大肠杆菌诱变处理与营养缺陷型筛选
紫外诱变选育大肠杆菌营养缺陷型菌株的研究
物技术、微生物代谢等领域的研究中均具有重要作用，另外它还是研究基因的结构与功能的常用材料。该研
究以大肠杆菌（Escherichia coli）菌株 DH5α为实验材料，利用紫外线（UV）对其进行诱变，并且采用青霉素法浓
缩营养缺陷型细菌，采用逐个测定法检出营养缺陷型，利用生长谱法对缺陷型菌株进行鉴定、分析，得到了 4
株稳定的营养缺陷型突变株，分别为赖氨酸、组氨酸、精氨酸和嘧啶营养缺陷型菌株。
关键词：大肠杆菌；营养缺陷型；紫外诱变
中图分类号 Q311
文献标识码 A
文章编号 1007-7731（2016）15-0033-03
Study on Selection of Auxotrophic Strain of Escherichia coli by UV Mutation
安徽农学通报，Anhui Agri.Sci.Bull.2016，22（15）
33
紫外诱变选育大肠杆菌营养缺陷型菌株的研究
宁 祎 李基丽 道吉吉 王春台 刘新琼*
（中南民族大学生命科学学院，湖北武汉 430074）
摘 要：营养缺陷型是一种生化突变株，它的出现是由基因突变引起的。营养缺陷型菌株在遗传学、食品生
Ning Yi et al. （College of Life Science，South-central University For Nationalities，Wuhan 430074，China） Abstract：The auxotrophic strain，which is caused by the gene mutation，is a kind of mutant strain of biochemistry. It plays an mportant role in the study of genetics，food biotechnology，microbial metabolism，and so on，besides， the auxotrophic strain has been always used to study the structure and function of genes. The steps of screening are inducing mutation，after culturing，eliminating the wild types，detecting the deficit types and identifying the deficit types.The ultraviole（t UV）was used to mutate the strain of Escherichia coli—DH5α，and then by the use of penicil⁃ lin method，the auxotrophic bacteria were concentrated and tested respectively to find out the auxotroph.Finally，the auxotrophies were identified and analyzed by growth chart of nutritional need，and four auxotrophic strains were suc⁃ cessfully obtained. Key words：Escherichia coli；Auxotrophy；UV-induced mutation
营养缺陷型菌株的筛选步骤和方法
营养缺陷型菌株的筛选步骤和方法
嘿，你知道营养缺陷型菌株是啥不？这玩意儿在科研和生产中可有着大用处呢！那怎么筛选营养缺陷型菌株呢？首先，咱得有个出发菌株，就像要找宝藏得先有个起点一样。
然后通过诱变处理，这就好比给菌株来个大变身，让它可能产生新的特性。
接着进行淘汰野生型，把那些不需要的家伙踢出去。
再进行检出缺陷型，这就像在一堆沙子里找金子，得仔细着呢！注意啊，整个过程中可不能马虎，每一步都得精准操作。
要是弄错了，那可就白忙活啦！
说到安全性，只要操作规范，那基本没啥问题。
稳定性嘛，筛选出来的菌株如果保存得当，那还是挺稳定的。
就像你把宝贝放在一个安全的地方，它就不会轻易丢啦！
那营养缺陷型菌株有啥应用场景呢？在生物制药、食品工业等领域都能大显身手。
