脂肪干细胞
脂肪干细胞制备
脂肪干细胞制备
1、准备手术器械，进行严格消毒处理。
2、在手术过程中，医生将通过局部麻醉药对抽脂部位进行麻醉。
3、使用注射器将肿胀液（含有局麻药和生理盐水的混合物）注射
到脂肪层中。
4、使用吸引器将脂肪组织吸取出来，并将其收集在一个容器中。
5、对收集到的脂肪组织进行过滤和清洗，以去除其中的血液、肿
胀液和杂质。
6、将处理后的脂肪组织中的单个细胞分离出来，并将其培养在特
定的培养基中。
7、在培养基中添加一些生长因子和营养物质，以促进脂肪干细胞
的增殖和分化。
8、培养过程中需要进行多次换液和清洗，以确保细胞的健康生长。
9、在培养过程中，脂肪干细胞将逐渐增殖并分化成不同类型的细
胞，如成纤维细胞、内皮细胞和神经细胞等。
10、最后，将培养好的脂肪干细胞进行冷冻保存，以备后续使用。
脂肪干细胞运用
ADSCs的分离与纯化关于ADSCs的获取方法很多，但不管哪种方法所得到的并非单一的脂肪干细胞，是一组具有干细胞特性的细胞群。
目前应用最广泛的分离方法是酶胶原消化法。
首先将无菌条件下切取的脂肪组织块剪成细小的颗粒，PBS液冲洗干净后，用0．1％的胶原酶在37℃下振荡消化4O～90 min，再用含10％胎牛血清的等体积DMEM培养基终止。
1 200 r／min离心5～10 min，弃上清液及悬浮的脂肪组织，重悬细胞后经过细胞筛过滤，所得细胞按2—4×105／cm 接种于50ml培养瓶内。
37℃条件5％的CO 饱和湿度培养箱内培养，2 d后首次换液，以后3d换液一次，至细胞达70％～8O％融合时用0．25％胰酶消化，并传代。
经过提取获得的以脂肪干细胞为主的细胞群接种后数小时即开始贴壁生长，24h内完成贴壁。
细胞的形状与成纤维细胞相似，体积较小，核浆比较大，随后细胞体积渐增大，克隆形成。
经传代后，细胞的形态及排列才趋于一致。
由于目前尚未发现脂肪干细胞表面存在特异性的分子标记物，因此无法利用分子表型来分离纯化。
然而可通过纯化脂肪组织块来间接达到纯化脂肪干细胞的目的。
流式细胞仪检测显示：传至第3代时，可达95％以上的细胞纯度。
ADSCs的生物学特性1.ADSCs的鉴定在ADSCs鉴定上，现阶段尚无特异性鉴定方法。
用免疫荧光法和流式细胞术检测结果均显示ADSCs表达特异性分子CD44，OCT一4，E—eadherin，流式细胞术检测细胞周期显示绝大多数细胞是处于静止期的干细胞，传代后生长迅速，随机挑选来源标本，对细胞进行染色体核型分析显示ADSCs具有遗传稳定性。
ADSCs分泌多种生长因子在生理功能方面，脂肪干细胞能分泌相当数量的细胞因子，包括肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PGF)、转化生长因子一B(TGF—B)、成纤维细胞生长因子(FGF一2)等，低表达的因子有Ang一2 C。
脂肪干细胞的提取及鉴定
一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后A C Ss的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除AS Cs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。
取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DM EM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
镜下计数，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsi n,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（C D29/CD44）的鉴定。
2、实验用品：2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。
脂肪干细胞
脂肪 Zuk, 2001, 2002；Sen, 2001；Von Heimburg D, 2001
神经 Safford, 2004；Ashjian, 2003；Rchman, 2004；杨立业, 2003, 2004
多向分化潜能
脂肪间充质干细胞向不同细胞分化是在特异性 诱导因子作用下进行的。
下面介绍常用的一些多向诱导分化因子及诱导 后的细胞特性。
脂肪间充质干细胞
Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells
汇报提纲
一. 研究背景 二. 脂肪干细胞优点及表面标记 三. 多向分化潜能 四. 猪脂肪干细胞分离培养、诱导分化及其建系 五. 应用前景及待解决的问题
一、研究背景
动物体内，脂肪组织不仅是重要的能量贮存库和 赋形组织，还是保持内环境稳定及具有分泌激素和细 胞因子的重要部位。脂肪细胞增殖与分化失常是导致 肥胖及Ⅱ型糖尿病的重要因素。因此，脂肪细胞分化 的研究一直是国内外医学及生物学领域的研究热点之 一。
