丹参叶绿体基因组进化分析
药用植物叶绿体基因组研究
世界科学技术—中医药现代化★专题讨论：中药资源研究的前沿技术〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕收稿日期：2010-06-02修回日期：2010-06-12*国家自然科学基金面上项目（30970307）：叶绿体全基因组条形码鉴定方法研究，负责人：陈士林。
**联系人：林小涵，在读博士研究生，主要研究方向：生药学，E-mail ：lxhlena@ ；李西文，博士，主要研究方向：中药资源可持续利用，E-mail ：xwli@ 。
摘要：本文在总结植物叶绿体基因组测序研究进展基础上，提出了药用植物叶绿体基因组测序的策略，对物种的选择，测序平台的确定，生物信息学工具的综合分析应用，样品提取、分析及检测等技术环节进行了深入讨论。
关键词：药用植物叶绿体全基因组测序策略doi:10.3969/j.issn.1674-3849.2010.03.027叶绿体相关研究在过去的数十年取得了巨大成就，尤其在利用基因序列研究叶绿体的起源、结构、进化、正反向遗传学、叶绿体基因工程等方面取得了重大进展[1~3]。
随着大规模测序技术的不断发展，特别是二代测序技术的应用，极大推动了叶绿体基因组的深入研究。
目前，已有170多个物种的叶绿体全基因组序列在NCBI 发布(/genomes/genlist.cgi?taxid=2759&type=4&name=Eukary -otae%20Organelles ），但多数物种为农作物或经济作物，药用植物的叶绿体全基因组序列相对较少，很大程度上限制了药用植物的药物代谢工程、转基因工程、物种鉴定及进化等方面的发展。
本文在前人研究的基础上，基于新一代测序技术在药用植物叶绿体全基因组测序研究中的应用进行探讨，提出一种新的叶绿体基因组测序的策略。
丹参的生物技术
丹参的生物技术摘要：现代生物工程技术是进行中药材品质改良的可行途径之一。
本文对丹参的组织培养、毛状根诱导培养及基因工程等方面的研究进展与具体方法以及目前存在的问题做一综述。
关键词：丹参生物技术细胞与组织培养基因工程毛壮根培养一、概述中药丹参是唇形科鼠尾草属的多年生草本植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge) 的干燥根及根茎 , 因其色红且形状似参而得名“丹参”,又称血参、紫丹参、红丹参等。
丹参作为一传统中药在我国沿用已久 ,始载于《神农本草经》,被列为上品。
《本草经疏》《、本草纲目》中都有记载。
丹参具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功效 , 主治冠心病、心绞痛、心烦不眠、月经不调、经闭痛经等症。
近年来研究发现用来治疗心血管疾病 ,疗效显著。
丹参属于用量较大的常用药材。
丹参商品野生、家种均有(50年代以前野生为药用主要来源，仅有四川一地有家种产品，60年代后全国各地均有引种)。
野生资源主要分布于河北、北京、山西、山东、湖北，湖南、辽宁、江苏、江西、云南、贵州、甘肃、陕西；家种则主要分布于河北、天津，江苏、上海、浙江、安徽、河南、山东、四川等省。
当中，以四川中江等地栽培品为最佳。
二、国内外研究现状及研究所取得的成果现代生物技术是以基因工程、细胞工程、发酵工业、酶工程、生化工程以及后来衍生出来的第二代、第三代的蛋白质工程、抗体工程和糖链工程等为主体的高新技术,它被看作是 21世纪科学技术的核心。
纵观这一领域,生物技术的产业化首先是从医药领域开始的,现代生物技术的发展使医药产业发生了革命性的变化。
近 10多年来,从天然产物中寻找新的生理活性成分或先导化合物以开发新药已成为全球关注和研究的热点。
由于野生药材资源日益枯竭,人工栽培品种品质不稳定,生物技术的兴起对传统药材的生产展示了广泛的应用前景。
为了提高品质 ,满足市场需求 ,近年来利用细胞工程、基因工程等现代生物工程技术对丹参作了深入的应用性研究。
丹参种质资源的遗传多样性研究
丹参种质资源的遗传多样性研究丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)是我国常用大宗药材,具有广泛的药理作用,药材使用量逐年增加。
