简述酶联免疫吸附试验的原理及基本步骤
酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理
酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的生物化学分析方法，用于检测并定量测定生物样品中的抗体或抗原。
ELISA方法包括直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等。
下面将对这些方法的类型和反应原理进行详细介绍。
1.直接ELISA直接ELISA是最简单的ELISA方法之一、在这种方法中，微孔板表面上涂覆有抗原，然后加入待检测样品，如血清等。
待检测样品中的抗体与涂覆的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
然后加入特异性抗体，这些抗体已标记有酶，比如辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP），然后加入适当的底物。
酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与待测样品中抗原或抗体的浓度成正比。
2.间接ELISA间接ELISA是常用的ELISA方法之一，比直接ELISA灵敏度更高。
在这种方法中，微孔板表面上涂覆有抗原，然后加入待检测样品，如血清等。
待检测样品中的抗体与涂覆的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
然后加入与待测抗体特异性的二抗，这些二抗已标记有酶，如HRP，再加入适当的底物。
酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与待测样品中抗原或抗体的浓度成正比。
3.竞争ELISA竞争ELISA是一种用于测定样品中抗原或抗体浓度的ELISA方法。
在这种方法中，微孔板表面上涂覆有特异性抗体，然后加入待检测样品和已标记的抗原或抗体。
待检测样品中的抗原或抗体与涂覆的抗体竞争结合，形成复合物。
然后加入特异性的抗原或抗体，这些抗原或抗体已标记有酶，比如HRP，继续竞争与涂覆抗体结合。
酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与待测样品中抗原或抗体的浓度成反比。
4.间接竞争ELISA间接竞争ELISA是一种用于测定样品中抗原或抗体浓度的高灵敏度ELISA方法。
在这种方法中，微孔板表面上涂覆有抗原。
固相竞争酶联免疫吸附试验
固相竞争酶联免疫吸附试验概述固相竞争酶联免疫吸附试验（solid-phase competitive enzyme-linked immunosorbent assay, C-ELISA）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和测定特定抗原或抗体的存在和浓度。
本文将全面介绍固相竞争酶联免疫吸附试验的原理、方法、应用以及优缺点。
原理固相竞争酶联免疫吸附试验是通过将待测样品中的抗原或抗体与已标记的抗原或抗体竞争结合于特定的固相载体上，来测定待测样品中特定抗原或抗体的含量。
具体原理如下： 1. 将待测样品中的抗原或抗体与固相载体上的抗原或抗体竞争结合。
2. 清洗固相载体，去除未结合的物质。
3. 添加酶标记的抗原或抗体，与固相载体上的抗原或抗体竞争结合。
4. 清洗固相载体，去除未结合的物质。
5. 加入底物，观察其与固相载体上的酶结合产生的信号。
方法固相竞争酶联免疫吸附试验的方法包括以下步骤： 1. 准备固相载体：通常使用微孔板作为固相载体，将特定抗原或抗体吸附于孔板表面。
2. 样品处理：将待测样品进行稀释处理，以适当的浓度进行实验。
3. 添加标记物：将酶标记的抗原或抗体加入孔板中，与待测样品中的特定抗原或抗体竞争结合。
4. 清洗孔板：用缓冲液反复清洗孔板，以去除未结合的物质。
5. 加入底物：加入合适的底物，使酶与底物发生反应产生可测量的信号。
6. 反应终止：加入适当的反应停止剂，终止底物的反应。
7. 测量信号：使用酶标仪读取各孔板的吸光度，根据吸光度值计算待测样品中的特定抗原或抗体的含量。
应用固相竞争酶联免疫吸附试验在许多领域中被广泛应用，包括医药、环境、食品安全等。
主要应用如下： 1. 医药领域：用于检测和测定血清中的特定抗体，用于疾病诊断和治疗监测。
2. 环境领域：用于检测水、土壤等环境样品中的有害物质。
3. 食品安全领域：用于检测食品中的毒素和污染物。