它的优势可不少呢！比如可以用来研究代谢途径，就像侦探破案一样，通过它能找到生命的奥秘。
还可以作为遗传标记，帮助我们更好地了解生物的遗传特性。
举个实际案例吧！有个实验室在研究某种抗生素的生产，通过筛选营养缺陷型菌株，大大提高了抗生素的产量。
哇塞，这效果简直太棒了！
所以啊，营养缺陷型菌株的筛选真的很重要。
咱可得好好利用这个强大的工具，为科研和生产做出更大的贡献。
食品营养与检测《突变与育种 诱变育种——营养缺陷型突变株的筛选》
突变与育种
诱变育种——营养缺陷型突变株的筛选
营养缺陷型的筛选方法：
第一步，诱变剂处理；
第二步，淘汰野生型，常用的有抗生素法、菌丝过滤法；
第三步，检出缺陷菌，有夹层培养法、限量补充培养法、检出法和影印接种法；
夹层培养法：先在培养皿底部倒一薄层不含菌的基本培养基，待凝，添加一层混有经诱变剂处理菌液的基本培养基，其上再浇一薄层不含菌的基本培养基，遂成“三明治”状。
经培养后，对首次出现的菌落用记号笔一一标在皿底。
然后，再向皿内倒上一薄层第四层培养基——完全培养基。
再经培养后，会长出形态较小的新菌落，它们多数都是营养缺陷型突变株。
限量补充法：把诱变处理后的细胞接种在含有微量（< 0.01%）蛋白胨的基本培养基平板上，野生型细胞就迅速长成较大的菌落，而营养缺陷型则因营养受限制故生长缓慢，只形成微小菌落。
逐个检出法：把经诱变处理的细胞群涂布在完全培养基的琼脂平板上，待长成单个菌落后，用接种针或灭过菌的牙签把这些单个菌落逐个整齐地分别接种到基本培养基平板和另一完全培养基平板上，使两个平板上的菌落位置严格对应。
经培养后，如果在完全培养基平板的某一部位上长出菌落，而在基本培养基的相应位置上却不长，说明此乃营养缺陷型。
影印平板法：将诱变剂处理后的细胞群涂布在一完全培养基平板上，经培养长出许多菌落。
用特殊工具——“印章”把此平板上的全部菌落转印到另一基本培养基平板上。
经培养
后，比较前后两个平板上长出的菌落。
如果发现在前一培养基平板上的某一部位长有菌落，而在后一平板上的相应部位却呈空白，说明这就是一个营养缺陷型突变株。
大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选
大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选生命科学学院09级生物技术1班余振洋200900140156指导老师：林建群同组者：潘红芳摘要营养缺陷型菌株是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段，在发酵工业上有广泛用途。
本实验以大肠杆菌原养型菌株为材料，计划通过诱变得到并筛选出营养缺陷型，从而了解细菌营养缺陷性的获得步骤并掌握氨基酸营养缺陷型的筛选方法和鉴别过程。
关键词营养缺陷，诱变，生长谱测定，大肠杆菌（E.coli）1．引言1.1 营养缺陷型营养缺陷型是指缺乏合成某种对自身生长繁殖所必须的营养物质（氨基酸、维生素、碱基等）的能力的突变型，只能从周围环境或培养基中获得这些物质或其前体物才能正常生长。
由于营养缺陷型不能合成某种末端产物，解除了合成代谢的反馈抑制作用，限量添加所需生长因子克服生长障碍后，可选择性大量合成积累所需的中间代谢产物。
因此，营养缺陷型在工业上有重要的应用价值。
营养缺陷型是由野生型突变产生，营养缺陷型经回复突变恢复野生表型得原养型。
1.2 紫外线诱变紫外线是一种短波光，波长介于100-400nm之间。
紫外线是一种非电离辐射诱变剂，照射物体时可使原子的内层电子能级提高，但不能使原子失去电子。
紫外线是微生物育种中最常用的诱变剂之一。
由于碱基间电子的相互作用，DNA分子在260nm处有最大的紫外吸收峰，因此决定了紫外线诱导细胞发生突变的有效波长为260nm。
15W紫外灯产生的紫外线中，80%集中在260nm左右，诱变效应良好。
低剂量紫外线可诱变获得较多的正突变，高剂量紫外线则易产生大量负突变，但可获得特性明显改变的突变菌株。
紫外线诱发突变的原理是使DNA同一链上的两相邻胸腺嘧啶之间发生交联，形成胸腺嘧啶二聚体。
在DNA复制时，相应核苷酸无法与胸腺嘧啶二聚体配对形成碱基对，DNA复制中断，引起突变。
当细胞中的DNA分子含有大量胸腺嘧啶二聚体时，SOS修复机制被激活，DNA被修复，但包含大量错配的碱基对，从而导致基因突变。