随着丹参野生资源的数量逐年减少,栽培面积逐年增大,但是栽培丹参存在严重混杂现象。
目前丹参的种植主要集中于四川的中江、陕西、山东、河南、河北等地。
对各产地丹参种源进行遗传多样性和群体遗传结构分析,明确各产地丹参资源的遗传基础和亲缘关系,可为丹参资源的收集保存、分类鉴定、合理开发利用奠定基础,对解决当前丹参种质资源混杂和指导丹参品种选育具有重要的意义。
本研究以来自山东省内外的9个丹参居群为材料,从形态学、细胞学、分子生物学等方面对其形态性状、开花生物学及繁殖特点进行了鉴定和观测,对供试丹参资源各居群的遗传多样性及亲缘关系进行了分析,对11个丹参分离类型进行了产量和品质性状的评价,从中筛选出适于泰安种植的优良栽培类型。
获得的主要研究结果如下:1.通过对9个居群的丹参种质资源地上部性状分析证明,42个性状中叶柄颜色、叶柄长、叶长、叶宽、叶形指数等叶片性状、花色、花萼颜色、株高、冠幅、分枝数等在丹参种质资源中的多样性较大;其遗传多样性存在于居群内和居群间且两者变异程度相近。
通过各居群的遗传多样性比较发现,泰安地区的丹参居群多样性程度最高,菏泽和四川中江的丹参居群较低,其它居群的多样性指数比较接近;省间材料聚类分析结果表明,河南内乡与河南卢氏丹参居群的亲缘关系最近,山东泰安与其它居群的亲缘关系最远;山东省内潍坊与临沂居群的亲缘关系最近,菏泽与其它居群的距离最远。
42个性状聚类可分成6组,综合为7个主成分,其累积贡献率达70.17%;根据主成分分析的结果与性状间的相关性,选出影响力较大的16个性状,包括花部因子、茎部因子、叶部因子等地上部性状,可较好的代替42个性状用于种质聚类分析。
利用欧式遗传距离进行UPGMA聚类可将90个材料分为6个类群;根据主成分分析结果和各类群特点,提出了丹参的分类标准,该标准对今后丹参种质的评价具有一定的指导意义。
丹参的叶绿体和线粒体基因组研究共3篇
丹参的叶绿体和线粒体基因组研究共3篇丹参的叶绿体和线粒体基因组研究1丹参的叶绿体和线粒体基因组研究丹参是一种流行于中国南方的枸杞科植物，在传统药材中被广泛应用，是丹参酮、丹参酸等生物活性成分的主要来源。
然而，对其基因组研究却相对较少。
本文将重点介绍我国科学家们对丹参叶绿体和线粒体基因组研究的进展。
叶绿体是植物细胞中的一种细胞器，负责进行光合作用，其基因组通常较小，仅有几十至几百个基因。
丹参的叶绿体基因组大小为157,633 bp，含有111个基因，其中包括80个编码蛋白质的基因、29个tRNA基因和4个rRNA基因。
丹参叶绿体基因组研究的主要任务是构建其全基因组序列，并对其进行比对分析，以了解丹参叶绿体基因组的特点和演化。
在近年来的研究中，我国科学家们利用Illumina高通量测序技术得到了丹参叶绿体基因组序列，并进行了基因注释和比对分析。
结果表明，丹参叶绿体基因组中有6个基因存在内部缺失区域，其中trnK-UUU、rpl2和rps19是由蛋白编码基因的转录后剪接产生的，而另外三个基因gyrA、ycf1和ycf2缺失是由于基因复制和逆转录导致的。
此外，丹参叶绿体基因组序列的变异分析表明，其与其他植物物种的亲缘关系最近的是广义伞形科植物。
线粒体是细胞中负责细胞呼吸和能量代谢的细胞器，同时也参与了细胞的凋亡等许多重要生物学过程。
线粒体基因组也是细胞器基因组的一种。
丹参线粒体基因组的大小为505,725 bp，包括41个编码蛋白质的基因、27个tRNA基因和3个rRNA基因，其基因数目和基因组大小与其他双子叶植物的基因组大小相当。
丹参线粒体基因组的研究较为有限，但在近年来的研究中，我国科学家们也利用高通量测序技术对其进行了测序和分析。
结果表明，丹参线粒体基因组的基因组结构和基因组组成与其他双子叶植物基本一致，但是其中一些基因序列存在着与其他植物基因组不同的特征。
例如，在nad4L基因中，存在一段与其他植物不同的延长区域，并且在cox2基因中，也发现了一种与其他植物不同的基因编码方式。
丹参三倍体育性的细胞学分析
丹参三倍体育性的细胞学分析作者：张铌璇张璐瑶曹艳楠郑桂恒龙鸿来源：《热带作物学报》2019年第08期摘要由丹参四倍体和二倍体杂交获得丹参三倍体，三倍体植株高度不育。
