生化药物制造工艺核酸类药物PPT课件
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① 有关疾病的靶基因mRNA序列是已知的，因 此，设计合理特异性的反义核酸比较容易；
② 反义寡核苷酸与靶基因能通过碱基配对原理 发生特异和有效的结合从而调节基因的表达。
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它的缺点是天然的寡核苷酸难以进入细胞内、而 一旦进入又易被胞内核酸酶水解，很难直接用于治疗。
核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因 （DNA或RNA）直接导入动物细胞内，并通过宿主细 胞的转录系统合成抗原蛋白质，诱导宿主产生对该抗 原蛋白质的免疫应答以达到防病治病的目的。
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随着分子生物学和遗传工程的发展，基因治疗应 运而生，得到广泛的肯定。其中包括反义核酸技术， 简称反义技术。利用这一技术研制的药物称为反义药 物，根据核酸杂交原理，反义药物能与特定基因杂交， 在基因水平பைடு நூலகம்扰致病蛋白的产生过程，及干扰遗传信 息从核酸向蛋白质的传递。
反义核酸作为药物与常规药物相比有两个显著特 点：
经临床使用，对非特异性血小板减少症、对白血 球减少症、癌肿的化疗和放疗后的升白血球均有较好 疗效。
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2、DNA的提取与制备
（1）工业用DNA的提取
取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状， 加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌， 升温至100℃，保温15分钟，迅速冷却至20～25℃， 离心除去鱼精蛋白等沉淀物，获得35L含热变性DNA 的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解 生产脱氧核苷酸。
桔青霉产生5`-磷酸二脂酶 红酵母产生3`-磷酸二脂酶
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（2）酶解法制备戊糖核苷酸
我国从60年代开始使用核酸酶P1降解核糖核酸生 产单核苷酸，日本年产呈味核苷酸（肌苷酸和鸟苷酸） 3000吨，其中60%是使用酶解法生产的。
酶解法生产5‘－单核苷酸工艺流程
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（1）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程：
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（5）碱水解法生产2＇，3＇-混合核苷酸
RNA结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定， 很容易生成2′，3-环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更 不稳定，很易加水分解生成2‘，3’-混合核苷酸。
从RNA水解成2′，3‘-核苷酸的降解率达95％以上， 将2′，3’-混合核苷酸制成每片含50～100mg的片剂。
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（3）双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（I＋G）
呈味核苷酸的主要品种是肌苷酸钠和鸟苷酸钠， 商品名简称为（I＋G），用核酸酶Pl降解RNA可获得 GMP和AMP，其中AMP经脱氨生成IMP。双酶法生 产（I十G）工艺 。
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（4）菌体自溶法生产核苷酸
磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA可 产生5′-核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法生产 5‘-核苷酸。
通常在细菌中RNA占5％～25％，在酵母中占2.7 ％～15％，在霉菌中占0.7%～28％。
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在菌体内RNA含量的变化受培养基组成影响，其 中关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收 率高，易于提取RNA。
很显然在许多酵母中，早期细胞中的RNA含量高， 其确切数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。
② 高RNA含量酵母菌株的筛选 可以从自然界筛选 到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱变育种的方法提 高酵母菌的RNA含量。
③ 工业废水培养高含量RNA酵母
RNA的提取的方法：
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稀碱法：是用氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变 性，使核酸从细胞内释放出来。需用酸中和pH7。然 后除去菌体，将pH调至RNA的等电点（pH2.5），使 RNA沉淀出来。
如要制成固体状DNA，在热变性DNA溶液中逐渐 加入等体积95％乙醇，离心可获得纤维状DNA，沉淀 用乙醇、丙酮洗涤，减压低温干燥得DNA粗品，产品 含热变性DNA 50％～60％。
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2、具有生物活性DNA的制备
