第七章 酶联免疫吸附分析
酶联免疫吸附测定实验报告
酶联免疫吸附测定实验报告酶联免疫吸附测定实验报告酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析生物样本中特定分子的存在。
本实验旨在通过ELISA技术，对特定抗原在样本中的含量进行测定，并了解其原理及应用。
一、实验原理ELISA技术是一种基于免疫反应的实验方法，其原理主要包括固相吸附、特异性结合、酶标记和显色反应。
首先，在微孔板中固定特异性抗体，形成固相吸附。
然后，加入待测样本，样本中的目标抗原与固相抗体结合。
接着，加入酶标记的二抗与目标抗原结合，形成特异性结合。
最后，通过添加显色底物，酶催化反应产生可见的颜色变化，从而定量分析目标抗原的含量。
二、实验步骤1. 准备样本和试剂：收集待测样本，如血清、尿液或细胞培养上清液，并准备好ELISA试剂盒中的各种试剂。
2. 板洗涤：将微孔板放入洗板机中，加入洗板缓冲液，进行洗涤步骤，以去除未结合的物质。
3. 固相吸附：将特异性抗体加入微孔板孔中，孵育一段时间，使其与固相吸附。
4. 样本孵育：将待测样本加入各孔中，与固相抗体结合，在恒温条件下孵育。
5. 二抗结合：加入酶标记的二抗，与目标抗原结合形成特异性结合。
6. 洗涤：再次进行洗板步骤，去除未结合的物质。
7. 底物反应：加入显色底物，酶催化反应产生可见的颜色变化。
8. 反应终止：加入终止液，停止酶催化反应。
9. 测定吸光度：使用酶标仪测定各孔的吸光度值。
10. 数据分析：根据吸光度值，绘制标准曲线，通过比较待测样本的吸光度值，计算出目标抗原的浓度。
三、实验结果通过ELISA实验，我们成功测定了待测样本中目标抗原的含量。
根据标准曲线，我们计算出了各样本中目标抗原的浓度。
这些结果将有助于我们了解样本中特定分子的水平，从而进一步研究其生物学功能和相关疾病的发生机制。
四、实验应用ELISA技术具有广泛的应用领域，包括生物医学研究、临床诊断、药物开发等。
酶联免疫吸附实验报告
酶联免疫吸附实验报告导言酶联免疫吸附实验是一种用于检测抗原或抗体的常用方法，其原理是利用酶的特异性活性，使其与试验物发生特异性反应，并通过测定酶反应产生的信号来确定目标物的存在与否。
本实验报告将介绍使用酶联免疫吸附实验来检测抗原的方法和结果。
实验材料与方法材料：实验所需材料包括试剂盒、检测板、洗涤缓冲液、标准物质、底物试剂等。
方法：首先准备样本和标准溶液，按照试剂盒说明书的指导加入相应试剂，进行酶联免疫吸附实验。
实验过程中需要进行洗板步骤、底物反应、反应终止等操作。
实验结果与分析通过此次实验，我们成功检测到了目标抗原。
比如，我们可以观察到在某个特定波长下，底物反应产生了显著的吸光度值。
这是因为被检测的抗原与特异性抗体反应，在酶反应的作用下，产生了底物反应所需的物质，从而使底物反应溶液的颜色发生变化。
结论通过本次实验我们证实了酶联免疫吸附实验可以用于检测抗原。
这种方法具有灵敏度高、准确度高的特点，广泛用于医学、生物学以及生化领域的研究中。
酶联免疫吸附实验可以快速、简单地检测大量样本，并得到可靠的结果。
展望虽然酶联免疫吸附实验在目前的医学研究中被广泛使用，但仍有一些改进的空间。
例如，我们可以进一步优化实验条件，提高实验的灵敏度和准确度。
此外，我们也可以将酶联免疫吸附实验与其他技术手段相结合，进一步扩展其应用领域。
结语本实验报告介绍了酶联免疫吸附实验的方法、结果和意义。
这是一种常用的检测方法，可用于确定抗原的存在和浓度。
酶联免疫吸附实验不仅在医学研究中起着重要作用，也在生物学和生物化学研究中发挥着重要作用。
通过不断改进和创新，酶联免疫吸附实验有望在未来更广泛地应用于科学研究和临床实践中。
酶联免疫吸附法原理
酶联免疫吸附法原理酶联免疫吸附法（ELISA）是一种常用的生物化学分析方法，它基于抗体与抗原相互作用的原理，可以用于检测特定蛋白质的存在和浓度。
酶联免疫吸附法具有高灵敏度、高特异性和易操作等优点，因此在医学诊断、生物学研究和生物制药等领域得到了广泛的应用。
首先，酶联免疫吸附法的原理是基于抗体与抗原的特异性结合。
在实验中，首先将待检测的抗原溶液加入到微孔板中，使其吸附在孔板表面。
然后，加入特异性的一抗抗体，与待检测的抗原发生特异性结合。
接着，加入酶标记的二抗抗体，它会与一抗抗体结合形成复合物。
最后，加入底物，酶与底物发生反应产生可测的信号，通过测定信号的强度来确定待检测抗原的存在和浓度。
其次，酶联免疫吸附法的原理还包括两种常用的方法，间接法和夹心法。
间接法是指在待检测抗原与一抗抗体结合后，再加入酶标记的二抗抗体，通过二抗抗体与一抗抗体的结合来增强检测信号。
夹心法是指在待检测抗原与一抗抗体结合后，再加入抗原特异性的酶标记抗体，形成抗原-抗体-酶标记抗体的夹心复合物，从而增强检测信号。
此外，酶联免疫吸附法还可以根据检测信号的产生方式分为颜色反应法和发光反应法。
颜色反应法是指在酶与底物发生反应后产生可见的颜色变化，通过比色计或酶标仪来测定信号强度。
发光反应法是指在酶与底物发生化学反应产生发光信号，通过发光计来测定信号强度。
发光反应法具有高灵敏度和低背景信号的优点，因此在一些对灵敏度要求较高的实验中得到了广泛的应用。
总的来说，酶联免疫吸附法原理简单、灵敏度高、特异性强，操作简便，可以同时检测多个样品，因此在科研和临床诊断中得到了广泛的应用。
随着生物技术的不断发展，酶联免疫吸附法在蛋白质检测、疾病诊断和药物研发等领域将会发挥越来越重要的作用。
酶联免疫吸附试验实验报告
酶联免疫吸附试验实验报告一、实验目的。
本实验旨在通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测目标蛋白或抗原的存在与浓度，以及对特定抗体的识别和结合情况。
通过本实验，我们可以了解到酶联免疫吸附试验的原理和操作步骤，以及在生物医学研究和临床诊断中的应用。
二、实验原理。
酶联免疫吸附试验是一种利用酶和抗体的特异性结合来检测抗原或抗体的方法。
其原理是将待检测的抗原或抗体吸附在微孔板表面，然后加入特异性抗体，并通过酶标记的二抗或底物来检测特异性结合的信号。
当待测物与特异性抗体结合后，通过底物的酶反应产生可定量的颜色反应，从而测定待测物的浓度。
三、实验材料和方法。
1. 实验材料，微孔板、待测抗原或抗体、特异性抗体、酶标记的二抗、底物溶液等。
2. 实验步骤，将待测抗原或抗体加入微孔板孔中，加入特异性抗体，洗涤孔板，加入酶标记的二抗，再次洗涤孔板，加入底物溶液，停止反应，测定吸光度。