为探讨其育性的细胞学机制，我们采用细胞学和解剖学的方法，对其花粉母细胞发育过程中的染色体和细胞学表现进行了观测。
结果表明，丹参三倍体植株生长正常，在花粉母细胞减数分裂过程中存在落后染色体、染色体不均等分向两极、染色体桥等异常现象，分裂结果产生三分体、微核等，而且花粉粒形态异常，产生畸变，萌发率极低。
这些说明，丹参三倍体在生长发育过程中，由于减数分裂过程中染色体数目不平衡，在减数分裂过程中产生各种畸变、异常的染色体和细胞的行为表现，是造成其不育的主要原因。
本研究为丹参三倍体育性研究提供理论依据，也为丹参育种生产实践提供指导。
关键词三倍体;育性;花粉母细胞;减数分裂;丹参中图分类号 Q945.53 文献标识码 AAbstract Triploid Salvia， with characters of sterility， was obtained through hybridization of diploid and tetraploid. In order to investigate the cytological mechanisms of its sterility， we observed the chromosome change and cell structure during the development of pollen mother cells. Results showed the triploid plants grew well. Numerous meiotic abnormalities， including lagging chromosomes， asymmetrical separation and chromosome bridges were found during the meiosis process. Micronuclei and triads were observed except tetrads. Moreover， the shape of the pollen was abnormal， and the pollen germination rate was very low. This indicated that the chromosomal and cytological abnormalities in the meiotic process due to chromosome number imbalance may lead to sterility in triploid Salvia. The data could provide experimental supports of fertility of triploid Salvia， and be useful in the breeding of the traditional Chinese medical herb.Keywords triploid; fertility; pollen mother cell; meiosis; Salvia miltiorrhizaDOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.08.013唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）是中国传统中药的重要组成，丹参味苦，微寒，有活血祛瘀、痛经止痛、清心除烦、凉血消痈的功效，主要用于胸痹心痛、脘腹胁痛，心烦不眠、痛经闭经、疮疡肿痛等的治疗[1]。
不同产地丹参遗传关系的DNA标记分析
不同产地丹参遗传关系的DNA标记分析（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：徐红，王燕燕，王峥涛，胡之壁【摘要】目的分析不同产地丹参的遗传背景与遗传关系，为丹参药材的栽培育种提供依据。
方法采用RAPD与ISSR标记对4个产地的野生丹参、6个产地的栽培丹参共计50个样本进行分析，利用分析软件计算遗传相似性，建立遗传聚类图。