营养缺陷型突变株的筛选
营养缺陷型突变株的筛选一、与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体①营养缺陷型：原菌株由于发生基因突变,致使合成途径中某一步骤发生缺陷，失了合成某种代谢产物的能力，必须在培养基中外源补加该物质才能生长，这类突变菌株，叫营养缺陷型突变株，简称营养缺陷型。
②野生型：变异前的原始菌株。
③原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产性的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同，表示方法亦同野生型。
二、与筛选营养缺陷型有关的三类培养基①基本培养基：能满足某一菌种的野生型或原养型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。
②补充培养基：在基本培养基中有针对性地补加某一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长需要(其他营养缺陷型仍不能生长)的培养基。
③完全培养基：可满足该菌种各种营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基。
三、筛选营养缺陷型菌株的一般步骤和方法①诱变：变常用紫外线诱变形成大量营养缺陷型菌株。
②淘汰野生型a)抗生素法某些抗生素能杀死生长繁殖着的微生物，而对处于休止状态的微生物无杀伤作用。
如青霉素能抑制细菌细胞壁肽聚糖的生物合成。
b)菌丝过滤法适用于放线菌、霉菌等丝状微生物。
在基本培养基中野生型孢子能萌发长成菌丝体，而营养缺陷型孢子则不生长。
将经诱变处理的孢子接种于液态基本培养基中，振荡培养10h-12h, 使原养型萌发(以肉眼刚能看见菌丝为度)，然后以滤纸、棉花或玻璃过滤漏斗过滤，菌丝被滤除,未萌发的缺陷型孢子能顺利通过,从而达到富集营养缺陷型的目的。
③检出缺陷型的常用方法a)逐个测定法(点种法)：把经诱变处理并淘汰野生型后的菌液在完全培养基上涂布分离,将培养后长出的每一个菌落分别点种在基本培养基和另一个完全培养基上,凡在基本培养基上不能生长而在完全培养基的相应位置上能生长的菌落，表明其为营养缺陷型。
b)夹层培养法：经诱变处理后的菌液，稀释后与基本培养基混匀并倾入平板中，待凝固后，再加上一层不含菌的基本培养基。
N +离子注入诱变筛选胸腺嘧啶缺陷型大肠杆菌
中 图 分 类 号 ： ３ Ｑ ９ Ｑ ９３ ６１
文献标识码 ： Ａ
文 章编 号 ： ６ ２ ５ ２ （ ０ １ ０ —０ ４ —０ １ ７ — ４ ５ ２ １） ４ ０ ９ ４
营 养 缺 陷 型 菌 株 在 工 业 微 生 物 的 设 计 育 种 、 传 遗 学 及 医 学 等 领 域 有 着 重 要 作 用 ｌ 。不 同 的 研 究 及 实 际 １ ］
１ ２ 试 剂 与 仪 器 ．
ＤＮＡ 聚 合 酶 、 ＮＴＰ、 制 性 内切 酶 、 ｄ 限 Ｔ４连 接 酶 ，
重 组 子 ， 测 定 其 ＴＳ基 因 序 列 ， 正 常 大 肠 杆 菌 的 并 与
ＴＳ基 因进 行 对 比 ， 鉴 定 突 变 株 ＴＳ基 因 是 否 发 生 突 以
亿 与 生 物 Ｚ 程 ２１， １ ８ ｏ４ ０１ ｏ ２ Ｎ ． Ｖ ．
Ｃｈ ｍ ｉｔｙ ＆ Ｂｉ ｅ ｇｉｅ ｒ ｇ ｅ ｓｒ ｏ ｎ ｎ ｅｉ ｎ
ｄ ｉ１ ． ９ ９ ｊ ｉｓ ． ６ ２ ５ ２ ． ０ １ ０ ． １ ｏ ： ０ ３ ６ ／．ｓ ｎ １ ７ ～ ４ ５ ２ １ ． ４ ０ ４
—Ｃ 其 相 应 的氨 基 酸 由谷 氨 酸 （ ５ ） 变 为 丙 氨 酸 （ ８ 。该 突 变株 的 获 得 为 后 续研 究嘧 啶 核 苷 酸 的 代 谢 奠 定 了基 Ｇ， Ｅ ８突 Ａ５ ）
础 。
关键 词 ： 能 Ｎ 离子 注 入 ； 氧 苄 啶 ； 苷 酸 合 成 酶 低 甲 胸
ｐ ）１ Ｔ 载 体 ， ＭＩ ８ － ＴＡＫＡＲ 生 物 技 术 公 司 ； Ａ Ｅ．
ｃ ｌ ｏ ｉＢＬ２１ ＤＥ３）， ｖ ｇｅ （ Ｎｏ ａ ｎ。