动物内脏（肝、脾、胸腺）加4倍重量生理盐水经 组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500r／pm离心30分钟。 将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中，加入2倍量5 ％的（用45%乙醇作溶剂）十二烷基磺酸钠，并搅拌 2～3小时，在0℃2500r／pm离心，在上层液中加入等 体积的冷95％乙醇，离心即可得到纤维状DNA，再用 冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得粗品DNA。
此法的缺点是制得的RNA Mr较低,(磷酸单脂酶、 磷酸二脂酶降解RNA，90 ℃保持3~4h破坏酶)。
浓盐法：是用高浓度盐溶液（6%~8%）处理，同 时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释 放出来。
要避免分子降解，可采用苯酚法制备RNA。用苯 酚处理生物材料，使蛋白质变性，然后离心，上层水 溶液内含有全部RNA，可用乙醇沉淀出来。
粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5％十二烷基磺酸 钠达1／10体积，搅拌1小时，经5000r／pm离心1小时， 清液中加入NaCl达1mol／L，再缓慢加入冷95%乙醇， DNA析出，经乙醇、丙酮洗涤，真空干燥得具有生物 活性的DNA。
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（二）用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸 1、酶解法及碱水解法制备核苷酸 （1）酶解法制备脱氧核苷酸
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脱 氧 核 糖 核 蛋 白 溶 于 浓 盐 溶 液 1mol/L, 不 溶 于 0.14mol/L,而核糖核蛋白溶于0.14mol/L盐溶液。
④ RNA的提取实例：啤酒酵母是提取RNA的很好 的资源。取100g压榨啤酒酵母（含水份70%），加入 230ml含NaOH 3g的水，20℃以下缓慢搅拌30分钟。 用6mol／L HCl调至pH7，搅拌15分钟，离心得清液 255m1。冷至10℃以下，6mol／L HCl调pH2.5，置 冷过夜，离心得RNA l.8g（纯度80％）。
核酸疫苗又称基因疫苗或基因免疫。
DNA疫苗为目前尚无满意疗法的某些疾病（如慢 性病毒性肝炎、疟疾、艾滋病）提供一种新的治疗途 径。
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二、核酸类物质的分离提取及其发酵生产
（一）RNA与DNA的提取与制备
1、 RNA的提取与制备
（l）工业用RNA的提取
① RNA及其工业来源 从微生物中提取RNA是工 业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰 富的核酸资源，如酵母、白地霉、多种抗菌素的菌丝 体。
② 反义寡核苷酸与靶基因能通过碱基配对原理 发生特异和有效的结合从而调节基因的表达。
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它的缺点是天然的寡核苷酸难以进入细胞内、而 一旦进入又易被胞内核酸酶水解，很难直接用于治疗。
核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因 （DNA或RNA）直接导入动物细胞内，并通过宿主细 胞的转录系统合成抗原蛋白质，诱导宿主产生对该抗 原蛋白质的免疫应答以达到防病治病的目的。
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随着分子生物学和遗传工程的发展，基因治疗应 运而生，得到广泛的肯定。其中包括反义核酸技术， 简称反义技术。利用这一技术研制的药物称为反义药 物，根据核酸杂交原理，反义药物能与特定基因杂交， 在基因水平பைடு நூலகம்扰致病蛋白的产生过程，及干扰遗传信 息从核酸向蛋白质的传递。
反义核酸作为药物与常规药物相比有两个显著特 点：
经临床使用，对非特异性血小板减少症、对白血 球减少症、癌肿的化疗和放疗后的升白血球均有较好 疗效。
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2、DNA的提取与制备
（1）工业用DNA的提取
取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状， 加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌， 升温至100℃，保温15分钟，迅速冷却至20～25℃， 离心除去鱼精蛋白等沉淀物，获得35L含热变性DNA 的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解 生产脱氧核苷酸。
桔青霉产生5`-磷酸二脂酶 红酵母产生3`-磷酸二脂酶
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（2）酶解法制备戊糖核苷酸
我国从60年代开始使用核酸酶P1降解核糖核酸生 产单核苷酸，日本年产呈味核苷酸（肌苷酸和鸟苷酸） 3000吨，其中60%是使用酶解法生产的。
酶解法生产5‘－单核苷酸工艺流程
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（1）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程：
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（5）碱水解法生产2＇，3＇-混合核苷酸
