形物含量;
(2)计算明矾用量;
(3)加入明矾澄清30分钟; (4)测定发酵液浊度,达到规定指标后即停止; (5)打扫场地。
(6)小组评估,经验总结,书写报告。
四、实施准备
1.知识和技能准备
比浊法又称浊度测定法。为测量透过悬浮质点介质的光强度
他们与传统使用的无机絮凝剂相比,具有用量少,沉降速度快,澄清效
果好,成本低等特点。 ②天然高分子絮凝剂
有多糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、甲壳素、脱乙酰甲壳素、
微生物絮凝剂等。其中甲壳素类具有广泛的应用前景。
三、计划决策
1.采用方法: 壳聚糖须凝澄清法 2.产品指标: 澄清液浊度 3.制定工作流程: (1)检查黏度和固形物含量;
2.器材和原料准备 精密PH计、黏度计、可见紫外分光光度计、沉淀罐、青霉素 发酵液。
第一篇组成人体的细胞第三章 亚细胞结构的分离与鉴定

第一篇组成人体的细胞第三章亚细胞结构的分离与鉴定细胞由各种亚细胞结构组成。
其重要的研究手段之一是分离纯化亚细胞组分,观察它们的结构或进行生化分析。
离心技术是实现这一目标的基本手段。
一般认为,转速为10~25Kr/min的离心机称为高速离心机;转速超过25Kr/min,离心力大于89Kg者称为超速离心机。
目前超速离心机的最高转速可达100Kr/min,离心力超过500Kg。
第一节亚细胞结构分离的技术分离亚细胞组分的第一步是制备组织匀浆或细胞匀浆。
匀浆(Homogenization)是在低温条件下,将组织或细胞放在匀浆器中加入等渗匀浆介质(即0.25moL/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙溶液)研磨,使细胞被机械地研碎成为各种亚细胞组分和包含物的混合物。
分离亚细胞组分的第一步是分级分离。
它通过由低速到高速离心技术,使非均一混合体中的颗粒按其大小轻重分批沉降到离心管的不同部位,再分部收集,即可得到各种亚细胞组分。
由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时是均匀分布于整个离心管中,故每级分离得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒,须经反复悬浮和离心加以纯化。
分离亚细胞组分主要离心技术是差速离心和密度梯度离心。
差速离心(differential centrifugation)是在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心,用于分离不同大小的细胞和细胞器。
在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为:细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体、最后为核糖体。
由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠,一般重复2~3次效果会好一些。
通过差速离心可将细胞器初步分离,但常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。
密度梯度离心(density gradient centrifugation)是用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部,通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。
这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降两种。
