影响酶联免疫吸附试验检测结果的原因分析及应对措施
酶联免疫吸附试验中常见问题的产生原因及解决办法
２ ． ３ 实验 室环境温度控制 实验室温度过高或者
过低 都会 使 吸光值 偏差 。试 剂盒 使用 前后 没有 达到 规 定温 度 、 孵 育和 避光 显色温 度 时 间不达标 ， 实验 室 避 光条 件不 具备 ， 都会 导致 试验 误差 。
３ ． ３ 实验 室环境温度控制 良好
３ ５ ３ ０ ０ ０
用 酶标 记物 进行 免疫 学检 测 的方法称 为酶 联 免 疫 吸 附试 验 （ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ ） 。该技 术 诞 生于 ２ ０世 纪 ７ ０年 代初 ， 可进 行 定 性 或定 量 分 析 ， 主要有间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ、 阻断 Ｅ ＵＳ Ａ、 双 抗 体夹 心 Ｅ ｕＳ Ａ三 种 方法 。 目前 该 技术 在 猪瘟 、 口蹄 疫 、 高 致病 性 猪 蓝耳 病 、 猪 伪 狂 犬 病、 猪 乙型脑 炎 、 猪链 球 菌病 、 猪 圆环病 毒病 、 猪传 染
不规 范 的操作 环节 都会 对试 验结 果产 生影 响 ，出现
错 误 的结果 。 １ 常 见 问题
操作， 要 求血 清清 亮 、 无溶血， 避 免 使用 严 重 溶 血 的 血 清样 品 。 当血清 中有 凝块 时 ， 要 特 别小心 不 要吸 到 任 何凝 结 的材料 或者 血球 。被检 血清 保存 时 间不 能 太久 ， 冻 结 血清 解 冻后 ， 应 该 充 分混 匀 ， 稀 释 后 的血 清 样 品在添 加到 包被 板之 前也 要混 合均匀 。解冻 后 血清标 本争 取一 次性 检测 完成 ，血清 标本 如 需保 存 作多 次检 测 ， 宜 少量 分装 冷 冻保 存 。
检 测板 吸光 值偏 高及 出现假 阳性 ；检 测板 吸光 值 偏 低 及 出现 假 阴 性 ； Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ检 测 板 避 光 显 色 后颜
ELISA法检测的影响因素及其对策
ELISA法检测的影响因素及其对策酶联免疫吸附试验(ELISA)是目前临床实验室检测免疫学指标最受欢迎、应用范围最广泛的方法之一，广泛应用于乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病以及结核等传染类疾病的诊断及激素的检测，具有灵敏度高、特异性强、快速简便、重复性好、成本低、环保且适合大批量人群筛查等优点，虽然操作简单，但是一些影响因素不容小觑，临床待检标本常受溶血、黄疸、脂浊、类风湿因子、高浓度非特异性免疫球蛋白、药物、血液抗凝剂及细菌污染等因素的影响，导致检测结果判断错误。
酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是一种特殊的试剂分析方法，在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，其试剂易于保存、结果判断较为客观，是目前实验室检测抗原抗体最经济、最普遍的试验诊断方法。
其原理是将抗原(抗体)结合到固相载体表面，再将待测抗体(抗原)、酶标抗原(抗体)与固相抗原(抗体)结合形成免疫复合物，经洗涤使免疫复合物与待测抗体(抗原)呈比例，加入酶反应底物使其与固相上的酶反应变色，根据颜色做定性或定量分析，得出检测结果。
ELISA 法步骤包括标本的采集、保存、加样、温育、洗板、显色、比色以及结果判断，临床采集待检样本过程中常出现溶血、黄疸、脂浊，类风湿因子、高浓度非特异性免疫球蛋白、药物及血液抗凝剂等亦对结果产生一定影响。