RNA结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定， 很容易生成2′，3-环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更 不稳定，很易加水分解生成2‘，3’-混合核苷酸。
从RNA水解成2′，3‘-核苷酸的降解率达95％以上， 将2′，3’-混合核苷酸制成每片含50～100mg的片剂。
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（3）双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（I＋G）
呈味核苷酸的主要品种是肌苷酸钠和鸟苷酸钠， 商品名简称为（I＋G），用核酸酶Pl降解RNA可获得 GMP和AMP，其中AMP经脱氨生成IMP。双酶法生 产（I十G）工艺 。
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（4）菌体自溶法生产核苷酸
磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA可 产生5′-核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法生产 5‘-核苷酸。
通常在细菌中RNA占5％～25％，在酵母中占2.7 ％～15％，在霉菌中占0.7%～28％。
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在菌体内RNA含量的变化受培养基组成影响，其 中关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收 率高，易于提取RNA。
很显然在许多酵母中，早期细胞中的RNA含量高， 其确切数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。
② 高RNA含量酵母菌株的筛选 可以从自然界筛选 到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱变育种的方法提 高酵母菌的RNA含量。
③ 工业废水培养高含量RNA酵母
RNA的提取的方法：
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稀碱法：是用氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变 性，使核酸从细胞内释放出来。需用酸中和pH7。然 后除去菌体，将pH调至RNA的等电点（pH2.5），使 RNA沉淀出来。
如要制成固体状DNA，在热变性DNA溶液中逐渐 加入等体积95％乙醇，离心可获得纤维状DNA，沉淀 用乙醇、丙酮洗涤，减压低温干燥得DNA粗品，产品 含热变性DNA 50％～60％。
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2、具有生物活性DNA的制备
动物内脏（肝、脾、胸腺）加4倍重量生理盐水经 组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500r／pm离心30分钟。 将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中，加入2倍量5 ％的（用45%乙醇作溶剂）十二烷基磺酸钠，并搅拌 2～3小时，在0℃2500r／pm离心，在上层液中加入等 体积的冷95％乙醇，离心即可得到纤维状DNA，再用 冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得粗品DNA。
此法的缺点是制得的RNA Mr较低,(磷酸单脂酶、 磷酸二脂酶降解RNA，90 ℃保持3~4h破坏酶)。
浓盐法：是用高浓度盐溶液（6%~8%）处理，同 时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释 放出来。
要避免分子降解，可采用苯酚法制备RNA。用苯 酚处理生物材料，使蛋白质变性，然后离心，上层水 溶液内含有全部RNA，可用乙醇沉淀出来。
粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5％十二烷基磺酸 钠达1／10体积，搅拌1小时，经5000r／pm离心1小时， 清液中加入NaCl达1mol／L，再缓慢加入冷95%乙醇， DNA析出，经乙醇、丙酮洗涤，真空干燥得具有生物 活性的DNA。
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（二）用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸 1、酶解法及碱水解法制备核苷酸 （1）酶解法制备脱氧核苷酸
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脱 氧 核 糖 核 蛋 白 溶 于 浓 盐 溶 液 1mol/L, 不 溶 于 0.14mol/L,而核糖核蛋白溶于0.14mol/L盐溶液。
④ RNA的提取实例：啤酒酵母是提取RNA的很好 的资源。取100g压榨啤酒酵母（含水份70%），加入 230ml含NaOH 3g的水，20℃以下缓慢搅拌30分钟。 用6mol／L HCl调至pH7，搅拌15分钟，离心得清液 255m1。冷至10℃以下，6mol／L HCl调pH2.5，置 冷过夜，离心得RNA l.8g（纯度80％）。
核酸疫苗又称基因疫苗或基因免疫。
DNA疫苗为目前尚无满意疗法的某些疾病（如慢 性病毒性肝炎、疟疾、艾滋病）提供一种新的治疗途 径。
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二、核酸类物质的分离提取及其发酵生产
（一）RNA与DNA的提取与制备
1、 RNA的提取与制备
（l）工业用RNA的提取
① RNA及其工业来源 从微生物中提取RNA是工 业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰 富的核酸资源，如酵母、白地霉、多种抗菌素的菌丝 体。