四、实验结果。
通过本次实验，我们成功检测出待测物的存在与浓度，并观察到特异性抗体与待测物的结合情况。
根据实验结果，我们可以得出待测物的浓度，并进一步分析其在生物学过程中的作用和意义。
五、实验结论。
酶联免疫吸附试验是一种高度敏感和特异性的实验方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域。
通过本次实验，我们深入了解了酶联免疫吸附试验的原理和操作步骤，掌握了实验技术和数据分析方法，为今后的科研工作和临床诊断提供了重要的参考和支持。
六、实验展望。
酶联免疫吸附试验作为一种重要的生物学实验方法，具有广阔的应用前景。
今后，我们将进一步深入研究酶联免疫吸附试验的原理和技术，开展更多的实验和应用，为生物医学研究和临床诊断提供更多的支持和帮助。
七、参考文献。
1. Smith, J. et al. (2010). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Methods Mol Biol, 588, 89-94.2. Green, N. M. (2015). Avidin and streptavidin. Methods Enzymol, 184, 51-67.以上就是本次酶联免疫吸附试验的实验报告，谢谢阅读。
酶联免疫吸附实验报告
酶联免疫吸附实验报告酶联免疫吸附实验报告酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）是一种常用的生物化学技术，用于检测和定量分析特定抗原或抗体的存在。
该实验结合了免疫学和酶学的原理，通过酶的催化作用来实现对目标物的检测。
本报告将介绍酶联免疫吸附实验的基本原理、操作步骤以及结果分析。
一、实验原理酶联免疫吸附实验的原理基于免疫学的特异性识别和酶学的催化作用。
实验中，首先将待测物（抗原或抗体）与特异性的抗体或抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
然后，将该复合物与与酶标记的抗体或抗原结合，形成二抗或二抗原复合物。
最后，通过添加底物，利用酶的催化作用产生可测量的信号，从而确定待测物的存在或浓度。
二、实验步骤1. 准备样品和试剂：收集待测物样品，并准备所需的试剂，如抗体、底物等。
2. 预处理样品：根据待测物的性质，进行必要的样品预处理，如稀释、去除干扰物等。
3. 涂布固相支持物：将特异性抗体或抗原溶液均匀涂布在固相支持物（如酶标板）上，使其吸附。
4. 孵育：将待测物样品加入酶标板中，与固相支持物上的抗体或抗原结合，形成复合物。
然后加入酶标记的抗体或抗原，形成二抗或二抗原复合物。
孵育一段时间，以便复合物的形成。
5. 洗涤：将酶标板反复洗涤，去除未结合的物质。
6. 底物反应：加入适当的底物，使底物与酶发生反应，产生可测量的信号。
底物的选择与酶的选择有关，常用的底物有TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）等。
7. 反应停止：通过添加反应停止剂，停止底物的反应，并使产生的信号停止发展。
8. 读取结果：使用酶标仪或其他适当的仪器，测量底物反应产生的信号的强度。
根据标准曲线或对照样品，确定待测物的浓度或存在与否。
三、结果分析根据实验结果，可以定量测定待测物的浓度或判断其存在与否。
一般来说，酶标仪测得的信号强度与待测物的浓度成正比，可以通过标准曲线来确定待测物的浓度。
酶联免疫吸附测定法
酶结合物是酶与抗体或抗原联结的产
物。具有酶促反应，显示出生物放大作用。 在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷 酸酶(alkaline phosohatase, AP)。
酶的底物
1、HRP催化过氧化物的氧化反应。 供氢体：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB) OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，
最适吸收波长为492nm TMB经HRP作用后共产物显蓝色，用HCL或H2SO4
终止后，由蓝色呈黄色，最适吸收波长为405nm 2、AP为磷酸酯酶
一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP)作为底物。产物 为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。 用NaOH终止酶反应
阳性对照品(positive control)和阴性对照品 (negative control)
实验器材和药品
固相载体在ELISA测定过程中作为吸附 剂和容器。 最常用的是聚苯乙烯和聚氯乙 烯 。它们有较强的吸附蛋白质的性能，抗 体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的 免疫学活性。 微量滴定板，量滴定板为8×12的96孔 式。ELISA板的特点是可以同时进行大量标 本的检测，并可在特制的比色计上迅速读 出结果。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附 性增加。
阴性对照品须先行检测，确定其中不含待 测物质。
阳性对照品在含蛋白保护剂的缓冲液中加 入一定量的待检物质 ，含量约为最低检测 敏感度的10~20倍。
洗涤液 常用的稀释液为含0.05%吐温20的磷酸
盐缓冲液。
酶反应终止液
HRP反应终止液为硫酸，一般采用2mol/L
AP用NaOH终止
实验方法:
1. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于已包被之反应 孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴 性对照孔及阳性对照孔)。 2. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗 体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。 3. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的底物溶 液0.1ml，37℃10～30分钟。 4. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 5. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果： 反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极 浅。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，以空白对照孔调 零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍， 即为阳性。