虽然操作简单，但还是需要注意一些因素的影响，试剂的选择、正确的操作、优良的仪器都与检测结果密切相关。
本文根据样本的影响因素及操作流程中可能出现的相关问题展开笔述，对ELISA法检测的影响因素及相应对策作一综述，希望提高ELISA法检测的准确性。
1 样本的影响因素临床采取空腹抽取静脉血清作为ELISA 检测标本，标本采集过程中很多因素可能导致检测结果不准确，如溶血、脂浊、类风湿因子、甲胎蛋白、高浓度非特异性免疫球蛋白、药物、血液抗凝剂及细菌污染等。
兽药残留酶联免疫吸附试验影响因素分析
兽药 饲料
２ ０ １ ５年第 ４ ５卷・ 第１ ０期
ｓｈｏｕ 卿 ５ｌＩ ｉ ａ
囫
兽药残 留酶联 免疫 吸附试 验影响 因素分析
刘冬梅
（ 新 疆 昌 吉州畜产 品质 量检 测 中心 ， 新疆 昌吉 ８ ３ １ １ ０ ０ ）
摘 要： 酶联免疫吸 附法（ Ｅ Ｌ Ｉ ｓ Ａ ） 因其具有的灵敏度 高， 重现性好 ， 检测成本低 ， 操作 简单 ， 样品处理量 大等特点， 已
２ ． ３ 移 液 枪 的 使 用
加 样 的枪 头 需 使 用 一次 性 的 ，微 量 枪 头 清洗 不 干
净， 很 容 易有 药 物 残 留 ， 重复 使 用会 造成 交 叉 污染 。检
测员 在 使 用八 道 移 液 器 时 ， 在 吸取 时按 至 第 二 停 点 ， 将 吸头 没 入试 剂 液 面下 ２～３ ｍｒ ｏ ，轻缓 松 开 按 钮 回原 点 ，
１ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ试 剂盒 的保 存
光 照 的影 响 试 剂盒 储 存 和 反 应 时 ，均 应 避免 直接 暴 露 在 阳光 下 ， 底 物 液 和 部 分 标 准 品 对 光 敏 感 。试 剂
慢 慢 提 出 吸头 并 在 容 器壁 上 停 靠 一 下 ，以去 除多 余 试 剂， 轻 按 按 钮 至第 一 停 点 ， 排 出液 体 ， 保 持 手 势 不动 ， 再
次将 吸 头 没人 试 剂液 面 稍停 片刻按 至 液 面下 ２～３ ｍ ｍ，
酶联免疫吸附试验检测艾滋病病毒抗体的失控原因分析
酶联免疫吸附试验检测艾滋病病毒抗体的失控原因分析艾滋病毒是一种可致命的病毒，导致艾滋病的发生。
艾滋病毒的传播方式主要是通过血液、精液、阴道分泌物等体液传播。
酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的检测艾滋病病毒抗体的方法。
但在现实运用中，ELISA检测存在失控现象，这会对艾滋病防治工作产生重要影响。
本文将结合生化原理和实际应用情况，探讨ELISA检测失控的原因并提出相应的解决策略。
ELISA的原理是利用抗原和抗体的特异性结合反应，通过特异性结合的酶标记抗体来确定特定抗原或抗体的存在。
可分为直接ELISA、间接ELISA和竞争ELISA等不同类型。
ELISA是一种高效、敏感性较高且易于自动化的技术，被广泛应用于临床检测和科研领域。
在ELISA检测中，失控（false positive或false negative）是一种常见的问题。
失控可能会导致假阳性或假阴性结果，这对检测结果的准确性和可靠性造成很大影响。
主要原因有以下几方面：1. 操作不当ELISA是一种精密的检测方法，其中任何一步操作不当都可能导致结果失控。
例如抗原或抗体的配制、试剂的储存、反应条件的控制（温度、时间等）等方面的操作问题，都可能出现失控。
2. 抗体的选择ELISA检测AC抗体，关键在于选择合适的抗体，而不同的抗体的性能和特性差异较大，往往也决定了检测结果的准确性。
因此在抗体的筛选和鉴定过程中要十分谨慎，并进行适当的验证。
3. 抗原的纯度抗原的纯度是保证检测准确性的重要因素之一。
如抗原的纯度不足时，特异性抗体可能与零星分离的杂质靶分子结合，产生假阳性结果。
4. 污染ELISA的空白对照是保证负对照的有效手段。