结果DNA标记共检测了102个位点，多态条带比率（P）为95.10%，栽培丹参的P值高于野生丹参；居群的总遗传变异Ht为0.238 9；UPGMA聚类可以将不同来源的丹参很好地区分开来。
结论不同产地间的丹参存在丰富的遗传多样性，丹参种质在遗传背景上较为复杂，不同产地的丹参已出现明显的遗传分化，但是与地理分布没有相关性。
【关键词】丹参；遗传关系；DNA标记Abstract：ObjectiveTo study the genetic background and relationship of Salvia miltiorrhizae from different population, and provide reference for the seed selection andcultivation.MethodsGenetic relationship of total 4 wild populations and 6 cultivated populations of S. miltiorrhizae were investigated by ISSR and RAPD analysis, the genetic identity was analyzed by software Popgene 3.2 and the DNA molecular dendrogram was set up by the software NTSYSpc 2.1. ResultsA total of 102 markers with 95.10% polymorphic loci (P) were scored, and the number of P among cultivation population was higher than that of wild population. The Nei’s gene diversity index (Ht) was 0.238 9, and the dendrogram from the clustering of UPGMA showed the good classification of all populations.ConclusionS. miltiorrhizae from different population shows abundant genetic diversities, and their genetic background are complex. There are obvious genetic differentiations among different S. miltiorrhizae, but the genetic relationships did not show coherent with geographical distribution.Key words：Salvia miltiorrhizae; Genetic relationship; DNA molecular markers丹参Salvia miltiorrhiza Bge.为唇形科多年生草本植物，具有活血化瘀、消肿止痛、养心安神等功效，常被用于单方、成药、保健品及化妆品，是我国重要出口大宗药材之一。
丹参遗传转化体系的构建及SmGGPPS和SmKSL的转基因研究中期报告
丹参遗传转化体系的构建及SmGGPPS和SmKSL
的转基因研究中期报告
1.研究背景
丹参是常用的中草药，含有多种活性成分，如丹参酮、丹参酸、丹酚等。
其中，丹参酮是丹参中最主要的成分之一，具有抗凝、扩张冠状动脉、抗氧化等多种药理作用，被广泛应用于临床治疗。
由于丹参的天然产量较低，且生产过程复杂，限制了其在临床上的应用。
因此，利用遗传转化技术将关键酶基因导入丹参中，提高丹参酮的合成效率，已成为丹参基因改良的一个重要方向。
2.研究目的
本研究的主要目的是构建丹参的遗传转化体系，将关键酶基因SmGGPPS和SmKSL导入丹参中，提高丹参酮的合成能力，并分析其生物学特性和药理作用，为丹参的基因改良提供理论和实践依据。
3.研究内容与进展
（1）提取和鉴定丹参基因组DNA，利用PCR扩增出目的基因SmGGPPS和SmKSL的全长序列，并进行克隆和序列分析。
