超声和高压处理对牛血清白蛋白结构的影响
超高压处理对乳制品中蛋白质和酶的影响研究进展
超高压处理对乳制品中蛋白质和酶的影响研究进展程凯丽，胡志和*，赵旭飞，贾凌云，肖厚栋，丁新宇（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134）摘 要：超高压（high hydrostatic pressure ，HHP ）处理被认为是最可持续和绿色的技术之一。
HHP 处理能够延长食品货架期，改变牛乳中蛋白质和酶的物理化学性质，提高食品的功能特性、营养特性及感官品质。
本文对HHP 处理引发的牛乳中蛋白质和酶结构及功能的变化进行综述，为HHP 处理在乳制品加工中的应用提供参考。
关键词：乳制品；超高压处理；蛋白质变性；酶活性A Review of the Effect of High Hydrostatic Pressure on Proteins and Enzymes in Dairy ProductsCHENG Kaili, HU Zhihe*, ZHAO Xufei, JIA Lingyun, XIAO Houdong, DING Xinyu(Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)Abstract: High hydrostatic pressure (HHP) is considered one of the most sustainable and green technologies. HHP can prolong the shelf life of food, change the physical and chemical properties of milk proteins and enzymes, and improve the functions, nutritional characteristics and sensory quality of food. In this paper, the structural and functional changes of proteins and enzymes in milk caused by HHP treatment are reviewed, which provides a rationale for the application of high hydrostatic pressure in dairy products.Keywords: dairy products; high hydrostatic pressure treatment; protein denaturation; enzyme activities DOI:10.15922/ki.jdst.2019.06.007中图分类号：TS252.1 文献标志码：A 文章编号：1671-5187（2019）06-0034-07引文格式：程凯丽, 胡志和, 赵旭飞, 等. 超高压处理对乳制品中蛋白质和酶的影响研究进展[J]. 乳业科学与技术, 2019, 42(6): 34-40. DOI:10.15922/ki.jdst.2019.06.007. CHENG Kaili, HU Zhihe, ZHAO Xufei, et al. A review of the effect of high hydrostatic pressure on proteins and enzymes in dairy products[J]. Journal of Dairy Science and Technology, 2019, 42(6): 34-40. DOI:10.15922/ki.jdst.2019.06.007. 收稿日期：2019-09-26基金项目：天津市科技计划项目（17ZXYENC00130）；天津市高等学校创新团队项目（TD13-5087）第一作者简介：程凯丽（1994—）（ORCID: 0000-0002-1260-5192），女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。
应用FTIR研究超声对牛血清白蛋白二级结构的影响
活跃 ，如化学催化 、 生化分离、生物医学、污水降解等方 面。 Ｗａｇ等用 ＵＶ和 Ｃ ｎ Ｄ研究 了在 ８ Ｈｚ ５ 超 声条 件下 ０ｋ 和 Ｏｗ
催 化 剂 Ｔｉ２对 牛 血 清 白 蛋 白 （ Ｓ 结 构 的影 响 ， 现 旷螺 （ ） Ｂ Ａ） 发 旋 结 构 随 着 超声 时 问 的增 加 而 减 少 并 且 呈 线 性 程 度 增 加 ；
结 构 的破 坏 ［ 。
解谱工作极其繁琐［ ；圆二色谱 （ Ｄ） 局限 于极 稀浓度 范 ３ ｃ 则
围 内澄 清 溶液 的测定 ，且 只能 较 为 准 确 地 反 映 ａ螺 旋 成 分 较 一
本 课 题 组 曾 多 次将 超 声 用 于 蛋 白质 酶解 前 的 预处 理 ，发 现 紫 菜 、 糠 、大米 等 蛋 白 经 超 声 预 处 理 后 ，酶 解 可 获得 更 米
应 用 Ｆ Ｉ 研 究超 声 对 牛 血 清 白蛋 白二 级 结 构 的影 响 ＴＲ
刘 斌 ，马海乐 ，李树君 。 ，赵伟睿 ，李 林
２ ２ １ １ ０３ ２ ２ １ １０３
１ 苏 大 学 食 品 与生 物 工程 学 院 ， 苏 镇 江 ．江 江 ３ ．中 国农 业机 械 化 科 学研 究 院 ， 京 北