细胞器分离

差速离心法逐级分离出各个细胞器
低速离心
中速离心
高速离心
超速离心
大颗粒 中颗粒 小颗粒
不同大小的生物颗粒可以利用不同的离心机分离:普 通离心机(8000r/min)可分离直径大于1µm的生物颗 粒;高速离心机(8000-25000r/min)可分离直径为 0.1-10µm的生物颗粒;超速离心机(25000-80000 r/min)可分离直径为3.2-100nm的生物颗粒和生物大 分子。为了限制和保持细胞亚组分内酶的生物活性, 有的离心机还装有低温控制装置(0-4℃)。
离心场的离心力常用重力加速度g(9.8 m/s2)的倍 数来表示,而实际操作时人们习惯用r/min(离心机转
子每分钟旋转的圆周数)来掌握。两者关系如下:
离心力g=1.11×10-5n2r
注:r为离心机中轴到离心机远端的距离,n为离心机 每分钟的转速(r/min)
『实验内容和方法』
1、低速分离细胞核
(1) 将小鼠杀死,取出肝脏,剪成数小块,用预冷的生理 盐水反复洗涤除去血污,用滤纸吸干表面的水分。
(2)称取肝组织1g,取8ml预冷的匀浆介质,先加入少量于 小烧杯中,尽量剪碎肝组织,再将剩余的预冷匀浆介质加 入其中。
(3)匀浆,用3-4层纱布(先用少量匀浆介质润湿)过滤匀 浆介质至离心管中(可先过滤至皿中),离心管内匀浆液为 6-8ml。
(4)普通离心机里以2500r/min的速度离心15分钟,缓缓吸 取上清液,移入eppendorf管中,放在有冰块的器皿中,等 分离线粒体时用(直接进入第二大步)。同时制一张上清 液涂片A,做好记号,自然干燥。
(5)用8ml离心介质悬浮沉淀物,用吸管混匀,以2500r/min 的速度离心15分钟,吸弃上清液,沉淀物加入0.5ml离心介 质,用吸管充分吹打成悬液,制备1张涂片B,做好标记, 自然干燥。
叶绿体的分离、纯化和鉴定.pdf

(2)细胞破碎时,不必过细。用普通的家用食品 料理机匀浆2 min同样可以达到很好的效果。此 外,过滤时不要用力挤压,以避免对叶绿体被膜 的破碎。在用细胞器分离缓冲液悬浮叶绿体粗提 物时应轻缓,在冰上轻轻晃动使叶绿体分散开来。
心机配平), 轻轻吸取上清液。 5. 在2.0ml离心管内依次加入50%蔗糖溶液0.9ml和15%蔗糖溶液 0.5ml(注意15%蔗糖溶液要缓缓沿离心管壁注入,不能搅动 50%蔗糖液面)。 6. 小心地沿离心管壁加入0.4ml上清液。 7. 离心8000r/min, 20 min。 8. 取出离心管,可见叶绿体在密度梯度 液中间形成带。
冲液 ph=7.4) 50%蔗糖溶液,15%蔗糖溶液,0.01%吖啶橙
Байду номын сангаас
实验步骤
1.选取菠菜叶片(选择嫩绿色的新鲜叶片),洗净擦干后去除 叶梗和粗脉,撕成小碎块(剪碎更宜碾磨),称2~3g放于玻 璃匀浆器中
2.加入预冷(放在冰上预冷)到0℃匀浆介质10ml,在冰上用研 钵研磨。
3.捣碎液用尼龙网过滤于50ml烧杯中。 4.将滤液平分到2个离心管中(2ml),1000r/min下离心1min(离
(4)加样时一定要小心,防止破坏梯度。为此,应采用宽口 吸头吸取叶绿体粗提物悬浮液,释放时,将枪头贴于管壁 接近15%蔗糖浓度处缓慢释放。
(5)离心时,为防止速度快速上升和快速下降对浓度梯度层 的破坏,离心机的加速一定要缓慢,而下降时也要缓慢停 下。此外,为防止高速离心过程中温度上升可能造成的由 于颗粒扩散而引起的梯度破坏,离心前一定要让离心机在 0℃或更低的温度下充分预冷【1】。
9.用吸管对准叶绿体那一层吸取一滴叶绿体悬液滴于载片上, 加盖片观察: 1)在普通光镜下观察;
生物大分子的分离纯化和鉴定

利用溶解度差异 进行分离纯化
利用电荷性质进 行分离纯化
利用生物活性进 行分离纯化
分离纯化的过程