但是，若在实验中发生技术上的污染，如盲样污染、实验器具污染等都可能导致假阳性结果等现象。
针对上述失控问题，相应的处理策略是：1. 操作人员与操作培训ELISA检测操作人员必须配备经验丰富、熟练掌握操作要点的人员。
培训尤其关键，可以借助模拟实验、调查方法、案例分析等方式，提高操作人员的技能、意识和责任心。
酶联免疫吸附试验影响因素探讨
酶联免疫吸附试验影响因素探讨【摘要】ELISA法具有灵敏高、特异性强、重复性好的特点。
被广泛用于临床上多种疾病的检查、诊断，但在标本的采集、试剂的质量、操作的程序、结果的判断等方面受人为的因素影响较多，为了确保ELISA的准确度和精密度，保证临床安全用血，笔者就实际工作中常见的试验影响因素进行了总结探讨。
1 标本的采集1.1 防止污染血液标本的采集做到一人一针一管，吸样时，必需使用一次性移液嘴，以防污染。
1.2 及时测定血样采集后应及时检测，久置后细胞代谢，细菌繁殖，增加了许多异性物质，易产生溶血。
如不能及时测定，应将标本血清分离后放置在4℃冰箱中保存，但不超过3 d。
1.3 避免稀释标本在留取时，不能采用被保养液(抗凝剂)稀释后的抗凝血进行测定，否则被检测物的浓度降低，结果出现假阴性。
2 试剂的影响2.1 目前卫生部国家药品生物制品研究所对国内应用甚广的ELISA试剂，按照国家标准实行“批批检”，凡合格者，贴上国家防伪标签才能使用。
如HBsAg、抗,HCV、抗,HIV抗体等。
2.2 不同批号、不同厂家的试剂，由于酶标记物中酶的浓度不尽相同，与固相载体上的相应抗原或抗体发生特异性反应的程度不同，故不能混合使用。
对于超过有效期的试剂则严禁使用。
2.3 试剂的运输、贮存要在低温(2～8℃)条件下进行。
因酶类物质是一种特殊的蛋白质，久置、反复冻融或受热后，酶易失去活性，合格试纸条如果一次用不完时，应进行密封保存防止受潮。
3 操作的要求3.1 不同厂家生产的试剂其样品加入量、水浴时间、阴阳对照等各不相同，应严格按照说明书中要求进行，吸样要准确，试剂加入的顺序不能颠倒，每一步加样后均需在振荡器上充分混匀。
3.2 洗涤的效果直接影响实验结果的准确性。
每次洗板之前要配制新鲜的洗涤液，室温较低时，洗涤液要在水浴箱中先预温30 min。
用洗板机进行洗板时，每次都要吸净孔内洗液且不能留有气泡，倾去洗液时，必需用吸水纸吸尽洗液。
酶联免疫吸附试验的常见影响因素及处理方法
成污染或效价降低 ， 可引起假 阴性 ， 因此应尽量 用新鲜标本 。 冰
冻标本应避免反 复冻融 ， 因冰冻标本 的反 复冻融产生的机械力
查找原因可能是这批试剂在进入科室前储存温度出现了问题，
与试剂商联 系更换新 的批号试 剂后 ， 此现象 消失 。
对标本中的蛋白分子有破坏作用 ， 可引起假 阴性鹳 。
箱 中取 出， 检测 时试剂盒可与室温平衡。 ２ 标本因素
吸附试验 。该试验用 已知抗原检测未知抗体 ， 或用 已知抗 体检
测未知抗原 ， 虽 然操作 简便 ， 但影响 因素诸多 ， 一个环节出现问 题， 都可能会导致检 测的失败 。现将 酶联免疫吸附试验常见影 响因素及处理方法总结如下。
酶联免疫 吸附试验 的常见影 响因素及处理方法
董 文婷
（ 夏县人民医院 ， 山西 夏县 Ｏ ４ ４ ４ Ｏ ０ ）
临床免疫室开展的乙肝系列 、 丙肝抗体 、 艾滋病抗体 、 梅毒
特异性检测等 日常检测工作 ， 最 为常用 的检测方法 为酶联免疫
疫 吸附试验 中， 试剂准备最关键的是使试剂盒在使用前 与室温 平衡 ， 以满足检测要 求 ， 一 般检测前 ３ ０ ｍ ｉ ｎ即应将试剂盒从 冰
的质量 ， 试剂盒从 出厂到用户手 中 ， 均要历 经运输 （ 如送检 、 检
定、 发货等 ） 及运输 中的储存 环节 ， 某一环节 不当 ， 均影 响试 剂 盒 的临床使 用质量 。去年 我科有一段 时间所做 的表面抗 原项