脂肪间充质 干细胞优点
最后，从经济和社会效益看，从脂肪组织中获 取干细胞可将原本认为是废弃物的脂肪，如临床上 脂肪抽吸术后的脂肪组织及动物屠宰后不可实用的 内脏脂肪等变为干细胞库的重要来源，具有极大的 经济与社会效益。
表面标记
关于脂肪间充质干细胞标志，目前尚无统一标 准。一般认为，脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干 细胞均表达CD44、CD105、STRO-1、CD166及 CD117。其中CD117是一种干细胞因子受体，在全 能或多能干细胞中表达，包括胚胎干细胞。
成肌诱导后的形态学观察
A
B
C
D
成肌诱导
成肌诱导第7天出现细胞球形变化(A)，诱导第14天开始出现接 触、融合。部分出现伪足，形态变长(B)，诱导第21天周围梭形细 胞明显减少，形成巨大的球形细胞(C,D)。上图为茜素红染色。
脂肪干细胞实验报告
一、实验背景随着生物科技的发展，干细胞研究已成为医学领域的前沿课题。
脂肪干细胞（Adipose-derived Stem Cells，ASCs）作为一种易于获取、增殖能力强、多能性的干细胞，在组织工程、再生医学等领域具有广阔的应用前景。
本研究旨在探讨脂肪干细胞的分离、培养、鉴定及其在组织工程中的应用。
二、实验目的1. 探讨脂肪干细胞的分离、培养及鉴定方法。
2. 研究脂肪干细胞在组织工程中的应用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：脂肪组织、DMEM/F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、青霉素、链霉素、抗生素、鼠抗人CD105抗体、鼠抗人CD34抗体、鼠抗人CD29抗体、鼠抗人CD44抗体、鼠抗人CD45抗体等。
2. 实验仪器：超净工作台、倒置显微镜、细胞培养箱、离心机、酶标仪、流式细胞仪等。
四、实验方法1. 脂肪干细胞的分离与培养（1）将脂肪组织剪成1mm×1mm×1mm的小块，用DMEM/F12培养基清洗3次，去除多余脂肪。
（2）加入0.25%胰蛋白酶消化脂肪组织，37℃水浴消化30分钟，1000r/min离心5分钟，弃上清。
（3）加入DMEM/F12培养基重悬细胞，吹打均匀，接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
2. 脂肪干细胞的鉴定（1）采用免疫荧光染色法检测脂肪干细胞表面标志物CD105、CD34、CD29、CD44、CD45的表达。
（2）采用流式细胞术检测脂肪干细胞表面标志物CD105、CD34、CD29、CD44、CD45的表达。
3. 脂肪干细胞在组织工程中的应用（1）将脂肪干细胞接种于生物降解支架材料上，构建组织工程化脂肪组织。
（2）将组织工程化脂肪组织植入小鼠皮下，观察其成活情况。
五、实验结果1. 脂肪干细胞的分离与培养成功分离出脂肪干细胞，细胞呈梭形，生长旺盛。
2. 脂肪干细胞的鉴定免疫荧光染色和流式细胞术结果显示，脂肪干细胞表达CD105、CD34、CD29、CD44，不表达CD45。
脂肪干细胞的提取及鉴定
脂肪干细胞的提取及鉴定一、脂肪干细胞(ASCs)的提取及鉴定1、实验技术及原理:运用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化)，差异离心术(可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)。
取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化(37?，30分钟)以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心(1200g,10分钟)，去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
?镜下计数，按10个细胞/ml种植在培养瓶中，37?5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(CD29/CD44)的鉴定。
2、实验用品:2.1 材料:C57BL,6 WT小鼠2.2 试剂:PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DME M2.3 仪器设备:超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子(尖头、平头和有沟镊)、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤:3.1无菌操作的要领和要求。
3.2细胞原代培养:3.2.1操作步骤a(培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材:取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