酶联免疫吸附原理
酶联免疫吸附原理酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的免疫学分析方法。
它基于免疫反应的原理，利用酶的活性来检测目标物质的存在或浓度。
ELISA的原理可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和夹心ELISA等几种。
本文将以间接ELISA为例来介绍酶联免疫吸附的原理。
间接ELISA由两个主要步骤组成：涂层和检测。
首先，将需要检测的抗原分子固定在固相（如微孔板）上，这一步骤被称为涂层过程。
涂层完毕后，孔板中未被抗原吸附的位点将被阻断以避免非特异性吸附。
接下来，将待测样品加入孔板中，并与固相上的抗原分子相互作用。
如果样品中存在目标抗原，则目标抗原与固相抗原会发生特异性结合。
此时，加入特异性抗体（如兔抗人抗体）与抗原结合，并形成免疫复合物。
为了检测免疫复合物的存在，通常会使用与兔抗体特异性结合的酶标记抗体，如辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，简称HRP）。
酶标记抗体与免疫复合物结合后，将其余的非特异性物质洗去。
最后，加入底物（如TMB，即3,3',5,5'-四甲基联苯胺）与酶发生反应，形成可测量的产物。
该产物颜色呈现与底物反应时间和酶标记抗体的结合程度成正比的变化。
通过测量底物反应的颜色强度或光密度，可以间接反映出待测样品中目标抗原的存在或浓度。
总的来说，酶联免疫吸附原理是通过利用酶标记抗体的活性来间接检测目标抗原的存在或浓度。
它具有高灵敏度、高特异性和易操作等优点，广泛应用于生命科学研究和临床诊断领域。
酶联免疫吸附试验实验报告
酶联免疫吸附试验实验报告酶联免疫吸附试验实验报告酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的生物化学实验技术，用于检测和定量分析抗原或抗体的存在与浓度。
本实验旨在通过ELISA技术，检测和定量分析一种特定抗原在不同样本中的浓度变化。
实验材料和方法：1. 样本制备：收集不同来源的样本，如血清、尿液等，并进行离心分离获得上清液。
2. 酶标板涂覆：将待测抗原溶液加入酶标板孔中，保持一定的温度和时间，使抗原均匀地附着在酶标板表面。
3. 阻断：加入阻断液，封闭未被抗原占据的酶标板孔，避免非特异性结合。
4. 抗体结合：加入特异性抗体，与抗原结合形成抗原-抗体复合物。
5. 酶标记抗体结合：加入酶标记抗体，与抗原-抗体复合物结合，形成二抗夹心复合物。
6. 显色反应：加入底物，使酶标记抗体催化底物发生颜色变化。
7. 反应停止：加入停止液，终止显色反应。
8. 测定吸光度：使用酶标仪测定酶标板孔中的吸光度。
实验结果：根据测定吸光度值，我们可以得到不同样本中抗原的浓度变化。
通过比较不同样本的吸光度值，可以了解抗原在不同条件下的表达情况以及不同样本中抗原的相对浓度。
实验讨论：ELISA技术在生物医学领域具有广泛的应用，尤其在疾病诊断和药物研发方面起到了重要的作用。
通过ELISA技术，可以检测和定量分析目标抗原的存在与浓度，从而判断疾病的发生与发展，为临床诊断提供依据。
在本次实验中，我们选择了特定抗原作为目标，通过ELISA技术对其进行检测和定量分析。
实验结果显示，不同样本中抗原的浓度存在差异，这可能与样本来源、处理方法等因素有关。
通过进一步的研究和分析，可以进一步探究这些差异的原因，并为临床诊断和治疗提供更准确的依据。
此外，ELISA技术还可以用于药物研发过程中的药物筛选和药效评价。
通过检测药物对特定抗原的影响，可以评估药物的疗效和安全性，为新药的研发提供重要的参考依据。
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包被
• 将抗原或抗体固定化的过程称为包被(coating)。换言之， 包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。 • 抗体或蛋白质等抗原是通过物理吸附与聚苯乙烯等固相 载体结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固 相载体表面的疏水基团间的相互作用。这种物理吸附是 非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影 响。
的颜色反应。
酶
辣根过氧化物酶
底 物
邻苯二胺 四甲替联苯胺 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑 啉磺酸-6)铵盐 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
显色反
测定波长
492 460 449 425 642 400 500 405 420 360,450 420
（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶 标板）；
（2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）；
（3）酶的底物； （4）系列参考标准品（定量测定）；
（5）酶标记物及样本的稀释液；
（6）洗涤液； （7）反应终止液。
ELISA试剂盒
ELISA试剂的作用
• 2.1 免疫吸附剂：
已包被抗原或抗体的固相载体，是ELISA方法中的核心试剂。 • 固相载体：
判断题（8题，每题1分）
填空题（23题，每题1分）
名词解释（5题，每题3分） 简答（6题，每题7分） 实验设计（1题，每题12分）
第七章 酶联免疫吸附分析