化。 荧光光谱表 明， 超声作用使 Ｂ Ａ溶 液荧光光谱最 大发射峰发生了蓝移 ， 明超声改变 了 Ｂ Ａ中色氨酸 Ｓ 表 Ｓ （ｒ） Ｔ ｐ残基环境 ； 荧光强度 的降低表明超声 改变 了蛋 白质 分子的构象，具有荧光猝灭效应。采用对 Ｂ Ａ红外 Ｓ 光谱酰胺 Ｉ带进行 曲线拟合的方法 ， 定量分析了不 同超声功 率、时间对 Ｂ Ａ 二级结构 的影 响，发现超声作 Ｓ 用对 Ｂ Ａ 中的 旷螺旋 、 折叠 、 转角及无规卷曲的相对含量有 不同程度 的影 响；超声作用具有 使 Ｂ Ａ 的 Ｓ Ｓ 二级结构 由 螺旋 向 折叠 、 转角转化的趋 势，而无规则卷 曲含最则基本不受超声影 响而保持相对稳定 。 关键词 牛血清 白蛋白；超声 ； 傅里 １变换红外光谱 ； １ ｒ 二级结构
牛血清白蛋白的提取与鉴定实验讨论
一、概述1.1 背景介绍1.2 研究意义1.3 实验目的二、牛血清白蛋白提取实验2.1 实验材料与方法2.1.1 实验材料清单2.1.2 实验步骤2.2 实验结果2.3 实验讨论2.3.1 实验中可能出现的问题 2.3.2 实验结果的解释三、牛血清白蛋白鉴定3.1 实验材料与方法3.1.1 实验材料清单3.1.2 实验步骤3.2 实验结果3.3 实验讨论3.3.1 实验中可能出现的问题 3.3.2 实验结果的解释四、实验结果比较与分析4.1 提取实验和鉴定实验结果的比较4.2 实验结果的可能影响因素4.3 结果分析与讨论五、结论和展望5.1 实验总结5.2 结论5.3 下一步研究方向六、参考文献---在牛血清白蛋白的提取与鉴定实验中，我们希望探讨牛血清白蛋白的提取方法以及鉴定过程中的实验结果和可能的影响因素。
通过该实验，我们可以更好地了解牛血清白蛋白的特性和应用，为进一步研究提供参考和指导。
1.概述1.1背景介绍牛血清白蛋白是一种重要的蛋白质，在生物医学和生物工程领域有着广泛的应用。
其提取和鉴定方法对于研究人员来说至关重要。
1.2研究意义通过对牛血清白蛋白的提取和鉴定实验，可以为相关领域的研究提供重要数据支持，为医学和工程应用提供可靠依据。
1.3实验目的本次实验的主要目的是通过提取和鉴定牛血清白蛋白，验证提取方法的有效性，并探讨鉴定结果的可能影响因素。
2.牛血清白蛋白提取实验2.1实验材料与方法2.1.1实验材料清单- 牛血清样品- 离心管- 超声波破碎机- 离心机2.1.2实验步骤- 将牛血清样品放入离心管中- 使用超声波破碎机进行细胞破碎- 离心离心管，收集上清液作为提取的牛血清白蛋白2.2实验结果实验结果显示，通过超声波破碎和离心的方法，成功提取到了牛血清白蛋白。
2.3实验讨论2.3.1实验中可能出现的问题在超声波破碎过程中，可能会对蛋白质产生热性变性，影响提取效果。
2.3.2实验结果的解释通过超声波破碎和离心的方法，成功提取到了牛血清白蛋白，但可能存在蛋白质的变性情况，需要进一步鉴定确认。
牛血清白蛋白的荧光稳定性研究
牛血清白蛋白的荧光稳定性研究陈芳;陈妍;张彦峥;张银堂;徐茂田【摘要】研究了牛血清白蛋白(BSA)在不同条件下荧光发射光谱的稳定性.结果表明,Tris-HCl、PBS和PB等缓冲液种类,常量和微量等石英比色皿类型,对于BSA的荧光稳定性没有明显影响.激发波长260 nm与280nm对于BSA的荧光稳定性有显著性差异.超声和金属离子的干扰,都会导致BSA荧光强度的降低,在5％的误差范围内,各金属离子允许存在的倍数分别为:Cu2+(8),Zn2+ (40),Mg2+(96),Ca2+( 120).本研究对于蛋白质溶液的制备和前处理具有一定的理论和实际意义.%Fluorescence stability of bovine serum albumin (BSA) solutions was investigated under different conditions. The results indicated that buffer solutions,e. G. Tris-HC1,PBS and PB.and quartz cuvettes such as macro- and micro-cuvette did not affect fluorescence stability of BSA. BSA fluorescence showed significant stability diversity when excitation wavelength of 260 nm and 280 nm were used. Fluorescence intensity of BSA may be lowered by ultrasound or metal ions. Within 5% tolerance range of the detection Value,the maximum permissible multiples ofCu2+ ,Zn2+ ,Mg2+ and Ca2+ were 8,40,96 and 120,respectively. This study was of certain theoretic and practical significance for preparation and pretreatment of protein solution.【期刊名称】《应用化工》【年(卷),期】2011(040)009【总页数】4页(P1508-1511)【关键词】牛血清白蛋白;荧光;稳定性;缓冲液;超声【作者】陈芳;陈妍;张彦峥;张银堂;徐茂田【作者单位】商丘师范学院化学系纳米生物分析化学河南省高校重点实验室培育基地,河南商丘 476000;贵州大学精细化工研究开发中心,贵州贵阳 550025;郑州大学化学系,河南郑州 450052;商丘师范学院化学系纳米生物分析化学河南省高校重点实验室培育基地,河南商丘 476000;商丘师范学院化学系纳米生物分析化学河南省高校重点实验室培育基地,河南商丘 476000;郑州大学化学系,河南郑州 450052【正文语种】中文【中图分类】TQ931;O657.7血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质，它能与许多内源及外源性化合物结合，起到存储与转运的作用［1］，血清白蛋白与药物分子等小分子之间相互作用的研究一直受到人们的关注［2-5］。
