重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定共38页文档
何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定
重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定姓名:郑小煜学号:201100140069班级:11级生技班同组者:赵莉、高瑞【实验目的】1、学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2、通过对DNA的酶切，学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
3、学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
4、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法。
5、学习并掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6、在使用红白菌落法筛选获得重组子的基础上，本实验学习通过对重组子进行重组质粒DNA的抽提鉴定，以进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段，验证重组子是期望的重组子的方法。
7、通过学习掌握重组DNA分子鉴定的基本方法。
8、掌握α互补筛选法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
9、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法。
10、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。
【实验原理】外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
1、限制性核酸内切酶及酶切反应体外构建重组DNA分子，首先，要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能得到完整的目的基因。
其次，要选择具有相应的单一酶切位点的质粒或者噬菌体等载体分子作为克隆的载体。
重组子筛选与鉴定
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
Luc基因在植物细胞内正常表达，可用于监测各种启动子 活性，测定与Luc基因嵌合的目的基因的表达情况，也用 于调控序列和基因的组织特异性表达。
③ 荧光素酶（LUC）基因
特点：迅速，灵敏，成本低，不存在放射性同位 素对人体健康和环境生态危害，也无内源荧光产 生的背景干扰，故Luc是一种理想的报告基因。
① β-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因
Gus基因最早是从E.coli 12中克隆出来的，能编码稳定的 Gus产物。与抗生素抗性基因不同的是Gus基因并非正选 择标记。
作为报告基因的重要依据：作为一种水解酶，转化植物细 胞所产生的β-葡萄糖酸苷酶，能够催化某些特殊反应的进 行，通过荧光、分光光度和组织化学的方法对这些特殊反 应产物的检测，即可确定gus报告基因的表达情况，从而 区分是否是转化子。
②二氢叶酸还原酶(DHFR)基因
DHFR催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，dhfr突变 体细胞不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代 谢途径，故不能在常规培养基上生长。
基因工程重组体克隆的筛选和鉴定
基因功能的正向遗传筛选技术
突变体库的构建
通过化学诱变、同源重组 等技术构建大规模突变体 库。
表型筛选
通过特定表型筛选出具有 特定功能的突变体。
突变基因的鉴定
通过测序等技术鉴定出突 变基因，并研究其功能。
05
克隆基因的应用前景
克隆基因在医学上的应用
疾病诊断与治疗
利用克隆技术获取特定基因，可用于疾病诊断、药物研发和个性化治疗。
基因敲入
将特定基因敲入生物体基因组，观察 生物体表型变化，以确定该基因的功 能。
基因表达干扰
通过转录因子或RNAi技术干扰特定 基因的表达，观察生物体表型变化， 以确定该基因的功能。
正向遗传筛选
通过突变体库筛选具有特定表型的突 变体，鉴定突变基因，以研究该基因 的功能。
基因敲除和敲入技术
基因敲除技术
基于测序的筛选
对转化子进行全基因组测序或目的基因片段测序，与已知序列进行比 对，判断是否含有目的基因。
蓝白筛选法
原理
步骤
利用载体上标记基因的表达产物对转化子 进行筛选，通过菌落颜色的变化判断是否 含有目的基因。
将转化子涂布在含有抗生素的培养基上， 培养后观察菌落颜色变化，蓝色菌落为阳 性克隆，白色菌落为阴性克隆。
基因表达的蛋白质印迹分析
原理
利用特异性抗体检测样品中特定蛋白质的表达情况，通过显 色反应或荧光信号对蛋白质进行定性或定量分析。
用等 方面的研究。
04
克隆基因的功能研究
基因功能研究的方法
基因敲除
通过基因工程技术将特定基因敲除， 观察生物体表型变化，以确定该基因 的功能。
Northern印迹杂交
原理
基于RNA的电泳分离和转移，将RNA 片段与标记的探针进行杂交，以检测 特异的RNA转录本。
转化子的筛选和重组子的鉴定
转化子的筛选和重组子的鉴定在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA 分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞。
再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所致。
因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中筛选出来。
一、基本定义：1、转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。
2、重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
3、阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的基因的重组子称为阳性克隆子或期望重组子。