离 子束 注入技 术是 ２ 世 纪 ８ Ｏ Ｏ年代 中期 研究 出来 的一种诱 变 技 术 。与 其 它 诱 变 源 相 比， ］ 离子 束 注 入 诱 变可 以在 轻度 损伤 的情 况下 ， 获得 更 高 的突变 率 （ 较 其 它诱 变高 出 １ ～２个 数量 级 ） 更 广 的 突变 谱 ， 和 因此 被 广泛运 用 于各种 生 物细胞 诱 变选 育 的研究 。 大肠 杆 菌 （ ｓｈ ｒｃ ｉ ｃ ｌ） Ｅ ｃ ｅｉｈａ ｏｉ 的胸 苷 酸 （ Ｔ ｄ ＭＰ 代 ）
简述营养缺陷型菌株的筛选方法
简述营养缺陷型菌株的筛选方法营养缺陷型菌株是指在一定条件下，无法自主合成某些生物活性物质而需要外源性提供的菌株。
这类菌株在微生物研究和应用中具有重要意义。
本文将介绍几种常用的营养缺陷型菌株的筛选方法。
1. 选择基质筛选法选择基质筛选法是一种简单直接的筛选方法。
首先，根据所需筛选菌株的营养缺陷特点，选择一种含有该营养物质的基质。
然后，将待筛选的菌株接种于这种基质上进行培养。
如果菌株能够生长、繁殖，说明其具有该营养物质的合成能力；如果菌株无法生长、繁殖，说明其存在该营养物质的缺陷。
通过这种方法可以初步筛选出营养缺陷型菌株。
2. 诱变筛选法诱变筛选法是通过诱变剂对菌株进行处理，使其发生突变，进而筛选出营养缺陷型菌株。
常用的诱变剂有化学物质和物理因素。
化学物质如亚硝酸钠、硝酸钠等，物理因素如紫外线、γ射线等，这些诱变剂能够引起菌株的DNA发生突变。
在诱变后，将菌株接种到无法自主合成某种生物活性物质的培养基上，观察其生长情况。
如果菌株能够生长、繁殖，说明其突变后具有该物质的合成能力丧失，从而可以筛选出营养缺陷型菌株。
3. 基因敲除筛选法基因敲除筛选法是通过遗传工程手段将特定基因从菌株中删除，以筛选出营养缺陷型菌株。
首先，通过PCR扩增的方法获得待敲除基因的DNA片段，并引入到质粒载体中。
然后，将质粒载体导入到目标菌株中，经过转化或转染等方式使其取得该质粒。
接下来，通过选择性培养基筛选，以抗生素等为筛选标记，筛选出已经发生基因敲除的菌株。
最后，通过基因测序等方法验证所得菌株中目标基因已经被成功敲除，从而得到营养缺陷型菌株。
4. 遗传重组筛选法遗传重组筛选法是通过基因重组技术将特定基因导入到菌株中，使其能够合成原本无法自主合成的物质。
首先，将目标基因与适当的表达载体连接，并经过酶切、连接等操作获得重组质粒。
然后，将重组质粒导入到宿主菌株中，使其取得重组质粒。
最后，通过选择性培养基等筛选方法，筛选出成功获得目标基因的菌株。
营养缺陷型菌株筛选
营养缺陷型菌株的筛选采用辐射，化学试剂等因素处理细菌，以提高其变异几率，关键步骤是进行营养缺陷型微生物的筛选工作，营养缺陷型是指通过诱变产生的，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变株。
营养缺陷型的筛选与鉴定涉及下列几种培养基：基本培养基（MM，符号为[-]）是指仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的合成培养基。
完全培养基(CM，符号为[+])是指可满足某种微生物的一切营养缺陷型菌株的营养需要的天然或半合成培养基。
补充培养基（SM，符号为[A]或[B]等）是指在基本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的合成或半合成培养基。
营养缺陷型菌株不仅在生产中可直接作发酵生产核苷酸、氨基酸等中间产物的生产菌，而且在科学实验中也是研究代谢途径的好材料和研究杂交、转化、转导、原生质融合等遗传规律必不可少的遗传标记菌种。
营养缺陷型的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个环节。
现分述如下：第一步，诱变剂处理：与上述一般诱变处理相同。
第二步，淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般较低。
通过以下的抗生素法或菌丝过滤法就可淘汰为数众多的野生型菌株即浓缩了营养缺陷型。
抗生素法有青霉素法和制霉菌素法等数种。
青霉素法适用于细菌，青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，杀死正在繁殖的野生型细菌，但无法杀死正处于休止状态的营养缺陷型细菌。