超声对蛋白提取的影响
超声对蛋白提取的影响
1. 破碎细胞：超声的机械振动可以破坏细胞膜和细胞壁，有助于释放细胞内的蛋白质。
2. 增加溶解度：超声产生的空化作用可以帮助打破蛋白质与其他物质的结合，提高蛋白质在溶剂中的溶解度。
3. 促进提取效率：超声可以加速溶剂与蛋白质的相互作用，缩短提取时间并提高提取效率。
4. 减少酶活性：超声可能会导致一些酶失活，从而减少蛋白质的降解。
5. 影响蛋白结构：高强度的超声处理可能会对蛋白质的结构产生影响，例如导致变性或降解。
然而，超声处理对蛋白提取的具体影响取决于多种因素，如超声的参数 频率、功率、时间等）、溶剂的性质、蛋白质的特性以及提取的具体条件。
在进行超声处理时，需要进行适当的实验优化，以确保最佳的提取效果。
超声处理可能也会对一些蛋白质产生不利影响，例如导致蛋白质的变性或活性丧失。
因此，在进行蛋白提取时，需要根据蛋白质的性质和提取的要求，选择合适的超声条件，并结合其他提取方法，以获得最佳的提取结果。
超声照射下血卟啉_HP_对牛血清白蛋白_BSA_损伤的研究
2005年第63卷化学学报V ol. 63, 2005第20期, 1921～1926 ACTA CHIMICA SINICA No. 20, 1921～1926* E-mail: wangjun890@; Tel: +86-24-81917150; Fax: +86-24-62202053.Received March 23, 2005; revised June 13, 2005; accepted July 20, 2005.国家自然科学基金(No. 20371023)资助项目.1922化 学 学 报 V ol. 63, 2005更加明显的抗肿瘤效应[11,12]. 1989年, 日本学者梅村晋一郎(Umemura)等[13～16]首次在国际会议上报道了用超声波激活HP 杀伤肿瘤细胞和抑制肿瘤生长的初步尝试, 并把这种方法称为声动力学疗法(Sonodynamic treatment, SDT). 实验表明, HP 本身无抗肿瘤活性, 但被超声波激活后能产生强烈的抗肿瘤效应, 且能选择性地长时间聚集在肿瘤组织中. 因此, SDT 疗法在肿瘤治疗方面有广阔的应用前景.近十年来, 国内外许多学者就超声波激活HP 的实验装置、实验条件、对肿瘤的作用效果、作用机理等进行了大量的研究并取得了初步的成效, 但这些工作都是以肿瘤细胞为研究对象, 通过细胞膜的损伤使肿瘤细胞坏死来达到治疗肿瘤的目的[17～19]. 实际上, 正常细胞膜和肿瘤细胞膜之间的差别是相当小的, 抑制和杀死肿瘤细胞应以攻击具有各种功能的蛋白质和容易使药物具有靶向性的核酸为目标. 蛋白质是生物细胞最重要的组成物质, 是执行各种生命功能的主要大分子, 如果损伤了蛋白质分子, 那么就有可能造成自然情况下的细胞凋亡. 本文通过紫外-可见光谱(UV)和圆二色(CD)光谱观察HP 存在下, 超声波对牛血清白蛋白(BSA)的损伤, 为推动分子水平的SDT 疗法提供有意义的参考.1 实验部分1.1 仪器设备超声照射装置(KQ-100型, 频率为80 kHz, 功率为50 W, 昆山市超声仪器有限公司. 如图1所示, 实验过程中用温度计监测体系温度[(37.0±0.2) ℃]. 实验用分析仪器: 紫外-可见(UV-vis)光谱仪(Lambde-17型, 美国Perkin-Elmer 公司); 圆二色(CD)光谱仪(J-810型, 日本Jassco 分光公司).图1 超声照射装置Figure 1 Apparatus of ultrasonic irradiation1: transducer; 2: reaction solution; 3: thermometer; 4: gutter; 5: bracket1.2 试剂牛血清白蛋白(BSA, 北京奥博星生物技术责任有限公司产品), 使用时未经进一步纯化, 在0～4 ℃下溶于磷酸盐缓冲溶液配成储备液, 准确浓度由278 nm 处的吸光度确定, 储备液浓度为5.0×10－5 mol/L. 血卟啉(HP, Sigma 公司产品), 在0～4 ℃下溶于磷酸盐缓冲溶液中配成, 储备液浓度为1.0×10－4 mol/L, 使用时根据需要稀释成不同浓度. 磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.1 mol/L. 实验用水为二次蒸馏水. 其余试剂均为市售分析纯. 1.3 实验方法取四个(分别标记为a, b, c 和d)容量瓶, 准确量取浓度为5.0×10－4 mol/L 的BSA 溶液10.00 mL 放入a, c 和d 中, a 中不加HP, 其中c 和d 中分别加入5.00 mL 浓度为1.0×10－4 mol/L 的HP 溶液, b 中只加HP, 都用磷酸缓冲溶液稀释至50.00 mL. 将d 放入超声照射装置, 2.0 h 后取样. 