4. 兽医领域：用于动物疫病的监测和诊断。
酶联免疫吸附法原理
酶联免疫吸附法原理酶联免疫吸附法（ELISA）是一种常用的免疫学实验技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和生物制药等领域。
它通过酶与抗原或抗体的特异性结合来检测样品中特定的蛋白质分子，具有高灵敏度、高特异性和简便易行的特点。
下面将详细介绍酶联免疫吸附法的原理。
首先，酶联免疫吸附法的基本原理是利用酶标记的抗体或抗原与待检测的抗原或抗体结合，再通过酶底物的作用来间接或直接检测样品中的特定蛋白质。
整个实验过程可以分为固相吸附、特异性结合、非特异性结合和酶底物反应等步骤。
固相吸附是酶联免疫吸附法的第一步，通常将待检测的抗原或抗体通过物理吸附或共价结合的方式固定在固相载体（如微孔板）上。
这样做的目的是为了使待检测的抗原或抗体能够与酶标记的抗体或抗原发生特异性结合。
特异性结合是酶联免疫吸附法的关键步骤，它是指将酶标记的抗体或抗原与待检测的抗原或抗体发生特异性结合。
在这一步骤中，酶标记的抗体或抗原将与待检测的抗原或抗体形成免疫复合物，而非特异性结合则会被洗涤去除。
非特异性结合是指除了特异性结合外，固相载体上还可能存在一些非特异性结合的情况。
为了减少非特异性结合的干扰，需要通过洗涤的方式将非特异性结合的物质去除，以保证后续的酶底物反应的准确性和特异性。
最后，酶底物反应是酶联免疫吸附法的最后一步，当酶标记的抗体或抗原与待检测的抗原或抗体发生特异性结合后，加入酶底物后，酶将催化底物的变化，产生可测量的信号。
通过测定信号的强度或颜色的变化，可以间接或直接检测样品中特定蛋白质的含量或存在情况。
总的来说，酶联免疫吸附法是一种基于酶与抗原或抗体的特异性结合来检测特定蛋白质的技术。
它通过固相吸附、特异性结合、非特异性结合和酶底物反应等步骤，实现对样品中特定蛋白质的高灵敏度、高特异性的检测。
在实际应用中，酶联免疫吸附法已经成为生物医学研究和临床诊断中不可或缺的重要技术手段。
酶联免疫吸附试验 elisa原理
酶联免疫吸附试验 elisa原理酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常见的实验室技术，用于检测生物分子如蛋白质、抗体、荷尔蒙和病毒等。
ELISA技术基于抗原和抗体的特异性结合，通过酶标记物和底物的反应来检测分子的存在或浓度。
ELISA技术的原理可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA 和夹心ELISA等几种。
其中，间接ELISA是最常见的类型，下面将详细介绍其原理和步骤。
一、间接ELISA的原理间接ELISA利用抗体与抗原的特异性结合来检测分子的存在或浓度。
该方法需要用到两种抗体：第一种是特异性抗体，用于检测目标分子；第二种是酶标记抗体，用于检测第一种抗体的结合情况。
具体步骤如下：1. 将抗原溶液加入微孔板中，并在室温下孵育一定时间，使抗原吸附于微孔板表面。
2. 将微孔板洗涤干净，以去除未结合的抗原和杂质。
3. 加入一定浓度的非特异性蛋白质，如牛血清蛋白或奶粉，以防止非特异性结合。
4. 加入一定浓度的特异性抗体，使其与抗原结合。
5. 将微孔板洗涤干净，以去除未结合的抗体和杂质。
6. 加入一定浓度的酶标记抗体，使其与第一种抗体结合。
7. 将微孔板洗涤干净，以去除未结合的酶标记抗体和杂质。
8. 加入底物，使酶标记抗体产生颜色反应。
9. 测量吸光度，来确定目标分子的存在或浓度。
二、间接ELISA的优缺点间接ELISA具有以下优点：1. 可以检测极低浓度的分子，如病毒和荷尔蒙。
2. 可以同时检测多个样本。
3. 可以检测多种类型的生物分子，如蛋白质、抗体、荷尔蒙和病毒等。
4. 可以使用多种酶标记抗体，如辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）和过氧化物酶（POD）等。
5. 可以使用多种检测方法，如发光、荧光和色谱法等。
间接ELISA的缺点包括：1. 检测过程需要多个步骤，比较繁琐。
2. 需要特异性抗体和酶标记抗体，成本较高。
3. 受到非特异性结合的影响，可能会出现假阳性结果。
三、间接ELISA的应用间接ELISA广泛应用于医学、生物学、生物工程和食品安全等领域。
酶免疫技术—酶联免疫吸附试验(免疫学检验课件)
（二）最适工作浓度的选择
在ELISA测定中应对包被抗原或抗体的浓度和酶标 抗原或抗体的浓度予以选择以达到最佳的测定条件以 间接法测抗体为例
1．酶标抗抗体工作浓度的选择
