第三章 动植物细胞培养产酶
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工艺流程 外植体→细胞的获取→细胞培养→分离→纯化 产物 ①外植体选择和处理
选取那些无病虫害、生长旺盛、生长规则植株,把 茎、叶、根、芽,花、果实等切成小片段或小块。 用70%-75%乙醇,0.1%升汞消毒,无菌水漂洗。
外植体
水稻的外植体(幼 胚)和愈伤组织
愈伤组织
②植物细胞获取
直接分离法 愈伤组织诱导法 原生质体再生法
光照要求
对剪切力 主要产物
大多数要求
敏感
不要求
大多数不敏感
不要求
非常敏感
色素、药物、 醇、有机酸、氨 疫苗、激素、 香精、酶等 基酸、抗生素、 单克隆抗体、 核苷酸、酶等 酶等
2.培养基特点
应用最广的是MS培养基 常用的MS培养基和B5培养基的组成列于 P73表3-3
3.培养工艺:——悬浮细胞培养
第三章
动、植物细胞培养产酶
定义:动、植物细胞培养是通过特定技术 获得优良的动、植物细胞,然后在人工控 制条件的反应器中进行细胞培养,以获得 所需产物的过程。
一、动植物细胞中酶生物合成的调节
1.细胞分化改变酶的生物合成(如端粒酶) 2.基因扩增加速酶的合成 3.增强子促进酶的生物合成 4.抗原诱导抗体酶的生物合成
IgG与抗原形成 的交联晶格
3.酶与底物形成过渡态理论
酶的催化在于能结合底物产生过渡态,降低 能障(反应的活化能)。 以过渡态类似物作为半抗原,诱导与其 互补构象的抗体,使其具有催化活性,可观 察到抗体催化相应底物发生化学反应。
二、抗体酶的制备
1. 诱导法
用设计好的半抗原,通过与载体蛋白(如牛血清 白蛋白)偶联制成抗原。然后对动物进行免疫,使 宿主有机体针对抗原产生抗体,取免疫动物的脾细 胞与骨髓瘤细胞杂交,杂交细胞既能产生抗体又能 在体外培养。将杂交体克隆化,即能产生单一均匀 的抗体酶。
机械法 酶法
③细胞悬浮培养:转新培养基,在生物反 应器中进行培养 ④分离纯化:生化技术
4.植物细胞培养产酶实例
以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶(SOD)为例
(1)大蒜愈伤组织的诱导
选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣,去除外 皮,先用70%乙醇消毒20s,再用0.1%升汞消毒10min, 然后无菌水漂洗3次。 在无菌条件下,切成0.5cm3的小块,植入含有 3mg/L 2,4-D(二氯苯氧乙酸)和1.2mg/L 6-BA(苄 基腺嘌呤)的半固体MS培养基中,在25℃,600lux, 12h/d光照条件下培养18d,诱导得到愈伤组织,每18 天继代一次。
4.产酶实例
以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原 激活剂为例 纤溶酶原
纤溶酶原激活剂
纤溶酶
①种质细胞用胰蛋白酶处理,分散,pH7.4磷酸 盐洗涤。稀释成细胞悬浮液 ②接种到反应器中,与37℃ CO2培养箱中,长成 致密单层 ③去培养液,用pH7.4磷酸盐冲洗细胞 ④换无血清Eagle培养液(P83),继续培养 ⑤每3-4天,取出培养液分离纯化 ⑥再加新鲜Eagle培养液,继续培养 ⑦亲和层析进行分离
细胞生产滚瓶培养装臵
第三章
小结:
1.概念:外植体;愈伤组织;微载体培养 2.何谓抗体酶?试述获得抗体酶的主要方法。 3.论述植物细胞培养产酶的条件控制。 4.动物细胞培养的特点有哪些? 5.举例说明动物细胞培养产酶的工艺过程。
补充:
抗体酶
一、抗体酶的理论基础
1.抗体酶又称催化抗体(Catalytic antibody)是抗体的高度选 择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物,本质上是一类具有催 化活力的免疫球蛋白,在其可变区赋予了酶的属性。 2.抗原与抗体:当外源物性物质,如蛋白质、毒素、糖蛋白、脂 蛋白、核酸、多糖、颗粒(细菌、细胞、病毒)进入人或动物体 内时,机体的免疫系统便产生相应的免疫球蛋白(immune globin),并以之结合,以消除异物的毒害。此反应称为免疫反 应,此异物便是抗原,此球蛋白便是抗体。
2、抗体结合位点化学修饰法:
抗体酶和酶一样也可以用化学修饰法加以改造。 对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方 法在抗体结合位臵或附近引入具有催化功能的基因。 游离巯基就是适合的基团之一,它具有高亲核性, 易于氧化,及能通过二硫化物进行交换反应或亲电 反应而选择性修饰的特点。
三、抗体酶的应用
•细胞具有锚地依赖性(宜采用贴壁培养)和接触抑制性
•原代细胞一般繁殖50代
2.培养方式
(1)悬浮培养 (2)贴壁培养
滚瓶培养 微载体培养(microcarrier culture)
3.工艺流程