4、筛选（选择）：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。
二、将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5三、转化子的筛选1、根据载体标记基因筛选转化子。
（1）方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。
（2）举例：抗药性标记插入失活选择法、根据载体除草剂抗性基因、β-半乳糖苷酶显色反应选择法、根据生长调节剂非依赖型筛选转化子、根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选。
2、根据报告基因筛选转化子。
（1）报告基因的定义：一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即表达产物易被鉴定的基因。
由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。
（2）成为报告基因的条件：报告基因的表达产物应是便于检测、定量和灵敏毒高的基因。
如：gus葡醛糖酸酶基因、Lus荧光虫荧光素酶基因、Gfp绿色荧光蛋白基因。
3、根据形成噬菌斑筛选转化子。
基因工程第七章 重组子的筛选和鉴定
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。
基因工程简答题总结
基因工程原理复习题思考题5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。
同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。
同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。
分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。
不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。
）6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？类型：DNA连接酶和RNA连接酶异同点：相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。
不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。
7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。
（传说中的网上答案）1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。
2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。
这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。
3、足够多的载体和插入片段是最重要的。
4、平端的连接对于离子浓度很敏感5、尽可能缩小连接反应的体积6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？1）大肠杆菌DNA聚合酶2）Klenow fragment3）T7 DNA聚合酶4）T4 DNA聚合酶5）修饰过的T7 DNA聚合酶6）逆转录酶7）Taq DNA聚合酶第四章基因克隆的载体系统1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；具有合适的筛选标记；具有较高的外源DNA的载装能力；具有多克隆位点（MCS）；具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。
3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。
这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。
重组子筛选
37℃培养
外源基因产物检测
聚丙烯酰胺凝胶电泳法
如果待筛选鉴定的目标蛋白既 不能测定生物活性，又无现成的抗 体使用，则可采用聚丙烯酰胺凝胶 电泳进行粗略的筛选
遗传学直接筛选法
抗药性 显色反应 营养缺陷型 噬菌斑形成能力等
此法简便快速，可以在大量群 体中进行筛选。但由于目的基 因插入重组分子的方向，多聚 体假阳性等原因，可靠性较差
酶切载体
蓝色菌落（自连）
白色菌落（重组子）
DNA片段
未转化的受体菌 （AmpS）
连接液 E.coli 感受态细胞
显标记主要区分 重组子 与 非重组子
LB + Amp + X-gal + IPTG 抗药性标记主要区分
转化子 与 非转化子
Amp lzcZ’
自连质粒转化子 （AmpR ， lzcZ’ ）
重组质粒1 重组质粒2 载体对照
克隆DNA序列检测
限制性酶切图谱法
限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图 谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法 不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。
但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验 成本也高。
lacZ△M15
AmpR
lacI lacP ,O lacZ´
NH2–
a-互补
–COOH
lacI lacP ,O lacZ△M15
X-gal → 半乳糖+ 5-溴-4-氯-靛蓝
a-互补（lacZ’ ）筛选原理
带有 lacZ’ 基因的质粒转入宿主菌后，在诱导物 IPTG（异丙基-b-D-
硫代半乳糖苷，isopropylthio-b-D-galactoside）诱导下，lacZ’ 基因合 成半乳糖苷酶 N-端片段，宿主菌染色体上的 lacZ△M15 基因合成半乳 糖苷酶 C-端片段。质粒编码的半乳糖苷酶 N-端片段可与宿主菌编码的 半乳糖苷酶 C-端片段结合，形成有酶学活性的 b-半乳糖苷酶。在呈色 底物 X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖苷，5-bromo-4-chloro-3indolyl-b-D-galactoside）存在时，形成蓝色菌落。