（2）利用农杆菌介导的方法将SmGGPPS和SmKSL基因导入丹参中，并进行筛选和鉴定。
通过PCR、Southern印迹和Western印迹等多种方法验证了转基因丹参的存在和目的基因的表达。
（3）对转基因丹参的生理和生化特性进行了研究。
结果表明，转基因丹参的丹参酮含量明显提高，平均值提高了近2倍。
另外，转基因丹参的生长和发育等方面和野生型丹参无显著差异。
4.研究展望
本研究的中期成果初步验证了将SmGGPPS和SmKSL导入丹参中可以提高丹参酮的合成效率，为丹参的基因改良提供理论和实践依据。
下一步，我们将进一步探究丹参酮的合成途径，优化转基因体系，提高丹参酮的产量和纯度，为丹参基因改良和应用提供更好的支持。
丹参鉴定学专论
指纹图谱鉴别(HPLC法)
• 具有色谱稳定性好、柱效高、应用范围广等特点,是中药指 纹图谱研究中常用的手段。对丹参等几种中药指纹图谱与 代谢指纹图谱研究的结果,指出不同产地的药材在指纹图谱 上存在较大差异。
9/6/2019
分子生物学鉴别方法
• 1 RAPD鉴别法：随机扩增的多态性DNA(RAPD)技术已经 被广泛应用于物种鉴别。
9/6/2019
• 丹参 EST-SSR 引物情况表
引物编号 重复基元 GeneBank EST 编号 预期产物bp 引物序列 （℃）
退火温度
SSR001 (TACA)5 SSR002 (CA)16 SSR003 (CT)10 SSR004 (AAC)6 SSR005 (GTG)6 SSR006 (ATC)5
165 CTCCGCTTCGCTCCTCTT 57.7 TGCTCGCTTCGTCGTCTT 57.2
181 AGGTTACTACCGATGAAGCAG 54.1 AGTTGAGTGGTGATGGAAGAT 53.2
145 GACTTTGGATGCCTGCTC 52.9 GACGCCGCTACTTTCTAT 50.2
• 植物学特性鉴别传统方法大多根据丹参的形态方面对药材 的真伪进行鉴别。
• 丹参为多年生草本,根砖红色,茎高40~80 cm,多分枝,被长柔 毛。叶常为奇数羽状复叶。叶柄长1~7 cm,小叶3~7,顶端小 叶较大。小叶卵形或椭圆状卵形。长1. 5~8 cm,宽0. 8~5cm, 先端钝,边缘具圆锯齿,两面被柔毛,下面较密,花序顶生或腋 生轮伞花序有花6至多花,组成假总状花序,密被腺毛及长柔 毛;小苞片披针形;花萼钟状,长1~1. 3 cm,先端二唇形,萼筒喉 部密被白色柔毛;花冠蓝紫色,二唇形,长2~2. 7 cm,花冠筒外 伸,弯曲,上长达2 cm,筒内有毛环;雄蕊2,药隔长,花丝短,上臂 药室发育, 2下臂的药室不育且联合;小坚果4,椭圆形,花期 5~8月,果期8~9月。
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Medicinal Plant Salvia miltiorr因组全长151,328bp, 编码114个,包含80个 蛋白编码、30个tRNA和4个rRNA基因。共检测到4对正向、3 对反向和7条串联重复序列。 比较基因组研究表明丹参与其他三个唇形目物种的叶绿体基 因组之间整体相似性较好,但基因间区的变异较大。 基于71个叶绿体蛋白编码基因的系统进化研究表明丹参在现 有叶绿体基因组公布的菊分支物种中与芝麻关系最近。
共编码114个基因,蛋 白编码基因80个、 tRNA30个、rRNA4个 。 IR区6个蛋白编码基因、 7个tRNA基因以及4个 rRNA基因。 LSC区蛋白编码基因 61个、tRNA基因22个。 SSC区只有蛋白编码 基因12个和tRNA基因 1个。
丹参的叶绿体基因组共有18个基因含有内含子,其 中3个基因QclpP、rpsl2、yq/3)含有2个内含子(表 3-5)。值得注意的是A77W2是一个反式剪接基因,它 的5’端位于LSC区,3’端在两个IR区各有一个拷贝。 内含子最长,达2,522bp,包含基因
基因组序列比对： MUMmer 正反向重复序列分析： REPuter 串联重复序列分析： Tandem Repeats Finder (TRF) v4.04 简单重复序列分析： MISA 蛋白编码基因序列比对： Kimura’s twoparameter (K2P) model 进化树构建： PAUP4.0b10
