哈茨木霉发酵产木霉素的培养条件优化

收稿日期:2009204205基金项目:浙江省自然科学基金项目(Y 3080238);浙江省重大科技项目(2006C12032)作者简介:申屠旭萍(1974-),女,硕士,讲师,E 2mail :stxp @ ;3通讯作者,博导。

哈茨木霉发酵产木霉素的培养条件优化申屠旭萍,石一,俞晓平3(中国计量学院生命科学学院,杭州310018)摘要:采用快速有效的数学统计方法对一株枸骨内生真菌哈茨木霉生产木霉素的培养条件进行了优化。

首先利用Plackett 2Burrman 设计在影响木霉素产量的6个因素中筛选出主效因素:葡萄糖浓度、发酵时间、接种量。

在此基础上,再利用响应面分析法对以上三个显著因子的最佳水平范围进行研究,建立并分析了各因子与木霉素产量关系的回归模型。

通过模型确定出最佳的试验条件:葡萄糖浓度4218g/L ,接种量1139ml 和发酵时间102188h ,该条件下木霉素的产量可达147144mg/L 。

经五批培养验证,预测值与验证试验平均值接近。

关　键　词:木霉素;哈茨木霉;优化;Plackett 2Burman 设计;响应面分析法中图分类号:S4821292;T Q92016文献标识码:A 文章编号:100529261(2009)0420348207Optimization of Conditions for Production of T richoderminby Trichoderma harzianumSHE NT U Xu 2ping ,SHI Y i 2jun ,Y U X iao 2ping 3(C ollege of Life Sciences ,China Jiliang University ,Hangzhou 310018,China )Abstract :Factorial design and response surface techniques were used to design and optimize the process to increase the yield of trichodermin produced by the Trichoderma har zianum ,an endophytic fungus is o 2lated from Llex cornuta.Initially ,Plackett 2Burman design was undertaken to evaluate the effects of the six factors and three statistically significant parameters including glucose ,fermentation time and inoculum size were selected.In the second phase of the optimization process ,a response surface methodology was used to optimize the above critical factors ,and to find out the optimal concentration levels and the rela 2tionships between these factors.By s olving the m odel ,the optimal batch fermentation conditions were de 2termined.Under conditions of glucose ,4218g/L ;inoculum size ,1139ml ;fermentation time ,102188h ,the yield of trichodermin reached 147144mg in 1L fermentation liquor.A fter five batches cultivation ,the predicted values were verified by validation experiments.K ey w ords :trichodermin ;Trichoderma har zianum ;optimization ;Plackett 2Burman design ;responsesurface methodology84325(4)348-354 中国生物防治　Chinese Journal of Biological C ontrol 2009年11月　第4期 申屠旭萍等:哈茨木霉发酵产木霉素的培养条件优化 木霉素(trichodermin)为单端孢霉烯类化合物的一种,因其对植物病原真菌有一定的抑制作用,在防治农作物病害中具有广阔的应用前景。

同时木霉素可抑制真核生物细胞(如人体宫颈癌传代细胞、兔子红血球细胞)内核糖体中肽键的形成,是一种蛋白质合成抑制剂。

国外在20世纪70年代就开始关注木霉素在医学方面的应用[1,2]。

木霉素还可以作为化学合成的前体物质[3]。

国外有文献报道从绿色木霉(Trichoderma viride)、木素木霉(T.lignorum)、肉座菌(Hypocrea austograndis)和树束梗孢菌(Dendrostilbella sp.)等多种真菌代谢产物中分离到木霉素[4～6]。

本研究组从浙江临安天目山采集的枸骨中分离筛选到一株活性内生真菌,经中国科学院微生物研究所鉴定为哈茨木霉(Trichoderma har zianum Rifai)。

通过对该内生真菌代谢产物的提取分离和结构鉴定研究,明确了主要抑菌活性成分为木霉素,并借助气相色谱仪建立了木霉素的检测方法[7,8],这是国内首次有关木霉素的文献报道。

但由于木霉素发酵单位很低,规模制备存在难度,无法满足多方面的需要。

因此,有必要对哈茨木霉的发酵条件进行优化,以提高木霉素的产量。

Plackett2Burman设计是一种两水平的试验设计方法,适用于从众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素,供进一步研究使用[9]。

响应面分析法(Response Surface Method2 ology,RS M)[10]是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法[8],这种方法已广泛地应用于微生物发酵条件的优化工作中[11～16]。