脂肪干细胞的提取及鉴定
一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。
取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L 氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
镜下计数，孵箱培养，24小时后第一次换液，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定。
2、实验用品：2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。
3.2细胞原代培养：3.2.1操作步骤a．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
脂肪干细胞的临床应用
09级生科一班 青美芳 孙倩
脂肪干细胞定向分化及临床应用
• 概述 • 脂肪干细胞的定义
• 脂肪干细胞的分离、培养与鉴定
• 脂肪干细胞成脂及成骨分化的影响因素 • 同时影响成脂和成骨分化的因素 • 脂肪干细胞的临床应用
概述
随着城市化进程加速，肥胖在我国尤其是大城市
发病率增长迅速。肥胖是由于长期的能量摄入超 过能量消耗引起的脂肪组织过剩的疾病。在成人 阶段脂肪细胞数量保持恒定是一种细胞死亡与补 充更新的动态平衡过程。然而相关研究提示，成
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2.分化诱导因子
• • 表皮生长因子 成纤维因子
•
3.其他（拉伸应变 、 透明质酸 、
氧浓度、钙离子）
同时影响成脂和成骨分化的因素
干细胞巢（ stem cell niche）
干细胞巢即干细胞周围的微环境构成，一般包括干细胞的 相邻细胞、粘附分子及基质等。干细巢为干细胞提供了一 个隐蔽的场所，直到有分化号的刺激它才脱离静止的状态。 因此干细胞巢在维持干细胞的静止和抑制分化方面发挥着 重要作用。
将分离的脂肪组织在磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline PBS）中充分清洗，以去除毛发 和油滴等；然后将脂肪组织用眼科剪剪碎，加入 胶原酶在37℃水浴摇床消化30min, 用含有 10%FBS的 DMEM/F-12培养基终止消化，细胞 筛过滤后，800rpm/min 预离心，上清液2400 rpm/min离心得到的沉淀即为SVF，其中含有 ADSCs，用含有10%FBS的 DMEM/F-12培养基 重悬细胞沉淀，将单细胞悬液种植到培养瓶或培 养板中，37℃，5% CO2孵箱孵育。
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・专科小词典・
脂肪干细胞
脂肪干细胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＡＤＳＣｓ）是一种从脂肪组织中分离提取出的能够贴壁生长、具有可塑性、黏附性和多向分化潜能的中胚层来源的成体干细胞。
２００１年，Ｚｕｋ等通过脂肪抽吸术，在吸出的人体脂肪悬液中第一次分离得到了多向分化的干细胞。
传代后培养的ＡＤＳＣｓ，多角细胞逐渐减少，传代至第三代时基本消失，大多为梭形细胞，胞浆核仁十分丰富，与骨髓间充质细胞基本没有区别，多次传代后细胞生长速度也无减慢趋势，显示出ＡＤＳＣｓ具有易获得、易扩增、不易衰老的明显优势。
ＡＤＳＣｓ表面的免疫标识会随传代的次数而发生改变，其中ＣＤ１６６、ＣＤ１０６、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ６３、ＣＤ４４、Ｃ２９在最初表达量较低，随传代次数的增加而显著增加；与干细胞相关的表面标志ＣＤ３４一直持续较高的表达水平。
ＡＤＳＣｓ一般不表达ＣＤ６２、ＣＤ５６等。
ＡＤＳＣｓ可以分化为源于中胚层的多种细胞类型，包括骨骼肌、心肌、软骨、脂肪、成骨等，向心肌细胞分化能力是最低的。
此外还可以分化为源于外胚层的神经细胞和源于内胚层的胰腺细胞。
ＡＤＳＣｓ还可能有助于血管和造血细胞的生成。
由于脂肪组织在人体大量存在，取材容易，少量组织即可获取大量干细胞，能够在体外稳定增殖且衰亡率低，适宜大规模培养，对被采集者身体健康影响小，加上真空负压抽脂术已是成熟的整形技术。
因此ＡＤＳＣｓ显示出了其他干细胞所不能及的应用前景。
（广州医科大学附属第一医院骨科严广斌整理）・８５３・中华关节外科杂志（电子版）２０１６年６月第１０卷第３期 ＣｈｉｎＪＪｏｉｎｔＳｕｒｇ（ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＥｄｉｔｉｏｎ），Ｊｕｎｅ２０１６，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．３。