系统进化分析
基于71个共有蛋白编码基因的菊分支MP系统进化树
结论
丹参的叶绿体基因组同大多数已公布的被子植物叶绿体基因 组一样，由一对IR区分隔LSC和SSC区，呈典型的四段式结 构。含有4对正向、3对反向和7条串联重复序列,其中大部分 均位于基因间区和内含子序列，但也有一些位于tRNA和蛋 白编码区。 本研究基于71个叶绿体蛋白编码基因的系统进化分析表明丹 参在现有叶绿体基因组公布的菊分支物种中与芝麻关系最近。
结果分析
基因组结构：丹参的叶绿体基因组序列长151,328bp,
呈典型的四段式结构,其中LSC区长82,695bp,SSC区长 17,555bp,两个IR区长25,539bp,GC含量38.0%,与已经报 道的菊分支其他物种GC含量相似。IR区的GC含量(43.1%) 明显高于LSC区(36.2%)和SSC区(32.0%),这主要由IR区 包含的四个高GC含量的rRNA(55.2%)基因所致。
IR区收缩与扩张
IRb/SSC边界均延伸进入ycf1基因产生ycf1假基因 丹参及拟南芥的ycf1假基因和ndhF基因有重叠
IRa/SSC边界位于基因编码区 不同长度rps19假基因位于IRa/LSC
trnH基因均位于LSC区,距离IRa/SSC边界3到15bp
叶绿体蛋白编码基因变异分析
序列变异较大的 10 个基因是 ycf15、ycf1、 rpl32、matK、 clpP、ndhF、ccsA、rpsl5和accD。平均遗传距离最大的基因 是值为0.41 ;其次是值为0.28。基因位于LSC/IR边界区,其进 化速度较快。 序列变异较小的 10 个基因是 ndhB、rpl2、psbL、petG、rps7、 rpl23、psbN、psbF、psbZ和psbA。其中三个位于IR区rpl和 rps基因的平均遗传距离小于其他位于LSC或SSC区的rpl或rps 基因。
叶绿体基因组的密码子使用情况后发现共有 2,806(10.6%)个密码子编码亮氨酸,是编码率最髙的 氨基酸;而只有292(1.1%)个密码子编码半腕氨酸,是 编码率最低的氨基酸。
重复序列分析
4对同向重复序列、3对反向重复序列及7条串联重复序列。重复 序列的长度30-41bp之间。最长的两条串联重复序列位于ycf2基 因的蛋白编码区。 3对重复序列与tRNA基因有重叠,4条串联重复 序列分布于LSC的基因间隔区。
比较基因组分析
选取唇形目中牛耳草、油橄榄 、芝麻三个物种与丹参叶绿体基 因组进行比较。丹参的叶绿体基因组长度最小，比牛耳草、油 橄榄和芝麻分别小了约2.2、4.6和2.0kb。 结果发现四条叶绿体基因组的IR区序列变异小于LSC和SSC区。 此外非编码区的序列变异总体高于编码区,基因间区的变异最大， 例如ndhD-ccsA、ndhI-ndhG、psbl-trnS、 trnH-pshA等。 4个rRNA基因序列最为保守，面rpl22、ycfl、ndhF、ccsA、 rps15和matK基因的编码区序列变异最大。
主要应用的测序平台
Roche 454 GS FLX Titanium 高通量测序仪 （美国Roche公司）
AB SOLiD 3 Plus高通量测序仪（美国ABI公 司）
IIIumina Hiseq2000高通量测序仪（IIIumina 公司）
主要软件
注释： DOGMA tRNA鉴定： DOGMA and tRNAscanSE 基因命名参考： ChloroplastDB 基因图谱构建： OGDRAW 密码子和GC含量分析： MEGA5 SNPs分析： BioScope
SSR分析
检测丹参叶绿体基因组中长度不小于8bp的SSR,并与菊分支其 他29个物种进行比较。 30个叶绿体基因组中,SSR的总数在145 到217之间,在丹参叶绿 体中共发现了166个SSR位点。且占主导地位的SSR种类多为单 碱基重复。 大多数的叶绿体基因组编码区序列占总长的一半左右,但编码 区所含的SSR比例却只占总数的23%-41%。所以非编码区的SSR 要比编码区丰富且SSR在整个基因组尺度上分布是不均一的。