2.植物离体繁殖(植物组织培养)

第二章植物离体繁殖

植物离体繁殖:

利用组织培养技术对外植体进行离体培养，短期内获得遗传性一致的大量再生植株。也叫快繁或微繁。

和传统方法突出特点：

1、繁殖效率高:增值率高，生长速度快，可周年生产，在一个短暂的时间，由单一个体开始，能产生出大量的遗传组成相同的植株。（如苹果矮化砧木茎尖8个月可繁殖6万株，石刁柏一个腋芽一年可繁殖７万株）

2、培养条件可控性强：人为提供培养基及小气候，便于对环境进行控制，省去田间栽培繁杂劳动。

3、便于管理、占地面积小：30m2可存放1万多培养瓶，约10万多苗木。

4、利于种质资源的保存及交换。

快速繁殖的应用

（1）短期内获得大量形状优良、整齐一致的种苗群体。加快引进新种、新育良种的繁殖，促进优良品种推广和应用。（2）大量繁育原来常规方法不能进行无性繁殖、难繁殖和繁殖速度慢的一些植物，尤其对一些珍、稀、濒危的植物的繁殖有更重要的意义。

（3）作为培育新品种的有效手段，繁殖和保存育种材料。如远缘杂种、多倍体、突变体。

（4）通过茎尖培养等技术脱毒，扩增脱毒苗，达到提纯复壮良种的目的。

一、植物快繁的器官形成方式

由于植物种类不同，器官再生及快速繁殖的方式也不同。

1、短枝发生型：外植体为带叶单芽茎段，培养为完整植株。

特点：一次成苗，培养过程简单，容易移栽成活，遗传性状稳定。例如：葡萄、红薯等试管苗繁殖。

2、器官型：外植体带有顶芽或腋芽。培养后形成丛生芽，转入生根培养基，诱导生根成苗，扩大繁殖。

特点：由单芽到丛芽，繁殖速度快，遗传性状稳定，多数花卉、苗木的快繁属于此类。

3、器官发生型：直接由外植体上或从愈伤组织产生不定芽，经过脱分化与再分化成苗。

特点：繁殖速度快，由愈伤组织再生植株，遗传不稳定。烟草、水稻、小麦、番茄等。

4、胚胎发生型：外植体脱分化产生愈伤组织或细胞团，再分化为胚状体产生小植株（球形期、心形期、鱼雷期、子叶期）特点：发生数量大，速度快，结构完整，人工种子繁殖，遗传变异。

5、原球茎发生型：兰科。

茎尖或腋芽外植体通过形成原球茎，而发育为完整植株。

二、植物快繁的程序和关键技术

离体无性繁殖的程序包括：无菌母株的制备，继代芽的增殖，芽苗生根培养，再生植株的锻炼和移栽。

1、无菌母株的制备

初代培养：在无菌条件下，制备无菌繁殖的材料称为无菌母株，或繁殖母株。

选取遗传性状优良、稳定，生长健壮、无病虫害植株上的外植体，经适当有效灭菌处理后，接种在培养基上，诱导其产生芽（腑芽或不定芽）和愈伤组织。

注意:培养基激素配比，取材的年龄、大小和生理状态。

初代培养的启动生长方式:腋芽被刺激后生长;茎段、叶片、其它器官伤口处产生不定芽；外植体切口产生愈伤组织。此阶段一般需要4-6周。

↗愈伤组织

2、继代芽的增殖

无菌母株再次切割继代培养，芽分化增殖成丛芽，加快繁殖速度。

在快速繁殖过程中，随培养时间和继代次数增加，芽分化和生长速率降低，称为驯化现象，与内源激素和恒定培养条件有关，故可以调节激素配比或变温处理，提高繁殖速度。

3、芽苗生根培养

诱导无根苗生根的方法有两种：试管内生根和试管外生根。

1）试管内生根：将无菌小枝条转入生根培养基中进行培养。

提高生根率的措施：

①降低无机盐和有机物含量（如1/2MS或1/4MS培养基）

②适当提高生长素的浓度，降低细胞分裂素的浓度。

③降低渗透压（糖30g/L→20g/L )；

④暗培养利于生根。

2）试管外生根：有些植物可以将离体条件下形成的枝条，在基部切口处用生根粉或与滑石粉混合的IBA涂抹，然后种植到温室或田间中，这样的方法可大大降低成本。

4、再生植株的锻炼和移栽

A、移栽前后培养条件发生改变：

试管苗：恒温、高湿、弱光、无菌、充足的营养。

自然条件下：变温、低湿、强光、有菌、缺乏营养。

B、移栽后植株死亡的原因:

1）根系结构不完善：不生根（木本植物）、根与芽的输导组织不相通（愈伤组织）、再生根的吸收功能差。

2）叶部结构不完善：缺少角质层或蜡质层，保水性差；缺乏叶表皮毛，保湿、反光性差；气孔开度过大，关闭能力差；叶片中栅栏组织发育不完善，光合能力低。

C、克服这些因素的方法：

培育壮苗：培养基中加入适宜的生长延缓剂（多效唑、矮壮素、B9等）。

炼苗：

1）日光锻炼：遮阳网,逐渐恢复、提高叶片的光合作用的能力，使小苗由异养向自养过渡。

2）湿度锻炼：移栽前，开瓶练苗，使小苗逐步适应周围的湿度条件。

3）温度锻炼: 排风煽,遮阳网.

闭瓶炼苗: 要在培养瓶中培育壮苗,7-20天。

开瓶炼苗: 3-7天,时间过长会引起培养基污染。

D、移栽过程要注意的一些问题

将小苗根系周围的培养基冲洗干净，以避免有害微生物的污染。

筛选适宜的移栽基质：砂、蛭石、腐叶土和土壤配置使用也可以单独使用。以保持良好的排水性与通气性。

选择使用营养钵、苗床或塑料薄膜以及遮阳网，以调控光、温、湿度等。

当移栽后的小苗能开始生长，说明已经能够在正常的环境下生长。

三、植物快繁过程中的关键问题

一、污染：

原因：培养基及器具灭菌不彻底，操作的人为带入，环境不清洁。

控制：

二、遗传稳定性：

1、基因型：变异频率不同；

2、继代次数：随着继代次数增加，变异系数增加。

3、器官发生方式:以茎段、不定芽的方式繁殖不宜变异，而通过愈伤组织、生殖器官的培养易发生变异。

控制：减少培养基中容易诱导变异的物质、定期清除不正常的组培苗。

三、玻璃化：

玻璃化苗：是由于试管苗发生生理失调，而形成的发育不正常的组培苗。常常表现为叶片皱缩、易碎、嫩叶呈水浸透明状。移栽后常死亡。

原因：培养基中琼脂与蔗糖的浓度低、细胞分裂素与生长素比例失调、培养基中含氮量高、培养温度高、光照不足

防止措施:

1、加入琼脂提高培养基硬度、

2、提高蔗糖含量，降低培养基的渗透压、

3、减少含氮成分、降低温度或变温处理、提高光照、

4、添加抗玻璃化的化学物质：活性炭、聚乙烯醇、多效唑、青霉素等。

四、褐化

是指培养材料向培养基中释放褐色物质，使培养基和培养材料逐渐变褐而死亡的现象。

本质：酚类物质在多酚氧化酶的作用下，氧化形成褐色的醌类物质，导致植株中蛋白质变性、酶失活。影响因素：

1、植物的品种与种类、

2、外植体的生长发育时期、外植体的切口、

3、培养温度、培养时间、

4、培养基中成分：无机盐高、细胞分裂素高。

褐化的防止措施：

1、外植体的选择、

2、培养基中激素的调整、

3、培养基中添加抗氧化剂等。抗坏血酸、柠檬酸、活性炭等、

4、培养温度降低、光照减少、

5、缩短继代培养时间。

五、黄化

是指试管苗整株失绿、叶片全部或部分发生黄化现象。

原因：

1、培养基成分：含铁量少、或矿质营养不平衡、激素配比失衡、糖分不足。

2、培养条件：通气差、光温及酸碱度不适、抗生素的使用。

控制：调节培养基成分，调节温度