制霉菌素法则适合于真菌，制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起膜的损伤，也是只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌。
在基本培养基中加入抗生素，野生型生长被杀死，营养缺陷型不能在基本培养基中生长而被保留下来。
菌丝过滤法适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。
其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。
通过过滤就可除去大部分野生型，保留下营养缺陷型。
第三步，检出缺陷型：具体方法很多。
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大肠杆菌诱变处理与营养缺陷型筛选【实验目的】
1.了解应用物理、化学因素对细菌进行诱变的方法。
2.初步掌握诱变产生营养缺陷型菌株的筛选与鉴定的技术。
【实验原理】
在以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理细菌，可诱发基因突变。
如果突变后丧失合成某一物质(如氨基酸、维生素、核苷酸等)的能力，不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长，称为营养缺陷型。
实验室获得营养缺陷型菌株通过经过以下几个步骤：诱变处理、突变型筛选、缺陷型检出，缺陷型鉴定。
诱变处理首先要选择诱变剂，诱变剂可分为物理和化学两类。
微生物诱变中最常用的物理诱变剂是紫外线。
进行诱变处理时为了避免出现不纯的菌落，一般要求微生物呈单核的单细胞或单孢子的悬浮液，分布均匀。
试验表明处于对数生长期的细菌对诱变剂的反应最灵敏。
诱变处理必须选择合适的剂量，不同微生物的最适处理剂量不同，须经预备实验确定。
物理诱变的相对剂量与三个因素有关：诱变源和处理微生物的距离、诱变源(紫外灯)功率、处理时间，往往通过处理时间控制诱变剂量。
化学诱变剂的剂量也常以相对剂量表示。
相对剂量与三个因素有关：诱变剂浓度、处理温度和处理时间。
一般通过处理时间来控制剂量，在处理前对诱变剂和菌液分别预热，当二者混合后即可计算处理时间，可精确控制处理剂量。
经处理以后的细菌，缺陷型所占的比例还是相当小，必须设法淘汰野生型细胞，提高营
养缺陷型细胞所占比例，浓缩缺陷型细胞。
浓缩缺陷型的方法有青霉素法、菌丝过滤法、差别杀菌法、饥饿法等，这些方法适用于不同的微生物。
细菌中常用的浓缩法是青霉素法，青霉素是杀菌剂，只杀死生长细胞，对不生长的细胞没有致死作用。
所以在含有青霉素的基本培养基中野生型能长而被杀死，缺陷型不能生长，可被保存得以浓缩。
检出缺陷型的方法有逐个测定法、夹层培养法、限量补给法、影印培养法。
这里主要以逐个测定法为例进行说明：把经过浓缩的缺陷型菌液接种在完全培养基上，待长出菌落后将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养基上。
凡是在基本培养基上不能生长而在完全培养基上能长的菌落就是营养缺陷型。
经初步确定为营养缺陷型的菌株用生长谱法鉴定。
在同一培养皿上测定一个缺陷型对多种化合物的需要情况。
【器材与试剂】
一、器材
离心机，紫外线照射箱，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；三角烧瓶，试管，离心管，移液管，培养皿，接种针等。
二、试剂
肉汤液体培养基，ZE肉汤液体培养基，基本固体培养基，基本液体培养基，无N基本液体培养，2N基本液体培养基(成分及配制方法见后)。
20种基本氨基酸，7种微生素(硫胺素，核黄素，吡哆醇，泛酸，对氨基苯甲酸，烟碱酸，生物素)，嘌呤，嘧啶；亚硝酸钠，青霉素钠盐，冰乙酸，乙酸钠，氢氧化钠，硫酸镁，蔗糖；生理盐水，0.1mol/L醋酸缓冲液(pH=4.0)，0.1mol/L NaOH。
混合氨基酸(包括核苷酸)共分7组：其中第Ⅰ到第VI组各有6种氨基酸(包括核苷酸)，每种氨基酸(包括核苷酸)等量研细充分混合；第VII组为脯氨酸，因容易潮解，故单独组成。
各组具体组成如下：
I. 赖氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、嘌吟