测定a, b, c 和d 的UV 光谱, 以此判断HP 与BSA 的相互作用以及超声波结合HP 对BSA 分子的损伤作用, 结果如图2. 另外, 改变照射时间、HP 的加入量、离子强度和溶液酸度等, 考察这些因素对BSA 分子损伤的影响, 结果分别如图3～图7.图 2 不同条件下BSA 和HP 的紫外-可见吸收光谱 Figure 2 UV spectra of BSA and HP at different conditionsa: BSA (without irradiation); b: HP (without irradiation); c: BSA ＋HP (without irradiation); d: BSA ＋HP (with irradiation)2 结果与讨论2.1 BSA 和HP 相互作用及在超声波照射下的UV 光谱从图2中可以看出, 单纯的BSA 分子和HP 分别在278和380 nm 处有强的吸收峰(图中a 和b). 由于BSA 分子与HP 之间存在相互作用, BSA 分子在278 nm 处的吸收峰呈现出一定程度的增色并伴随着微小的紫移. 而HP 的吸收峰则发生红移, 由380 nm 移到了395 nm, 吸收峰的强度略有降低(图中c). 超声照射2.0 h 后, BSA 分子吸收峰的增色程度进一步加强, HP 吸收峰的峰位几乎没有变化, 但吸光度有少量的增加(图中d). 理论研究表No. 20 王君等：超声照射下血卟啉(HP)对牛血清白蛋白(BSA)损伤的研究1923明, BSA分子与小分子之间的作用通常是借助于氢键、静电引力、范德华力和疏水作用力等, 但与HP之间的结合应当以疏水作用为主, HP进入BSA分子的疏水腔中而与BSA分子形成复合物[20～23]. 另外, HP上电负性较大的O和N原子可以与BSA分子中位置合适的某些肽链上的酰胺形成氢键. 278 nm处的吸收峰是BSA分子中肽链上2个色氨酸和19个酪氨酸残基的芳杂环π-π*跃迁引起的. BSA分子与HP之间的相互作用一方面改变了BSA 分子的结构, 使芳杂环暴露, 紫外光谱表现为增色效应, 另一方面也改变了HP的电子结构, 使其峰位和峰高都发生了变化. 超声波激活HP产生的单线态氧(1O2)将会进攻BSA分子的二硫键, 氧化硫原子, 加剧了BSA分子结构的变化, 导致BSA分子二级结构的破坏, α-螺旋的减少和肽链的伸展等[24]. 而HP吸收峰的增加则是由于BSA结构的变化, 减弱或改变了BSA与HP之间作用的强度或方式.2.2 照射时间对损伤作用的影响BSA和HP溶液的浓度都为1.0×10－5 mol/L, 反应温度为37.0 ℃, 频率为80 kHz, 功率为50 W, pH＝7.2, 超声照射时间分别为1.0, 2.0, 4.0, 6.0和8.0 h, 采用UV 光谱考察不同照射时间对BSA分子的损伤和HP的变化情况.从图3可以看出, 随着超声照射时间的增加, BSA 分子在278 nm处的吸收峰不断增加, 呈现出越来越明显的增色效应. 这说明超声照射激活HP产生单线态1O2, 破坏了BSA分子结构使其发生了肽链伸展现象, 包围在BSA分子内部的色氨酸和酪氨酸残基的芳杂环疏水基团不断地裸露出来, 使吸收峰增强[25]. 超声照射时间愈长, 产生的单线态1O2愈多, BSA分子损伤也就越大. 单纯超声照射也会对BSA分子造成损伤, 但程度远远低于超声照射和HP的联合作用. BSA分子和HP共存时, HP在395n m处的吸收峰也随时间有微小的增图3 BSA, HP和BSA＋HP溶液的吸光度随照射时间的变化Figure 3 Changes of absorbance of BSA, HP and BSA＋HP solutions with irradiation time(278 nm for BSA and 395 nm for HP)■: BSA (and HP); ◆: HP (and BSA); □: BSA (no HP); ◇: HP (no BSA) 加. 这是因为BSA分子结构的破坏也改变了BSA与HP 之间的作用方式和强度, 导致HP在395 nm处的吸收峰升高. 但当BSA分子不存在时, HP的吸收峰却不断下降, 说明超声照射对HP也有一定的破坏.2.3 HP浓度对损伤作用的影响改变HP的浓度, 分别为1.0×10－5, 2.0×10－5, 3.0×10－5, 4.0×10－5和5.0×10－5 mol/L, 超声照射2 h, 其它条件同上.从图4可以看出, 随着HP浓度的增加, 在超声波的作用下, BSA在278 nm处的吸收峰逐渐增加, 其增加程度要大于未加超声波的BSA与HP之间相互作用的吸收峰, 这说明BSA分子二级结构所受损伤程度越来越严重, α-螺旋结构不断减少, 肽链逐渐伸展, 有更多的芳杂环疏水基团裸露出来, 使吸收峰增强. 但当HP浓度增至5.0×10－5 mol/L时, 增色作用反而减弱. 这是因为当HP的浓度增加到一定量时, 不但使BSA分子受到损伤, 使芳杂环疏水基团裸露, 而且还使部分裸露的芳杂环破坏, 导致BSA分子部分降解, 因此, 吸收峰反而减弱. HP在395 nm处的吸收峰表现出非线性的增加, 但超声波存在时增加的程度要显著一些.图4BSA＋HP溶液的吸光度随HP浓度的变化Figure 4 Changes of absorbance of BSA＋HP solutions with HP concentration(278 nm for BSA and 395 nm for HP)■: BSA (with irradiation); ◆: HP (with irradiation); □: BSA (without irradiation); ◇: HP (without irradiation)另外, CD光谱也证实了这种变化. 