分离纯化的目的:去除杂质, 获得高纯度的生物大分子
分离纯化的方法:沉淀法、色 谱法、电泳法等
分离纯化的原理:利用生物大 分子在物理性质、化学性质等 方面的差异进行分离
分离纯化的流程:样品制备、 粗分离、精制纯化、产物检测
高效液相色谱法:随着技术的不断改进, 液相色谱法的分离效果和鉴定准确性得到 显著提高。
毛细管电泳技术:具有高效、快速、高分 辨率的特点,成为生物大分子分离纯化的 重要手段。
质谱技术:随着蛋白质组学研究的深入, 质谱技术在生物大分子鉴定中发挥着越来 越重要的作用。
生物信息学方法:通过计算机技术对生 物大分子数据进行处理和分析,为生物 大分子的分离纯化和鉴定提供了有力支 持。
03
生物大分子的鉴定
鉴定方法
化学分析法:通 过化学反应对生 物大分子的组成 和结构进行分析。
免疫分析法:利 用抗体与抗原的 特异性结合,对 生物大分子进行 检测和识别。
生物活性测定法: 通过检测生物大 分子对细胞或生 物体的活性影响, 确定其结构和功 能。
分子生物学方法: 利用分子杂交、 PCR等技术对生 物大分子进行基 因水平和蛋白质 水平的鉴定。
随着新材料的出现和应用,将会有更多高效、低成本的分离纯化材料应用 于实际操作中。
人工智能和机器学习等先进技术的应用,将有助于提高生物大分子分离纯 化和鉴定的自动化程度和智能化水平。
生物大分子分离纯化和鉴定技术将与生物信息学、系统生物学等学科交叉 融合,形成更加全面和深入的研究和应用领域。
05
生物大分子分离纯化和鉴定的应用领域
酶工程:通过分离 纯化技术获取酶, 用于酶催化反应研 究和酶制剂的生产 。
生物产品分离纯化的一般工艺流程及发展前景

⽣物产品分离纯化的⼀般⼯艺流程及发展前景⽣物产品分离纯化的⼀般⼯艺流程1.⽣物材料的来源及选择⽣物产品的种类繁多,如氨基酸及其衍⽣物、蛋⽩质、酶、核酸、多糖、脂类等。
各种⽣物物质主要来源于它们⼴泛存在的⽣物资源中,包括天然的⽣物体及其器官、组织以及利⽤现代⽣物技术改造的⽣物体等,归纳起来主要有以下⼏种:①植物器官及组织植物器官及组织中含有很多活性成分,我国药⽤植物种类繁多,从天然植物材料中寻找和提取有效⽣物药物已逐渐引起⽖视,品种逐年增加。
此外,转基因植物可产⽣⼤览的以传统⽅式难以获得的⽣物物质。
②动物器官及组织以动物器官和组织为原料可制备多种⽣物制品,从海洋⽣物的器官和组织中获取⽣物活性物质是⽬前研究的热点和重要的发展趋势。
③⾎液、分泌物及其他代谢物⼈和动物的⾎液、尿液、乳汁,以及胆汁、蛇毒等其他分泌物与代谢产物也是⽣物物质的正要来源。
④微⽣物及其代谢产物微⽣物种类繁多,其代谢产物有1300多种,应⽤前景⼴泛。
以微⽣物为资源,除了可⽣产初级代谢产物如奴荃酸、维⽣索外,还可⽣产许多次级代谢产物如抗⽣素等。
⑤动植物细胞培养产物细胞培养技术的发展使得从动物细胞、植物细胞中获得有较⾼应⽤价值的⽣物物质成为可能,且发展迅速,前景⼴阔。
选择⽣物材料主要根据实验的⽬的⽽定。
从⼯业⽣产⾓度来考虑,⾸先是材料来源丰富、含量⾼、成本低。
有时材料来源丰富但含最不⾼,或者材料来源、含量都很理想,但材料中杂质太多,分离纯化⼿续⼗分烦琐,以致影响质量和收率,反不如含量低些但易于操作获得纯品者。
因此,必须根据共体情况,抓住主要⽭后⽽决定取舍.如果为了科学实验和某种特殊需要,例如从某种材料或某⼀⽣物品种中寻找某种未知物质,选材时则⽆需全⾯考虑上述问题,只要能达到实验⽬的即可。
2.分离纯化的⼀般⼯艺流程由于⼯业⽣物技术产品众多,原料⼴泛,性质多样,⽤途各异,且对产品质量与纯度的要求也可以是多⽅⾯的,因⽽其分离纯化技术、⽣产⼯艺及相关装备也是多种多样的。