（1）用100ng/ml人IgG进行包被，洗涤。 （2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已 包被的孔中，温育，洗涤。 （3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度（A）值 在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。
抗原
E
E
E 底物
捕获法
EE E
E
（+）
EE
（-）
3．注意事项
采用固相捕获法检测IgM类抗体时要注意的 是RF（IgM类）及其它非特异IgM的干扰。RF （IgM类）能与固相抗人μ链抗体结合，并可与 随后加入的酶标抗体（动物IgG）反应，从而导 致假阳性反应。
非特异IgM由于其在第一步温育中， 可与特异IgM竞争与固相抗体结合，所以 会影响测定的灵敏度。因此，使用本法测 IgM，必须对临床样本进行适当稀释。
E
2．技术要点
（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）加待检标本,温育，洗涤。 （3）加酶标抗体，洗涤。 （4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的
定性或定量。
双抗体夹心法测抗原
EE E EE E
（+）
EE E
（-）
3．注意事项
双抗体夹心法中，应注意类风湿因子(RF) 的干扰。如果待检标本中含有RF，可能产生假 阳性结果。使用抗体的F(ab’)2或Fab片段作为酶 标抗体可消除RF的干扰。
E E
E
（+）
E EE
E EE
（-）
（2）竞争法检测HBeAb：
酶联免疫反应的原理和步骤
酶联免疫反应的原理和步骤一、酶联免疫反应的原理酶联免疫反应是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析抗原或抗体的存在和浓度。
其原理基于抗原与抗体之间的特异性结合反应，通过将酶标记的二抗与特异性抗体结合形成免疫复合物，再利用酶的催化作用产生可定量检测的产物，从而实现对抗原或抗体的检测和定量。
酶联免疫反应的原理可以简单概括为以下几个步骤：1. 免疫吸附：将待测物（抗原或抗体）吸附在固相载体（如酶标板、磁珠等）上，使其与固相载体结合。
2. 阻断：为了防止非特异性结合，需要在免疫吸附之前或之后对固相载体进行阻断处理，通常使用牛血清蛋白（BSA）或牛血清白蛋白（BSA）来阻断非特异性结合位点。
3. 特异性结合：加入特异性抗体与待测物进行结合反应，形成抗原-抗体复合物。
4. 二抗结合：加入酶标记的二抗，该二抗与特异性抗体结合，形成二抗-抗原-抗体复合物。
5. 底物反应：加入底物，该底物受酶的催化作用产生可定量测量的产物。
常用的底物有TMB（三甲基苯胺）、ABTS（2,2'-联氨基丙烷磺酸）等。
6. 反应终止：加入适当的反应终止液，停止底物反应过程。
7. 测量：通过光度计或荧光计测量产物的光吸收或荧光强度，以反映抗原或抗体的浓度。
二、酶联免疫反应的步骤酶联免疫反应通常包括以下几个步骤：1. 表面处理：将固相载体（如酶标板）表面进行处理，以增强待测物的吸附能力和特异性结合。
常用的方法有物理吸附、化学共价结合、亲和结合等。
2. 阻断处理：为了防止非特异性结合，需要对固相载体进行阻断处理，通常使用牛血清蛋白（BSA）或牛血清白蛋白（BSA）来阻断非特异性结合位点。
3. 特异性结合：加入待测物（抗原或抗体），与固相载体上的特异性抗体进行结合反应，形成抗原-抗体复合物。
4. 二抗结合：加入酶标记的二抗，该二抗与特异性抗体结合，形成二抗-抗原-抗体复合物。
5. 底物反应：加入底物，该底物受酶的催化作用产生可定量测量的产物。
酶联免疫吸附法标准
酶联免疫吸附法标准一、概述酶联免疫吸附法是一种常用的生物检测方法，用于测定抗原或抗体。
该方法具有高灵敏度、特异性和准确性等特点，广泛应用于临床诊断、食品安全、环境监测等领域。
本文将介绍酶联免疫吸附法的原理、试剂和操作步骤等标准要求。
二、原理酶联免疫吸附试验（ELISA）是基于抗原抗体反应的检测方法。
在固相载体上标记特异性抗原或抗体，与样品中的靶分子结合后，再加入酶标记的抗靶分子抗体，最后通过底物显色反应观察结果。
根据颜色深浅程度可以判断样本中靶分子的浓度。
三、试剂1. 特异性抗原或抗体的纯化溶液：需经过质量控制，确保其准确性和特异性。
2. 酶标抗体的纯化溶液：应选择合适的酶标记抗体，以增强颜色反应的敏感性。
3. 洗涤液：用于去除实验过程中产生的非特异性结合物质。