如图5所示, 随着HP浓度的增加(图中a→c), BSA分子典型二级结构的208和222 nm处负峰的振幅逐渐降低, 说明结构中α-螺旋含量不断减少[26～28]. 当HP浓度增大到 4.0×10－5 mol/L时(图中d), 峰型发生变化, 208 nm处负峰的振幅增大, 而222 nm处负峰的振幅继续减小, 说明此时部分降解后的BSA分子在组成和结构上都发生了变化, 很可能发生了断链. 进一步增大浓度, 两个峰的振幅不减反增, 说明断链后的的BSA分子发生收缩, α-螺旋含量有所增加, 但达不到原来的水平(图中e).1924化 学 学 报 Vol. 63, 2005图5 BSA ＋HP 溶液的CD 光谱随HP 浓度的变化Figure 5 CD spectra of BSA ＋HP solution with various HP concentrationa: 0; b: 1.0×10－5 mol/L; c: 3.0×10－5 mol/L; d: 4.0×10－5 mol/L; e: 5.0×10－5 mol/L2.4 溶液离子强度对损伤作用的影响用NaCl 调节溶液的离子强度, 使溶液中的NaCl 浓度分别为0, 100, 200, 300, 400和500 mmol/L, 其它条件同上.如图6所示, 适当的离子强度有利于超声波结合HP 对BSA 分子的损伤. 从图中可以看出随着离子强度的增加, BSA 分子在278 nm 处的紫外吸收峰逐渐上升. 这是因为与BSA 分子结合的自由水与盐解离产生的离子进行配位, 蛋白质表面的水层被破坏, 导致BSA 分子与HP 之间的相互作用增强. 但当离子强度(即NaCl 含量)进一步增大时, 部分HP 呈聚集态(395 nm 处的吸收峰降低), 与BSA 分子的作用能力减弱; 同时增大离子强度会使BSA 分子以α-螺旋结构为主存在, 这种结构更易受到损伤, 但前者起主要作用, 因此, BSA 分子的 损伤程度又开始减弱. 而单纯超声照射使BSA 分子的图6 BSA, HP 和BSA ＋HP 溶液的吸光度随NaCl 浓度的变化Figure 6 Changes of absorbance of BSA, HP and BSA ＋HP solutions with NaCl concentration(278 nm for BSA and 395 nm for HP)■: BSA (and HP); ◆: HP (and BSA); □: BSA (no HP); ◇: HP (no BSA)吸光度随NaCl 浓度的增加而微弱上升. HP 单独存在时的吸光度在超声波照射下也随离子强度的增加而下降, 说明NaCl 的存在促进了超声波对HP 的破坏. 2.5 溶液酸度对损伤作用的影响人体正常组织中的pH 为7.35～7.45, 而在肿瘤细胞中的pH 有时会发生微小的改变(约为6.9). 考虑到这一因素, 改变pH 值, 考察了在超声波与HP 协同作用下溶液酸度对BSA 分子损伤的影响. 溶液pH 值的变化范围为6.0～8.0, 其它条件同上.由图7可以看出, 与中性条件相比, 不论降低pH 还是升高pH, 都会使BSA 分子的损伤程度减弱. 改变溶液的酸碱度, 会使BSA 的分子结构发生微小变化, 结构的变化对疏水性氨基酸残基在BSA 分子内外的分配产生影响, 从而改变蛋白质分子的表面疏水性[29]. 酸性条件下, 色氨酸残基微环境的疏水性减弱, BSA 分子局部表面疏水性有所降低, 使BSA 分子和HP 作用能力减弱. 在中性溶液中BSA 分子的酪氨酸残基位于蛋白质分子与环境接触的表面, 基本上是“暴露”的, 更容易与HP 作用, 因此BSA 分子受损伤更明显. 尽管碱性条件下HP 和BSA 分子的结合更紧密一些, 但超声照射HP 产生的单线态1O 2的数目与中性条件下相比要减少, 且微碱性环境中单线态1O 2的氧化能力也有所降低, 因此BSA 分子的损伤程度大幅度的减弱. 相反, 单纯超声照射时BSA 分子的损伤程度会随pH 值的升高而略有上升, 估计这与BSA 分子的构型有关. 中性或偏碱时以α-螺旋结构为主的BSA 分子更易受到损伤. 而HP 的吸光度无论有无超声照射都会随pH 升高而升高, 但超声照射时的吸光度略高一些.图7 BSA, HP 和BSA ＋HP 溶液的吸光度随pH 的变化 Figure 7 Changes of absorbance of BSA, HP and BSA ＋HP solutions with pH(278 nm for BSA and 395 nm for HP)■: BSA (and HP); ◆: HP (and BSA); □: BSA (no HP); ◇: HP (no BSA)2.6 对BSA 损伤机理的探讨利用超声波激活HPD 抑制肿瘤生长或杀死肿瘤细No. 20 王君等：超声照射下血卟啉(HP)对牛血清白蛋白(BSA)损伤的研究1925胞的方法被日本学者Umemura称为SDT疗法. 在SDT疗法中, 由于HPD等光敏物质的选择聚集性以及所需超声波声强小等特点, 目前已成为国内外研究的热点. 对于超声波激活HP杀死肿瘤细胞的机理, 一些研究者认为超声波对HP有类似激光的激活过程, 并产生相似的产物如单线态1O2、过氧化物和氢氧自由基等[30,31].BSA分子和HP之间通过弱的结合力产生相互作用, 对于HP利用的是超声空化时产生的热能还是光能有待进一步的研究. 