种质细胞 (体细胞;杂交瘤细胞) 分散成悬浮细胞 细胞悬浮或贴壁培 养 收集 分离纯化 产物
胰蛋白酶消化
(3)酶的分离纯化
细胞培养完成后,收集细胞,经过细胞 破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。
三、动物细胞培养产酶
1.动物细胞培养的特点
•动物细胞可以产生各种有效高价值的物质 •需添加抗生素(常用青霉素和链霉素联合) •细胞生长速度慢 •细胞体积大,无细胞壁保护,对剪切力敏感
•反应过程成本ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ(P81),产品价格贵
二、植物细胞培养产酶
与微生物细胞相比,动物细胞和植物细胞 具有各自不同的特性,需采用各自不同的 培养工艺。 1.植物细胞的特性
植物、动物、微生物细胞的特性比较
细胞种类 植物细胞 微生物细胞
1~10 0.3-6 简单
动物细胞
10~100 ﹥15 复杂
细胞大小/um 200~300 倍增时间/h 营养要求 ﹥12 简单
1.戒毒:
用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半抗原, 产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解,水解后的可卡 因片断失去可卡因刺激功能。
2.肿瘤治疗
抗体介导前药治疗技术:将能水解前药释放 出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶 联,则酶通过和肿瘤结合的抗体存在于细胞 的表面。静脉给药后,当药物扩散至肿瘤细 胞的表面或附近,抗体酶将前药迅速水解释 放出抗肿瘤药物。
(2)大蒜悬浮细胞培养
将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组 织,在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中,加入灭菌的玻 璃珠,25℃,600lux,12h/d光照条件下震荡培养 10-12d,使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。 然后在无菌条件下,经过筛网将小细胞团或单 细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体 MS培养基中,25℃,600lux,12h/d光照条件下震荡 培养18d。
选取那些无病虫害、生长旺盛、生长规则植株,把 茎、叶、根、芽,花、果实等切成小片段或小块。 用70%-75%乙醇,0.1%升汞消毒,无菌水漂洗。
外植体
水稻的外植体(幼 胚)和愈伤组织
愈伤组织
②植物细胞获取
直接分离法 愈伤组织诱导法 原生质体再生法
光照要求
对剪切力 主要产物
大多数要求
敏感
不要求
大多数不敏感
不要求
非常敏感
色素、药物、 醇、有机酸、氨 疫苗、激素、 香精、酶等 基酸、抗生素、 单克隆抗体、 核苷酸、酶等 酶等
2.培养基特点
应用最广的是MS培养基 常用的MS培养基和B5培养基的组成列于 P73表3-3
3.培养工艺:——悬浮细胞培养
第三章
动、植物细胞培养产酶
定义:动、植物细胞培养是通过特定技术 获得优良的动、植物细胞,然后在人工控 制条件的反应器中进行细胞培养,以获得 所需产物的过程。
一、动植物细胞中酶生物合成的调节
1.细胞分化改变酶的生物合成(如端粒酶) 2.基因扩增加速酶的合成 3.增强子促进酶的生物合成 4.抗原诱导抗体酶的生物合成
IgG与抗原形成 的交联晶格
3.酶与底物形成过渡态理论
酶的催化在于能结合底物产生过渡态,降低 能障(反应的活化能)。 以过渡态类似物作为半抗原,诱导与其 互补构象的抗体,使其具有催化活性,可观 察到抗体催化相应底物发生化学反应。
二、抗体酶的制备
1. 诱导法
用设计好的半抗原,通过与载体蛋白(如牛血清 白蛋白)偶联制成抗原。然后对动物进行免疫,使 宿主有机体针对抗原产生抗体,取免疫动物的脾细 胞与骨髓瘤细胞杂交,杂交细胞既能产生抗体又能 在体外培养。将杂交体克隆化,即能产生单一均匀 的抗体酶。
机械法 酶法
③细胞悬浮培养:转新培养基,在生物反 应器中进行培养 ④分离纯化:生化技术
4.植物细胞培养产酶实例
以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶(SOD)为例
(1)大蒜愈伤组织的诱导
选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣,去除外 皮,先用70%乙醇消毒20s,再用0.1%升汞消毒10min, 然后无菌水漂洗3次。 在无菌条件下,切成0.5cm3的小块,植入含有 3mg/L 2,4-D(二氯苯氧乙酸)和1.2mg/L 6-BA(苄 基腺嘌呤)的半固体MS培养基中,在25℃,600lux, 12h/d光照条件下培养18d,诱导得到愈伤组织,每18 天继代一次。