4. 底物及终止液：用于颜色反应，可根据需要配置不同颜色的底物和终止液。
5. 其他所需辅助试剂：如缓冲液、防腐剂等。
四、操作步骤1. 准备试剂和设备：按照试剂说明书准备好所有试剂和设备，并确保仪器正常运行。
2. 包被抗原或抗体：将特异性抗原或抗体包被在固相载体上，制备成酶标板。
3. 加样：分别加入待测样品、标准品和阴性对照品，每个样品需设复孔。
4. 温育：将酶标板放置在恒温水浴中保温一定时间，使抗原抗体反应充分进行。
5. 洗涤：用洗涤液清洗酶标板表面，去除非特异性结合物质。
6. 添加底物：加入酶标抗体，继续温育并洗涤。
7. 显色反应：加入底物溶液，观察并记录颜色变化。
8. 终止反应：加入终止液，停止显色反应。
9. 检测与分析：用酶标仪测量各孔的光密度值，根据标准曲线的绘制得出待测样品中靶分子的浓度。
五、注意事项1. 应严格控制试剂和样本的质量，确保实验结果的准确性。
2. 在操作过程中应注意无菌操作，避免污染。
3. 洗涤时应彻底，以免影响实验结果。
4. 注意观察显色反应的时间和颜色深度，以确保实验过程的顺利进行。
5. 对于特殊样本（如血浆、组织匀浆液等），应在实验前进行处理，以保证实验结果的可靠性。
酶联免疫吸附测定法
检测方法
检测方法
双抗体夹心法 双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： 一、将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 二、加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相 抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 三、加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体 上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 四、加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗体分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针 对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶 标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分 别用于包被固相载体和制备酶结合物。
酶联免疫吸附测定法
保持其免疫活性的测定方法
01 检测简介
03 注意事项
目录
02 基本原理 04 检测步骤
05 检测方法
07 酶标记法
目录
06 标记用酶 08 效果测定
基本信息
1971年瑞典学者Engvall和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液 中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)。 ELISA已成为分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术( immunoenzymatic techniques )的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。
ELISA酶联免疫吸附试验
夹心elisa具有高灵敏度、高特异 性和高稳定性等优点，适用于多 种抗原的检测。
04 elisa酶联免疫吸附试验的 优缺点
优点
高灵敏度
特异性
ELISA酶联免疫吸附试验具有高灵敏度，能 够检测出微量的抗原或抗体，适用于各种 生物样本中低浓度蛋白质的检测。
ELISA基于抗原与抗体特异性结合的原理， 能够准确地区分目标蛋白和其他蛋白质， 减少交叉反应，提高检测的特异性。
A 假阳性结果
由于ELISA试验的交叉反应和抗体间 的互相干扰，可能导致假阳性结果 的出现。
B
C
D
影响因素多
ELISA试验结果受到多种因素的影响，如 样本保存条件、试剂质量、操作时间等， 可能导致结果的差异和不稳定。
操作要求高
ELISA试验对操作要求较高，需要严格控 制实验条件和避免污染，以确保结果的准 确性和可靠性。
间接elisa是将特异性抗体与固相载 体结合，对待测样本中的抗原进行吸 附，再加入酶标记的抗抗体，通过底 物显色反应来检测抗原。