本研究拟在前期工作的基础上,先用Plackett2Burman试验设计筛选出影响哈茨木霉产木霉素的主要因素,然后利用Box2Behnken试验设计及响应面分析法对此进行优化。

1　材料与方法111　供试菌株哈茨木霉菌株由中国计量学院生物安全与食品科学研究所分离筛选得到,已在中国微生物菌种保藏管理委员会(CG MCC)保藏,保藏号为:CG MCC N o.1780。

112　培养基固体培养基(g/L):马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、pH自然;发酵培养基(g/L):蛋白胨50g、牛肉浸膏10g、NH4Cl011g、MnCl2015g、葡萄糖30g。

113　培养方法采用摇瓶培养,250ml三角瓶中装量30ml液体发酵培养基,121℃高温灭菌20min,冷却至室温。

接入哈茨木霉孢子悬液1ml(1×107个/ml),28℃、180r/min条件下摇床培养。

114　分析方法将发酵液5000r/min离心15min,取上清液,经乙酸乙酯萃取,取上层,微膜过滤(0145μm)。

采用气相色谱法检测木霉素的含量。

条件为:色谱柱HP25弹性石英毛细管柱(以5%苯基甲基硅氧烷为固定液,30m×320μm×0125μm);检测器:氢火焰离子检测器(FI D),检测器温度270℃,进样口温度250℃;柱温度:程序升温,初始温度100℃,保持5min,以10℃/min升温至260℃保持5min;载气:氮气;流速115ml/min;不分流,以甲醇为溶剂。

115　试验设计11511　Plackett2Burman设计　根据哈茨木霉生长所需营养要素的基本原则和发酵影响因素的一般规律,结合前期试验,选用试验次数N=8的Plackett2Burman试验设计,考查了葡萄糖浓度943(A)、牛肉浸膏浓度(B)、接种量(C)、发酵时间(D)、pH值(E)、MnCl2用量(F)6个因素对木霉素发酵单位的影响,G为空白因素,每个因素取两水平,响应值为木霉素产量(Y),试验设计和各因素水平编码见表1和表2。

11512　响应面分析法试验设计　根据Box2Behnken中心组合设计原理设计了以葡萄糖(X1,g/ L)、孢子悬液接种量(X2,ml)和发酵时间(X3,h)为自变量,每个因素取3个水平。

按方程x i= (X i-X0)/△X对自变量进行编码(x i为自变量的编码值,X i为自变量的真实值,X0为试验中心点处自变量的真实值,△X为自变量的变化步长)。

利用软件Design2Expert61015分析。

2　结果与分析211　影响哈茨木霉产木霉素的重要因素按Plackett2Burman设计进行发酵试验,试验结果(表1)经S AS810分析和整理,各因素主效应分析结果见表2。

由表2可知,对木霉素产量有显著影响的因素为葡萄糖、发酵时间、接种量,并以此作为主要因素进行响应面优化试验。

表1　N=8的P lackett2Burm an试验设计及响应值试验号A B C D E F G Y(mg/L) 1+++-+--145133 2-+++-+-138112 3--+++-+140164 4+--+++-127194 5-+--+++107137 6+-+--++126178 7++-+--+136120 8-------105133表2　P lackett2Burm an试验设计各因素水平编码及影响效果编码因素水平T2test Prob>T显著性(-)(+)A葡萄糖(g/L)304571820010813B牛肉浸膏(g/L)101541598011365C接种量(m l)1113121927010491D发酵时间(h)96108101143010632E pH5621593012346F MnCl2(g/L)015017-41765011324212　响应面分析法(RSM)优化试验条件选用葡萄糖、发酵时间和孢子悬液接种量为自变量,采用Box2Benhnken试验设计进行3因素3水平的响应面分析试验,包括12个析因试验和3个中心试验(表3)。

表3　试验设计的因素水平及编码值变量代码编码水平未编码编码-10+1葡萄糖(g/L)X1x1304050接种量(m l)X2x21113116发酵时间(h)X3x388100112053 中国生物防治 第25卷 响应面优化回归分析模型为:Y i=c0+∑ni=1a i x i+∑nj≤ib ij x i x j,其中:Y i为预测响应值,即木霉素含量的预测值;x i和x j为自变量编码值;C0为常数项;a i为线性系数;b ij为二次项系数;n为因子数,本试验n为3。