目前普遍认为“声致发光”和“热点”可用于解释这种激活的原因[32]. 最近的研究认为产生单线态1O2的主要诱因是超声空化后“热点”的高温效应[33]. 另外, 超声辐射能够导致较宽波长范围光的产生, 这些光会激发作为光敏剂的HP, 从而产生单线态1O2. 当然, 关于超声波激活HP损伤BSA分子的详细机理还需更深入的研究.3 结论利用UV光谱和CD光谱考察了在超声波和HP的联合作用下, 照射时间、HP浓度、离子强度和溶液酸度等因素对BSA分子损伤程度的影响. 照射时间越长, BSA分子的二级结构破坏越严重, UV光谱显示出明显的增色效应. HP浓度的增大不但破坏BSA分子的二级结构, 而且还导致肽链的断裂, CD光谱表现为先减色后增色的现象. 适当的离子强度有利于BSA分子的损伤, 但离子强度过高导致HP和BSA分子之间作用力减弱, 降低了BSA分子的损伤程度. pH过高和过低都不利于BSA分子的损伤. 从实验结果可以获得启示, 如果选择对肿瘤细胞具有靶向聚集性且能够穿过细胞膜的HPD 类化合物结合超声波照射, 可以比较容易地直接破坏肿瘤细胞内的各种蛋白质分子, 在深入研究的基础上, 或许不失为一种可行的肿瘤治疗方法.References1 Rassmussen, T. D. S.; Ward, G. E.; Figge, F. H. J. I. Cancer1955, 8, 78.2 Lipson, R. L.; Baldes, E. J.; Olsen, A. M. J. Natl. CancerInst. 1961, 26, 1.3 Gregorie, H. B. Ann. Surg. 1968, 107, 820.4 Lipson, R. L.; Gray, M. J.; Baldes, E. J. Cancer1967, 20,2255.5 Kelly, J. F.; Snell, M. E.; Berenbaum, M. C. Br. J. Cancer1975, 31, 237.6 Takahashi, S.; Zhavrid, E. A. Jpn. Soc. Laser Med. 1984, 4,99.7 Dougherty, T. J.; Kaufman, J. H.; Goldfarb, A. Cancer Res.1978, 38, 2628.8 Dougherty, T. J.; Lawrence, G.; Kaufman, J. H. J. Natl.Cancer Inst. 1979, 62, 233.9 Dougherty, T. J.; Grindery, G. B. J. Natl. Cancer Inst. 1975,55, 115.10 Umemura, S.; Kawabata, K.; Sasaki, K.; Yumita, N.;Umemura, K.; Nishigaki, R. Ultrason. Sonochem. 1996, 3,S187.11 Tachibana, K.; Kimura, N.; Okumura, M.; Eguchi, H.;Tachibana, S. Cancer Lett. 1993, 72, 195.12 Peng, J.-X.; Ma, Y.-Y. Acoust. Technol. 1995, 14, 187 (inChinese).(彭健新, 马玉英, 声学技术, 1995, 14, 187.)13 Yumita, N.; Nishigaki, R.; Umemura, K.; Umemura, S. Jpn.J. Cancer Res. 1990, 81, 304.14 Yumita, N.; Nishigaki, R.; Umemura, K.; Umemura, S. Jpn.J. Cancer Res. 1989, 80, 219.15 Umemura, S.; Yumita, N.; Nishigaki, R. Jpn. J. Cancer Res.1990, 81, 962.16 Umemura, S.; Yumita, N.; Nishigaki, R. Jpn. J. Cancer Res.1993, 84, 582.17 Suzuki, T.; Kamada, S.; Yoshida, Y.; Unno, K.Heterocycles1994, 38, 1209.18 Umemura, S.; Yumita, N.; Umemura, K.; Nishiigaki, R.Cancer Chemother. Pharmacol.1999, 43, 389.19 Naoto, N.; Norio, M. Life Sci.2002, 72, 321.20 Zhang, X.-W.; Zhao, F.-L.; Li, K.-A. Chem. J. Chin. Univ.1999, 20, 1063 (in Chinese).(张小威, 赵凤林, 李克安, 高等学校化学学报, 1999, 20,1063.)21 Guo, C.-C.; Li, H.-P.; Zhang, X.-B.; Tong, R.-B. Chem. J.Chin. 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超声辅助法研究姜黄素对牛血清白蛋白损伤的影响
牛血清白蛋白配制注意事项
牛血清白蛋白配制注意事项
牛血清白蛋白是一种重要的生化试剂，常用于细胞培养、免疫
学和生物化学实验中。
在进行牛血清白蛋白的配制时，有一些注意
事项需要牢记。
首先，要确保在配制过程中严格遵守无菌操作的原则，使用经