目， 今天阳性 ， 同一份标本 明天复检有可能是弱 阳性甚 至阴性 ，
结 果 比 较 ｑ值 分 别 为 １ ． ９ ７ ， ２ ． ０ ４和 １ ． １ ２ ， Ｐ均 ＞ ０ ． Ｏ ５ 。
酶联免疫吸附试验的影响因素
酶联免疫吸附试验的影响因素酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用的实验技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。
它的原理是通过特异性抗体与抗原结合，再利用酶标记的二抗介导的颜色反应，来定量分析和检测目标物质。
在进行ELISA实验时，有多个因素会对实验结果产生影响，下面将详细介绍其中的几个主要影响因素。
1.试剂的质量ELISA实验的试剂质量对实验结果至关重要。
这包括酶标记抗体和底物酶的纯度、活性，抗原或抗体的纯度和浓度，以及稀释缓冲液的组成和pH值等。
选择高质量的试剂可以提高实验结果的准确性和重复性。
2.样本处理和储存条件样本的处理和储存条件也会对ELISA结果产生影响。
样本的收集、保存和处理方法需要标准化，以确保稳定性和一致性。
如血液或组织样本的离心速度、温度和时间等要控制一致。
另外，样本的冻结和解冻过程也需要避免反复，以防止损坏细胞结构和影响实验结果。
3.特异性抗体的选择ELISA实验需要选择特异性抗体与目标抗原结合。
抗体的选择要考虑其亲和力、特异性和纯度等特性。
如果抗体不够特异性，可能会导致非特异性结合和假阳性结果。
因此，在实验中选择合适的抗体对实验结果至关重要。
4.孵育条件和时间孵育条件和时间对ELISA实验结果也起着重要影响。
这包括孵育温度、时间和摇床的震荡速度等。
不同的试剂和实验需要不同的孵育条件。
孵育温度过高或过低，孵育时间太长或太短，都可能导致结果的偏差。
5.光度计的精度和校准ELISA测量实验结果时需要使用光度计，光度计的精度和校准对结果的准确性和可重复性至关重要。
定期检查和校准光度计以确保其准确性，并遵循使用指南来保持恒定的测量条件。
6.数据分析和计算ELISA实验得到的数据需要进行合理的分析和计算。
如对标准曲线进行拟合和计算待测样品的浓度等。
合理的统计分析和数据处理能够提高实验结果的可靠性。
论影响酶联免疫吸附试验结果的常见因素及控制方法
论影响酶联免疫吸附试验结果的常见因素及控制方法[论文关键词] 酶联免疫吸附试验；影响因素；控制方法论文摘要：酶联免疫吸附试验(enayme liked immunosorbent assay，ELISA)是20世纪70年代发展起来的一种检测技术，因其具有敏感性高、特异性强、操作简单等优点，被广泛应用于各种抗原和抗体的测定，为辅助临床诊断与生物科研起到了积极的推动作用。
但ELISA测定中影响因素较多，操作过程中每个环节都会对试验结果产生影响，出现错误的结果。
现笔者对影响实验结果的常见因素及相应的控制方法分析探讨如下：1 试剂的因素1.1 试剂的选择试剂的选择是保证血液检测质量的关键要素。
虽然国家采用批批检定的形式对ELISA 试剂严格把关，但不同厂家的试剂在使用效果上仍存在在差异。
要选购知名度相对高、具有“三证”的试剂，不要用无批号的试剂，最好选用与仪器配套的试剂。
更不要使用过期的试剂和混用不同批号的试剂。
1.2 试剂的准备在临床实验室，对试剂的准备一般不太注意，通常的做法是在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。
因此，在ELISA 测定中试剂的准备最为关键的是，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20～30 min后，再进行测定，使试剂盒在使用前与室温平衡，这样做的目的能使反应微孔内的温度较快地达到所需的温度，以满足后面的测定需求。