4.产酶实例
以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原 激活剂为例 纤溶酶原
纤溶酶原激活剂
纤溶酶
①种质细胞用胰蛋白酶处理,分散,pH7.4磷酸 盐洗涤。稀释成细胞悬浮液 ②接种到反应器中,与37℃ CO2培养箱中,长成 致密单层 ③去培养液,用pH7.4磷酸盐冲洗细胞 ④换无血清Eagle培养液(P83),继续培养 ⑤每3-4天,取出培养液分离纯化 ⑥再加新鲜Eagle培养液,继续培养 ⑦亲和层析进行分离
细胞生产滚瓶培养装臵
第三章
小结:
1.概念:外植体;愈伤组织;微载体培养 2.何谓抗体酶?试述获得抗体酶的主要方法。 3.论述植物细胞培养产酶的条件控制。 4.动物细胞培养的特点有哪些? 5.举例说明动物细胞培养产酶的工艺过程。
补充:
抗体酶
一、抗体酶的理论基础
1.抗体酶又称催化抗体(Catalytic antibody)是抗体的高度选 择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物,本质上是一类具有催 化活力的免疫球蛋白,在其可变区赋予了酶的属性。 2.抗原与抗体:当外源物性物质,如蛋白质、毒素、糖蛋白、脂 蛋白、核酸、多糖、颗粒(细菌、细胞、病毒)进入人或动物体 内时,机体的免疫系统便产生相应的免疫球蛋白(immune globin),并以之结合,以消除异物的毒害。此反应称为免疫反 应,此异物便是抗原,此球蛋白便是抗体。
2、抗体结合位点化学修饰法:
抗体酶和酶一样也可以用化学修饰法加以改造。 对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方 法在抗体结合位臵或附近引入具有催化功能的基因。 游离巯基就是适合的基团之一,它具有高亲核性, 易于氧化,及能通过二硫化物进行交换反应或亲电 反应而选择性修饰的特点。
三、抗体酶的应用
•细胞具有锚地依赖性(宜采用贴壁培养)和接触抑制性
•原代细胞一般繁殖50代
2.培养方式
(1)悬浮培养 (2)贴壁培养
滚瓶培养 微载体培养(microcarrier culture)
3.工艺流程
种质细胞 (体细胞;杂交瘤细胞) 分散成悬浮细胞 细胞悬浮或贴壁培 养 收集 分离纯化 产物
胰蛋白酶消化
(3)酶的分离纯化
细胞培养完成后,收集细胞,经过细胞 破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。
三、动物细胞培养产酶
1.动物细胞培养的特点
•动物细胞可以产生各种有效高价值的物质 •需添加抗生素(常用青霉素和链霉素联合) •细胞生长速度慢 •细胞体积大,无细胞壁保护,对剪切力敏感
•反应过程成本ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ(P81),产品价格贵
二、植物细胞培养产酶
与微生物细胞相比,动物细胞和植物细胞 具有各自不同的特性,需采用各自不同的 培养工艺。 1.植物细胞的特性
植物、动物、微生物细胞的特性比较
细胞种类 植物细胞 微生物细胞
1~10 0.3-6 简单
动物细胞
10~100 ﹥15 复杂
细胞大小/um 200~300 倍增时间/h 营养要求 ﹥12 简单
1.戒毒:
用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半抗原, 产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解,水解后的可卡 因片断失去可卡因刺激功能。
2.肿瘤治疗
抗体介导前药治疗技术:将能水解前药释放 出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶 联,则酶通过和肿瘤结合的抗体存在于细胞 的表面。静脉给药后,当药物扩散至肿瘤细 胞的表面或附近,抗体酶将前药迅速水解释 放出抗肿瘤药物。
(2)大蒜悬浮细胞培养
将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组 织,在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中,加入灭菌的玻 璃珠,25℃,600lux,12h/d光照条件下震荡培养 10-12d,使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。 然后在无菌条件下,经过筛网将小细胞团或单 细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体 MS培养基中,25℃,600lux,12h/d光照条件下震荡 培养18d。