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重线粒体, 质膜大片 $’’’ , $’ 核, 质膜片 &’’’ , $’ 重线粒体, 1’’’ , $’ $’’’’ , $’ %’’’’ , $’ $’’’’’ , $’ 线粒体, 溶酶体, 过氧化物酶体, 完整高 尔基体 线粒体, 溶酶体, 过氧化物酶体, 高尔基 体膜 溶酶体, 过氧化物酶体, 高尔基体膜, 大 颗粒 (如粗面内质网) 来自内质网的囊泡, 质膜, 高尔基体, 内 涵体等
3= ( 5,(. 6,6+7)(, 87)9:;<(. ) 、 线 粒 体3> 、 过氧化物酶 31 3? @ 42 体 、 囊泡 等。
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一般分离流程
免疫磁珠 $’()*+,)- / 0 122 ( 以 -’()* 公司专门 为分离纯化细胞器或亚细胞结构而设计的 / 0 122 为例) 是一种大小均一、 具有超顺磁性、 表面光滑的 聚苯乙烯珠子32 。其表面被 A 0 甲苯 0 磺酰氯活化 可提供活性基团以共价结合抗体或其他配体。在大 部分的亚细胞器分离中, 最好先将一种连接型二抗 与磁珠结合。这有利于特异性一抗的正确定位。尽 管有多种类型的二抗可供选择, 但最好使用 B, 结合 的抗体, 例如抗小鼠 *CD 的单克隆或多克隆抗体。二抗 必须经过亲和纯化, 不包含任何稳定剂 (例如蔗糖) 和 可与珠子相结合的蛋白。一抗若是多克隆, 必须经过 亲和纯化以确保珠子表面结合的特异性抗体的密度。 对于免疫分离技术来说, 特异性抗体的选择非常关键。 抗体必须能够特异识别并且能够到达位于靶细胞器上 的抗原表位。如果抗原表位被包埋在细胞器的内部, 则与磁珠相结合的抗体可能就很难达到。因而免疫分 离具有直接和间接两种方法 (见图 3) 。 若抗原表位位于靶细胞器的表面, 通常采用直 接法, 即将特异性抗体直接与磁珠或包被有二抗的 磁珠相结合, 然后再加入待分离的细胞粗提物进行 亲和纯化。直接法的分离速度和效率相对来说较 好。但若抗原表位被包埋在内部, 则更适于使用间 接法。即特异性抗体先与待纯化的细胞粗提物混 合, 然后再加入包被有二抗的磁珠, 将抗体E靶细胞 器复合物进行免疫分离。在间接法中有一点很重 要, 即抗体与靶细胞器结合后, 要通过密度梯度离心 =
! 亲和纯化"免疫磁珠纯化分离法
! "# 技术背景 在生物体内, 许多大分子具有与某些相对应的 专一分子可逆结合的特性。例如抗原和抗体、 酶和 底物及辅酶、 激素和受体、 !"# 和其互补的 $"# 等 (两个进行专一结合的分子互称对方为配基) 。生物 分子之间这种特异的结合能力称为亲和力, 亲和纯 化就是利用这种配基之间的亲和吸附和解吸附原 理, 最终实现细胞器的分离。许多高分子材料, 例如 琼脂糖凝胶等, 以及与这些高分子骨架相结合的磁 性纳米材料 (磁性微球) 可作为亲和纯化的固相介 质。 随着越来越多的亚细胞器的标志性蛋白的发 现, 亲和纯化技术逐渐得到更为广泛的应用。免疫
表! 细胞器 细胞核 质膜大片 线粒体 溶酶体 过氧化物酶体 高尔基体 差速离心沉淀 ’9 ’9 5 匀浆液 ’9 ’6 ’6 ? ’< ? ’/ 匀浆液 ’/ ? ’; ’/ ? ’; ’/ ? ’; ’/ ? ’; ’/ ? ’; 光滑 5 粗面 内质网 核膜 线粒体外膜 ’3 ’9 ’6
二〇〇五年 ・ 第二期
是可以一次性对大量的细胞或组织粗提液进行分离 纯化, 并将其富集浓缩成较小的体积以适应后续的 分析研究。 但由于离心分离法仅仅依靠各细胞器的大小, 密度或沉降系数等物理特性来达到分离纯化的目 的, 因而具有一定的局限性。具体表现在, 第一, 无 法将具有相似密度、 大小的不同细胞器分离开来。 例如微粒体和过氧化物酶体等 。因而通过密度梯
! &!