过消毒的器皿和工具，并保持清洁的工作环境，以防止外源性污染。
其次，牛血清白蛋白的配制需要使用高纯度的蒸馏水或无菌缓
冲液，以确保配制出的溶液不受微生物污染和离子污染。
在配制过
程中，要注意溶解牛血清白蛋白的温度和速度，通常建议在室温下
缓慢加入溶剂，并轻轻振荡而非搅拌，以避免产生气泡或使蛋白质
变性。
另外，牛血清白蛋白在配制过程中可能会出现凝聚或沉淀的情况，这可能是由于溶剂选择不当或溶解过程中的机械刺激所致。
因此，在溶解过程中要轻柔操作，避免剧烈振荡或搅拌。
此外，配制好的牛血清白蛋白溶液需要进行无菌过滤，以去除
悬浮的微生物和杂质，确保最终溶液的纯度和无菌性。
最后，配制好的牛血清白蛋白溶液要储存在干燥、阴凉、避光
的环境中，并且要密封保存，避免受到空气、光线和污染物的影响。
总的来说，牛血清白蛋白的配制需要严格遵守无菌操作原则，
注意溶剂选择和溶解过程中的操作细节，以及储存条件，确保最终
溶液的质量和稳定性。
希望这些注意事项能够对你有所帮助。
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2. 1 超声和高压处理对蛋白聚集的影响 2. 1. 1 H PLC 结果 超声 使 BSA 产生严重的 聚集, 随 处理时间 的延 长, 聚集 体增 多, 处理 10m in 后的 样 品 U 10 聚集体含量达到 51% 13% 。高压破碎处理 4 次 (通常破碎细胞最多处理 2次 ) 的样品 P4, 图谱看不出 明显变化, 未发现蛋白聚集 ( 图 1)。 2. 1. 2 动态光散射结果 DLS数据显示超声 处理后, BSA 的流体动力学半径由 3. 6nm 增加到 4. 7nm, 均 一 性降低。高压处理后的 样品, 流体 动力学半 径及样 品 的均一性 ( pd% )几乎没有改变 (图 2 )。 2. 1. 3 非变性 SDS PAGE 电泳结果 BSA 超声处理后 的样品出现明显的 聚集体条带, 而高压处理 的样品 条 带没有变化 ( 图 3)。 2. 2 高压破碎和超声破碎对 BSA 二级结构的影响
2006, 26( 1)
罗昭 峰 等: 超声和高压处理对牛血清 450W, 破碎 1s, 间歇 1s)。分别在处理 0m in、1m in、2m in、3m in、4m in、5m in、6m in、8m in 和 10m in 后取样, 所对应的样品编号为 U0、U 1、 、U8、U 10。 1. 2. 3 样 品 的 高 压 处 理 样 品 体 积 15m ,l 压 力 20 000ps,i 流速 15~ 20滴 /m in。同一样品连续处理 4次, 处理前及每次处理后均取出 1m l作为待检样品 (分别记 为 P0, P1, P2, P3, P4; 其中 P0 为未处理的 BSA, P1 ~ P4 分别表示 BSA 经高压破碎处理 1~ 4次的样品 )。 1. 2. 4 H PLC 检 测 条 件 上 样 量 20 ,l 分 离 柱 为 W aters Prote in 300SW, 分离范 围 10 ~ 300kD a。检测 波 长 280nm, 柱 温 为 室 温, 流 动 相 PBS ( 同 上 ) 流 速 0 75m l /m in。 数 据 处 理 软 件 为 W aters 公 司 的 M illinum 32。 1. 2. 5 CD 谱测试条件 样品浓度为 160 g /m ,l 每 个 样品测量 3 次取平均。控制程序为 Spectra m anager; 测 量 时 以 PBS 作 为 空 白 对 照, 氮 气 流 量 控 制 在 4~ 5L /m in。二级结构的含量按杨氏公式计算。 1. 2. 6 动 态 光 散 射测 量 样 品 经 高 速 离 心 后, 用 0 1 m 微孔滤膜过滤后直接上样检测, 样品体积 12 。l 测试温 度 25 , 激 光 波 长 为 824nm, 其 它 参 数 采 用 Dynam ics V 6的默认设置。 1. 2. 7 非变性聚 丙烯酰胺凝 胶电泳 DTT 在变性 聚 丙烯酰胺凝胶电泳中的作用是打开二硫键。本实验中 未加入 DTT, 所以依赖于二硫键结合在一 起的 BSA 聚 集体, 电泳过程中始终保持聚集状态。
1 材料与方法
1. 1 试剂和仪器 牛血清白蛋白 ( S igm a aldrich 公司, A 7030) 。超声
破碎仪 VC750 ( Son ics公司 )。高压破碎 仪 ( FRENCH PRESSURE CELL PRE SS ) FA078( Therm o Spectron ic公 司 )。H PLC: W aters高 效液 相色谱 仪 ( 600 泵, 2487 紫 外检 测 器 )。 园 二 色谱 仪 J 810 CD 谱 仪 ( JASCO 公 司 )。 动 态 光 散 射 仪: Dyn ap ro M S800 ( PROTE IN SOLUT IONS 公司 )。 1. 2 实验方法 1. 2. 1 蛋白溶液的配制 称取一定量的 BSA 溶解于 1
收稿日期: 2005 07 11 修回日期: 2005 10 20 * 电子信箱: lz@f us tc. edu. cn
目标蛋白结构的变化以及产生这种变化的机理。本文 直接以牛血 清白蛋白 ( B SA ) 作为研究 材料, 比较 高压 和超声处理下 BSA 结构的变化。为探讨这两种处理方 法在破碎细胞以及乳化蛋白时对蛋白的损伤机制提供 一定的实验基础。
10m in respect ively w ithou t m ann itol
3讨 论