• 抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激 机体免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产 生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致 敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。 • 抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免 疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结 合的免疫球蛋白。 • 抗原抗体的基本特性：a、反应的特异性；b、 反应的等比例性
• 2.3 酶的底物
• 2.3.1、HRP的底物 HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为 H2O2，其反应式如下： DH2+ H2O2 D+ H2O 上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。在ELISA中，DH2
一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比
色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-phenylenediamine, OPD)、四甲基联苯胺(3,3‘,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)
加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体 的复合物 彻底洗涤 未结合的 酶标抗体
加底物进行 酶催化反应
根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定
（二）间接法 间接法是检测 抗体最常用的方法， 其原理为利用酶标 记的抗抗体以检测 已与固相抗原结合 的受检抗体，故称 为间接法。
包被固相载体: 用已知抗原包被 固相载体
2.6 对照品
• 阴性对照品须先行检测，确定其中不含待测物质。例如 HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg。
• 阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，其中加入一 定量的待检物质，此量最好在试剂说明书中标明。加入的量 应与试剂的敏感度相称。国外检测HBsAg的ELISA试剂盒检 测敏感度约为0.5 ng/ml，阳性对照品中含量约为10 ng/ml。在 对照品中一般加入抗生素和防腐剂，以利保存。
4、保温
在ELISA中一般加标本和加酶标记物后会有一次抗原抗体反应。 抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称 为温育(incubation)。 • ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。 加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合 的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。 这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。 在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是 为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。
可以用分光光度计（酶标仪）加
以测定。
方法简单，方便迅速，特异性
强。
ELISA原理
酶及其底物 酶结合物（过碘酸盐氧化法、戊二醛交联法）是酶与抗体 或抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂， 它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示
出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同
（一）双抗体夹心法
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
获得待分析物的未标定抗体
将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的 抗体及杂质
加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点
洗涤并除去未结合的封闭蛋白
加受检标本（抗原）形成 固相抗体－抗原复合物 洗涤除去其他 未结合的物质
测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保 留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶 联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性， 当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后， 再加上酶的 相应底物， 即起催化水 解或氧化还 原反应而呈
颜色。
ELISA原理
其所生成的颜色深浅与欲测 的抗原（抗体）含量成正比。 这种有色产物可用肉眼、光 学显微镜、电子显微镜观察，也
5、洗涤
目的：分离游离的酶标记物。通过洗涤以清除残留在板孔中没能 与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于 固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的， 而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。 洗涤的方式：自动洗涤仪与手工操作。
a.吸干或甩干孔内反应液；
用已知特异性 抗体包被 固相载体
测定管加待测抗原和 一定量的酶标抗原使二者与 固相抗体竞争结合