现代仪器
组分 “颗粒” 在梯度液中沉降速率的差别, 而在离心 的某一时刻形成了数个含有单一组分颗粒的区带。 样品在离心后与梯度液一起收集, 用常规技术去除 梯度后就得到某个较纯的成分。每个单一组分的沉 降速率取决于它们的形状、 尺寸、 密度、 离心力的大 小、 梯度液的密度和粘性系数。与速率 ! 区带离心 法不同的是, 等密度离心是依赖于样品颗粒的不同 密度来进行离心分离的。混合样品可以铺在梯度液 之上, 也可以置于梯度液之下, 甚至和梯度液混在一 起。在离心过程中由于样品各单一成分向各自的等 密度区靠拢即达到了分离纯化的目的。 现在有多种介质可用作密度梯度材料, 例如蔗 糖, "#$%&&, ’()$%&& *+$%,(-. 等。对于大多数密度梯度 离心, 蔗糖是比较合适的梯度材料。尽管它在高密
%
磁珠作为亲和纯化固相介质具有其独特的优点。它 具有超顺磁性, 可通过抗体与靶细胞器特异性结合 并使之具有磁响应性。将免疫磁珠与待分离的混合 物共同孵育, 免疫磁珠就可通过抗原抗体反应选择 性地与靶细胞器物质结合, 当此复合物通过一个磁 场装置时, 与免疫磁珠结合的靶细胞器就会被磁场 滞留, 从而与其他复杂物质分离开来 。
贺 (北京师范大学 摘 要 芳 何大澄 北京 !""#$%) 本文就亚细胞器分离纯化的传统方式— — —密度梯度离心, 以及新方法— — —亲和 高等学校蛋白质组学研究院
纯化, 特别是免疫磁珠纯化技术进行概述和评价, 并进一步表明两种提取方法相结合, 更 有利于同时满足产量、 纯度两方面的要求。 关键词 亚细胞器分离纯化技术 密度梯度离心 亲和纯化 免疫磁珠
度 (/01 2 301 4 5 4) 时粘性系数较大, 但综合比较 表明它可以广泛使用。不过由于蔗糖在各种密度时 有较高的渗透性, 分离一些对渗透性敏感的生物组 分时需要选择其他梯度材料。 至于密度梯度的制备, 有自形成和预形成两种 方式。对于自形成梯度, 可以将被分离的样品和梯 度材料混合在一起离心, 梯度材料在离心过程中形 成密度梯度, 而样品中不同组分则沉降 (或上浮) 到 它们自己的等密度区。这种方式有较大的样品容 积。预形成梯度可以是连续的, 也可以是不连续的。 这种方法的优点是离心时间较短, 但相对自形成梯 度来说, 被分离样品的容积较小。根据以往文献报 道, 分离纯化各种亚细胞器推荐使用的密度梯度介 质 以及离心条件 (见表 6) 。
3
度离心得到的某些亚细胞器可能只具有中等纯度, 可能只适合进行某些功能方面的研究, 若要进行进 万方数据 6
二〇〇五年 ・ 第二期
综述与专论
附很快地与磁性微球结合, 如果微球表面有活性基 团, 则接下来就会通过较慢的化学反应共价结合在 磁性微球的表面。 用于细胞分离的免疫磁性微球应具备以下条 件: 化学性能稳定, 不产生凝聚; 不与细胞发生非特 异性的结合; 磁性微球与抗体的结合牢固; 磁性微球 的大小均匀, 磁响应性好, 磁性纳米材料的含量均匀 一致; 磁性微球大小适当, 对于较小的细胞器的我们 宜选择较大的磁珠, 以确保两者之间的相互作用更 为牢固。目前免疫磁珠产品中, $’()* 公司的一系列 磁珠 (例如 $’()+,)-. / 0 122 等, 具有的不同活性表 面) 可以用于亚细胞器分离32 。 迄今为止, 利用免疫磁珠进行亚细胞器的纯化 的方法已经被许多研究者广泛采用, 这些被纯化的 亚细胞器包括高尔基体33 、 肾小珠34 、 晶状体膜片断