3. 1 BSA 产生聚集的主要原因 聚集体的含 量随着超声 处理时间的 延长而增 多。
聚集可能由以下几个方面的原因造成: 一是热效应, 包 括整体温度的升高和空穴产生与复合伴随的局部高温 高压的变化。实验中利用冰浴使样品始终处于较低温 度。根据我们的 B SA 热稳定性实验结果以及已有的研 究报道 [ 12] , BSA 在 50 以 下不会 聚集, 所以 可以排 除
图 4 B SA超声和高压处理后 B SA二级结构的变化 F ig. 4 Th e secondary structure change of B SA after u ltrason ication and French press
2. 3 甘露醇对超声引起的 BSA 聚集的影响 在超声 处理的样品 中加入 100mm ol/L 的甘露 醇,
已有作者对两种方法的差别进行了探讨。在制备 -内酰胺酶[ 8]和氯霉素乙酰基转移酶 ( CAT) [9] 时高压破 碎效果较好。而在制备 半乳糖苷酶 [ 10] 和核酮糖 1, 5 二 磷酸羧化酶 /加氧酶 [11] 时, 超声却要优于高压破碎。
探讨两种方法作用机理上的差别对选择正确的破 碎方法具有重要的指导作用。已有的工作都是以细胞 作为样品, 以目标蛋白的活力作为检测指标, 可以直观 地反映出破碎方法的优劣。但是难以了解破碎过程中
induced by u ltrason ication 1~ 6: U ltrasound irrad iat ion 0, 2, 4, 6, 8, 10m in resp ectively w ith 100mm ol /L m ann ito;l 7~ 12: U ltrasound irrad iation 0, 2, 4, 6, 8,
破碎细胞是 制备胞内蛋 白的必需途 径, 目前用 于 细胞破碎的方法主要有超声破碎法和高压破碎法。但 迄今为止这两种破碎方法对目标蛋白的影响并没有一 个明确的结论。
超声破碎的机理涉及多种因素, 包括空穴产生与复 合伴随的高温 (几千 K)高压 (几百个大气压 )变化、机械 剪切力、气液界面的作用以及自由基的产生带来的理化 效应 [1] 。超声可以使一些大分子降解 [ 2, 3]、结构改变 [ 4] 、 形成聚集体以及化学键断裂等 [ 5]。高压破碎的机理主要 是由于样品流出时, 细胞内外压力降低的速度不同, 在膜 两侧形成巨大压力差, 使细胞膜破裂; 出口处液体高速流 动产生的剪切力也会导致细胞破裂 [ 8]。高压处理还可用 于乳化、制备脂质体以及降解高分子等 [ 6, 7]。
能对超声引起的聚集起到明显的抑制作用。超声处理 10m in 后, 含有甘露醇的样品中二聚体随时间延长而增 多, 单体略有减少; 而未加甘露醇的样品中, 10m in 后聚 集超过 60% , 单体显著减少 (图 5) 。
图 5 甘露醇对超声引起 BSA聚集的影 响 F ig. 5 M ann itol inh ib ition to th e BSA p olym er ization
PBS ( 137mm ol/L N aC ,l 2. 7mm ol /L KC ,l 4. 3mm ol/L N a2H PO4, 1. 4mm ol/L KH 2 PO4, pH 7. 2 ), 终浓度 1m g/ m 。l 用 0. 22微米的微孔滤膜过滤, 超声脱氧, 高速离心 ( 15 000 g, 10m in , 4 ), 取上清储于 4 备用 ( 24h 以内 使用 )。 1. 2. 2 样品的超声处理 将 35m l样品置于 50m l烧杯
Fig. 3 Nondenatu rin g SDS PAGE of BSA after u ltrasound irrad iation and French press
1, 3: BSA; 2: P4: Fren ch p ress 4 tim es; 4~ 6: U ltrasound irradiation for 0m in, 2m in and 4m in respectively at 450W
由于样品整体 温度升高导 致的聚集, 但 空穴破裂 时产 生的局部高温 高压仍有可 能引起聚集; 二是气液 界面 的存在, O liva等 [13] 发现在高速剪切时也会使 B SA 产生 聚集, 但这种聚集与剪切 速度没有 显著的 相关性。剪 切本身并不能 直接对蛋白 造成影响, 促 使聚集的 原因 在于蛋白自 身的性质和 剪切时产生大 量的气 液界面。 超声处理时无 法完全避免 气泡的产生, 所以认为 气液 界面是聚集产生的原因之一; 三是自由基的作用, 超声 处理产生的自由基会导致分子间形成二硫键, 从而引起 聚集。 BSA 含有大量的半胱氨酸, 加入自由基清除剂甘 露醇, 能显著抑制 BSA 聚集的产生 ( 图 5)。由此可以证 明自由基在 BSA的聚集中起着重要的作用。 3. 2 导致目标分子损伤的主要作用力
图 2 BSA 高压及超声处理前后 流体动力学半径的变化
Fig. 2 The hydrodynam ic rad ius d istr ibu tion of BSA by u ltrasound irradiation and Fren ch press
图 3 B SA经超声和高压处理后的 非变性 SDS PAGE 电泳
用 CD 测量 BSA 经两种方法处理前后二级结构的
图 1 BSA 经超声和高压处理后 HPLC 图谱的改变 Fig. 1 HPLC of BSA by ultrasound irrad iation and French press