II. 组氨酸、精氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸(或甘氨酸)、嘧啶
III. 丙氨酸、甲硫氨酸，苏氨酸、羟脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸
IV. 亮氨酸、半胱氨酸，谷氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、缬氨酸
V. 苯丙氨酸、胱氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、酪氨酸
VI. 色氨酸、嘌呤、嘧啶、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸
VII. 脯氨酸
混合维生素：把硫胺素、核黄素、吡哆醇、泛酸、对氨基苯甲酸、烟碱酸及生物素等量研细，充分混合即可。
【实验步骤】
一、菌液制备
1.菌体的活化与培养
实验前14～16h，挑取少量K12SF+菌，接种于盛有5ml肉汤培养液的三角瓶中，37℃培养过夜。
第二天添加5ml新鲜的肉汤培养液，充分混匀后，分装成2只三角瓶，继续培养5h。
2 收集菌体
将两只三角瓶的菌液分别倒入离心管中，3500rpm离心10min，弃去上清液，打匀沉淀，
其中一管吸入5ml生理盐水，然后倒入另一离心管，二管并成一管。
二、诱变处理
1.紫外线诱变法
(1)处理前先开紫外灯(15W)稳定30min。
(2)吸取菌液3ml于培养皿内，置于紫外灯下，距灯管28.5cm处；先连盖在紫外灯下灭菌1min，然后开盖处理1min(处理时间依70% 的杀菌率而定)；照射后先盖上皿盖，再关紫外灯。
(3)吸取3ml加倍肉汤培养液，注入处理后的培养皿中，37℃恒温箱内避光培养12h以上。
2.亚硝酸诱变法
(1)吸取菌液1ml于离心管中，冰冻1h，制成静止细胞。
(2)加入5ml 醋酸缓冲液(pH=4.0)，再加入13.8mg亚硝酸钠，于37℃下诱变处理5～8min。
(3)加入0.1mol/L NaOH中和至pH=7.0，中止亚硝酸作用。
三、突变型的筛选与检出
1.青霉素法淘汰野生型
(1)吸取5ml处理菌液于灭菌离心管中，3500rpm离心10min。
(2)弃上清液，加入生理盐水，打匀沉淀，离心洗涤三次，加生理盐水至原体积。
(3)吸取菌液0.1ml于5ml无N基本培养液中，37℃培养12h。
(4)加入等体积2N基本培养液，加入青霉素钠盐使最终浓度约为1,000单位/ml，
置37℃恒温箱中培养。
(5)培养12、16、22h时各别取菌液0.1ml，倒入两个灭菌的培养皿中，再分别倒入经融化并冷却至40℃～50℃的基本及完全培养基中，摇匀放平，待凝固后，置37℃恒温箱中培养(在培养皿上注明取样时间)。
2.逐个测定法检出营养缺陷型
(1)以上平板培养36～48h后，进行菌落计数。
选用完全培养基上长出的菌落数大大超过基本培养基的那一组，用接种针挑取完全培养基上长出的菌落80个，分别点种于基本培养基与完全培养基平板上，先点种基本培养基，后点种完全培养基，置于37℃恒温箱中培养。
(2)培养12h后，选在基本培养基上不生长，而在完全培养基上生长的菌落，再在基本培养基的平板上划线，置于37℃恒温箱培养。
24h后不生长的可能是营养缺陷型。
四、生长谱鉴定
1.突变菌株的培养与收集
(1)将可能是缺陷型的菌落接种于盛有5ml肉汤培养液的离心管中，37℃培养14-16h。
(2)培养后，3500rpm离心10min，倒去上清液，加生理盐水，打匀沉淀，然后离心洗涤3次，最后加生理盐水到原体积。
2.营养缺陷型的鉴定
(1)吸取经离心洗涤的菌液1ml注入一灭菌的培养皿中，然后倒入融化冷却至40℃～50℃的基本培养基中，摇匀放平，待凝固，共做两只培养皿。
(2)将2只培养皿底等分8格并标记(如右图)，依次放入混合氨基酸(包括核苷酸)、混合维生素和脯氨酸(加量要很少，否则会抑制菌的生长)，然后置于37℃恒温箱培养24～
48h，观察生长圈，当某一格内出现圆形混浊的生长圈时，即说明是某一氨基酸、维生素或核苷酸的缺陷型。
注意事项
皮肤曝露在紫外线下可致皮肤癌；眼睛最易受到紫外线损伤，导致短期甚至永久失明。
因此，操作时要有相应的防护措施。
亚硝酸也是较强致癌物质，请注意安全与环境保护。
各种器具、培养基及直接加入培养基中的试剂均需灭菌。