间接elisa可以用于检测未知抗原，操 作相对简单，但灵敏度较低。
夹心elisa
01
夹心elisa是将两种不同的特异性 抗体分别与固相载体和酶标记物 结合，通过形成“夹心”结构来 检测样本中的抗原。
洗板方式
可以采用手工洗板或洗板机进行洗涤，以减少误差和提高试验效率。
洗板次数
根据试验要求确定合适的洗涤次数，以保证试验的准确性和重复性。
显色
显色
加入显色剂使抗原抗体复 合物呈现颜色反应，是 ELISA试验中判断阴阳性的 依据。
显色剂
常用的显色剂包括TMB、 ABTS等，根据试验需求选 择合适的显色剂。
环境监测领域
酶联免疫吸附试验原理
酶联免疫吸附试验原理酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的免疫学实验方法，用于检测样品中特定蛋白质或其他分子的存在。
它的原理是利用酶标记的抗体与特定抗原结合，通过酶底物的反应产生可检测的信号，从而实现对目标分子的定量或定性分析。
首先，ELISA试验通常包括固相吸附、抗原或抗体结合、酶标记抗体结合和底物反应等步骤。
在固相吸附步骤中，将抗原或抗体固定在微孔板上，形成固相。
接着，样品中的抗原与固相上的抗体结合，形成复合物。
然后，加入酶标记的抗体，与复合物中的抗原结合。
最后，加入底物，酶催化底物反应产生可测量的信号。
其次，ELISA试验可分为间接法、夹心法、竞争法和直接法等不同类型。
在间接法中，样品中的抗原与固相上的抗体结合，然后酶标记的抗体与抗原结合，形成“抗原-抗体-酶标记抗体”复合物。
在夹心法中，样品中的抗原与固相上的抗体结合，然后加入酶标记的抗原，形成“抗体-抗原-酶标记抗原”复合物。
在竞争法中，固相上的抗原与样品中的抗原竞争结合酶标记的抗体。
在直接法中，固相上的抗原与酶标记的抗体直接结合。
最后，ELISA试验具有灵敏度高、特异性强、操作简便、成本低等优点，因此被广泛应用于医学诊断、生物学研究和药物开发等领域。
在临床诊断中，ELISA可用于检测各种感染病原体、肿瘤标志物、激素、免疫球蛋白等，具有重要的临床意义。
在生物学研究中，ELISA可用于检测细胞因子、蛋白质相互作用、酶活性等，为科研提供重要数据。
在药物开发中，ELISA可用于药物代谢产物的检测、药物的药效学评价等，对药物研发具有重要意义。
总之，酶联免疫吸附试验原理简单清晰，操作方便，应用广泛，是一种重要的实验方法，对医学、生物学和药物开发等领域具有重要意义。
通过不断的技术改进和方法优化，ELISA将在未来发挥更加重要的作用，为人类健康和科学研究做出更大的贡献。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
简述酶联免疫吸附试验的原理及基本步骤酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析样本中的特定抗原或抗体。
ELISA的原理是利用抗原与抗体的特异性结合来检测和测量样本中的目标物质。
ELISA通常分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等几种类型，但它们的基本原理相似。
一般来说，ELISA的基本步骤包括以下几个方面：
1. 涂层：将特异性抗体固定在试验板的表面上，通常是通过将抗体溶液加入试验板孔中，然后在适当条件下进行孵育。
固定在试验板上的抗体将被用于捕获待检测的抗原或抗体。
2. 绑定：将待检测的样本加入试验板中，样本中的抗原或抗体与固定在试验板上的抗体发生特异性结合。
样本中的目标物质与固定在试验板上的抗体形成抗原-抗体复合物。
3. 洗涤：洗涤试验板以去除未结合的样品成分。
这一步骤的目的是去除非特异性结合的物质，以减少背景干扰。
4. 检测：加入辅助抗体(常为酶标记的抗体)，该抗体能够与已结合在试验板上
的抗原-抗体复合物发生特异性结合。
这些酶标记的抗体可以是与抗体结合的酶，如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)。
然后，添加适当的底物使酶产生可检测的信号。
5. 信号检测：通过所使用酶催化的底物的反应产生的颜色或荧光等信号，可以对样品中目标物质的含量进行定量测量。
这一步骤可以使用吸光度计或荧光分析仪进行信号的测量和记录。
ELISA具有高灵敏度和特异性，广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域，用于检测病原体、抗体、激素、药物等物质的存在和浓度。
它不仅可以用于疾病的诊断和监测，还可以用于药物筛选、生物分子的定量分析和研究等。