对照管只加一定量酶标抗原 与固相抗体直接结合
加底物显色
分别洗涤 除去未结合 的成分
分别测定两管的吸光度值， 根据对照管与测定管吸光度值之比， 计算标本中待测抗原含量
ELISA特点一：灵敏性 该测定法的灵敏度来自作为报告基团的酶。 酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大 量的催化反应 ，产生可供观察的显色反应现象。 因此该体系常被称为酶放大体系。ELISA实现了 在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在 部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定 量。 例如，在测定血清中某一物质的含量时， 化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定 法的敏感度约为5-10μg/ml 。
特点二：特异性
其特异性来自抗体或抗原的选择性。 抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的 抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。 由于两者在化学结构和空间构型上呈互 补关系，所以抗原抗体反应具有高度的 特异性。
二、ELISA试剂
• ELISA要有三个必要的试剂，即免疫吸附剂、结合物和酶 的底物。
• 完整的ELISA试剂盒应包含以下各组分：
b.用洗涤液过洗一遍; c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，
间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；
d.吸干孔内液体; e.重复操作c和d，洗涤3-4次（或按说明规定）。
抗原-抗体识别反应示意图
一、ELISA原理
它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后 通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可 以是抗体也可以是抗原。 在这种测定方法中有3种必要的试剂：
①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）
②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
ELISA原理
2.3.1 HRP的底物
• OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有 最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。 OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须 现配置现用。 • TMB经HRP作用后产物显蓝色，酶反应用HCl或H2SO4终止后， TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为 405nm。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混 和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等 优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。。
固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反 应。可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。专用于 EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔 式。
良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各 板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。
2.7 标准品 • 定量测定的ELISA试剂盒应含有制作标准曲线用的标准品， 应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护 剂及防腐剂的缓冲液中。
三、ELISA实验过程
1、样品的采集与保存 2、试剂的准备 3、包被 4、加样 在ELISA实验中一般有5次加样步聚，即加标准品、加样
Hale Waihona Puke 本、加酶标记物、加底物、加反应终止液。
应
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色
碱性磷酸酯酶 葡萄糖氧化酶
黄色 红色 黄色 深蓝色 荧光 黄色
β-Ｄ－半乳糖苷 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG) 酶
ELISA的种类和变化
（一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体 （六）应用亲和素和生物素的ELISA
加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合 洗涤，除去无关的物质
加底物 显色
加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体
根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定
ELISA法间接法测定抗体
1.原理
（三）竞争法
对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物 显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞 争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固 相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后 显色反应较弱。