二〇〇五年 ・ 第二期
综述与专论
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亚细胞器分离纯化技术的发展
引言
亚细胞结构分离纯化技术是细胞生物学研究中 的重要方法。它常常是研究某一细胞器超微结构, 生 化组成以及特定功能的前提和基础。在体外功能研 究中, 分离纯化得到的亚细胞器是否还具有生物学活 性是实验的关键。只有获得有活性的亚细胞结构才 能成功构建无细胞体系, 从而在体外对一些复杂的生 物学过程进行模拟研究。现在已成功构建一些无细 胞体系, 用于研究包括 !"# 复制和转录, 蛋白转运, 纺垂体组装, 蛋白合成等复杂的生物机制$。在生化 分析中, 只有分离纯化得到一定数量的, 并且纯度较 高的亚细胞器才能保证后续的研究。尤其在蛋白质 组学的研究中, 建立相应的亚细胞器蛋白质组数据库 就要确保用于电泳或色谱分离的亚细胞器具有相当 的纯度。现在随着一些亚细胞器分离技术的成熟和 发展, 已有一些亚细胞器的蛋白质组学研究的较为深 入, 例如线粒体蛋白质组学等%, 也有一些亚细胞器的 蛋白质组学获得突破性进展, 例如中心体蛋白质组学 等&。密度梯度离心是传统的亚细胞器分离纯化的方 式, 随着现代工业的进步, 离心机技术取得长足的发 展, 各种生物体组分的离心分离方法得到迅速推广和 应用。通过密度梯度离心可以一次性分离大量样品, 但由于仅依据细胞器的物理特性, 所以分离出来的样 品的纯度有限。另一类亚细胞器分离纯化方法是亲 和纯化, 尤其是近年来发展的免疫磁珠纯化分离方 法, 通过抗原抗体的特异反应, 可以分离得到纯度非 常高的亚细胞器, 但亲和纯化一次性所能分离的样品 量较少。因此将两种提取方法有机结合, 将可能同时 满足产量、 纯度等方面的要求。
是最常用的实验手段。根据亚细胞器的大小、 密度、 形状、 沉降系数等物理特性, 通过一系列的差分离心 结合各种形式的密度梯度离心可以分离和纯化各种 亚细胞器。最近 %’ 年来离心机的性能都有很大提 高, 相关硬件, 例如设备驱动器、 转头、 电子、 电器控 制、 制冷系统、 整机配置及附件等方面都有长足进步。 %’ 世纪 (’ 年代以来计算机开始被用于离心过程的模 拟, 以及通过离心技术的数学分析来探知各种生物样 品的沉降过程)。离心方法, 包括差分离心法、 速度 * 区带密度梯度离心法、 等密度离心法以及分析离心的 沉降速度法、 沉降平衡法 * 包括纹影光学系统、 干涉 光学系统, 吸收扫描光学系统等日臻完善。 ! &’ 一般分离过程 在选用合理的方法对细胞或组织进行破碎后, 首先要进行差速离心 , 即根据不同离心速度所产生 的不同离心力, 将各种亚细胞组分和各种颗粒分离 开来。各细胞器典型的差速离心顺序 (见表 $) 。经