2 样本的因素2.1 内源性干扰因素包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体等[1]。
2.1.1 类风湿因子在类风湿患者及正常人血清中，常含有较高或不同浓度的类风湿因子(RF)，其一般为IgM 型，亦有IgG和IgA型，具有与变性IgG产生非特异结合的特点，因为在ELISA测定中，其可与固相上包被的特异抗体IgG 以及随后加入的酶标的特异抗体IgG结合，从而出现假阳性结果。
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影响酶联免疫吸附试验检测结果的原因分析及应对措施酶联免疫（EliSA）是检验科目前常用的免疫学检测方法之一，其操作方便、简单，不须要特殊设备，使其在各级医院都可应用。
但如果忽视了影响其结果的因素，难免会造成假阴性或假阳性的结果。
因此了解影响结果的因素，是减少差错事故发生很必要的。
1实验室操作人员的基本素质因素实验室人员的素质主要包括五个方面：思想素质、文化素质、技术素质、心理素质、身体素质。
因为我们是为人服务的，所以我们的职业道德水平直接关系到人们的生命健康和生命安全。
如果在工作中出现了张冠李戴，就有可能造成严重后果。
其次文化素质和技术素质很重要，我们必须熟练掌握本专业的基本理论和操作技术。
还要不断努力学习新的理论知识，努力提高业务水平。
有良好的心理素质勇于面对工作中的挫折，在繁忙工作中有条不紊。
所以人员素质问题对检验结果有重要的影响因素。
2标本处理因素实验室人员收到标本后应：“三查七对”，对不符合要求的标本和申请单拒收，合格标本及时分离血清，避免溶血。
提取血清时不能混有大量纤维蛋白或细胞成分，对不能及时检测的标本要妥善保存于4℃冰箱，做好原始记录。
从冰箱取出的标本要预温至室温，对冰冻的样品要融化好，充分混匀再用。
3操作过程的影响因素3.1 操作前应对实验的物理参数有充分的了解，如环境温度（保持在18～25℃），反应孵育温度和孵育时间、洗涤的次数等，各种条件必须符合要求。
3.2 正确使用加样器，加样器应垂直加入标本或试剂，避免摩擦包被板底部。
加样过程中避免液体外溅，血清残留在反应孔壁上，加样器吸头要一次性使用，加样次序要与说明书一致，否则易发生错误，造成实验重复性差。
3.3 手工洗板加洗液时冲击力不能太大，洗涤次数不超过说明推荐的次数，洗涤液在反应孔内滞留的时间不宜太长。
不要让洗液造成孔间污染，导致假阴性和假阳性。
3.4 要保证加液量一致，我们在使用时感觉加样器比滴瓶加样准确，滴瓶加液量不准造成显色不一，造成判断错误。
3.5 显色液的量不可过多，加样的工作环境不能阳光直射，加显色液后避光反应，显色液量要合适。
4试剂的影响因素应选用有国家批准文号，质量保证的产品。
试剂要妥善保存于4℃冰箱内，在使用时先恢复至室温，不同批号的试剂组分不宜交叉使用。
试剂打开后要在一周内用完，剩余试剂下次用时先检查是否变质，显色剂如被污染变化将造成全部显色，导致错误结果。
过期试剂不宜，应做好双份质控品的监测，确保结果的可靠性。
5采取措施，避免差错事故的发生创造一个良好的工作环境，实验室工作人员应团结友爱，互相关心，互相学习自然心情舒畅，工作情绪高涨。
再就是建立完善的质量保证体系，以书面的形式发给每位成员以及临床科室，做到人人熟悉，人人重视影响实验结果的因素，并在操作过程中时刻注意，将质控贯穿到整个实验过程中。
制定一系列的制度，用制度管人，明确责任，这样才能提高质量，避免错误结果的发生。
影响酶联免疫吸附试验检测结果的原因分析及应对措施【关键词】影响酶联免疫吸附试验原因分析应对措施酶联免疫吸附试验(ELISA)是将抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来，可敏感地检测生物标本中微量的特异性抗体或抗原的一种临床检验方法。
因其操作简单，灵敏度高，特异性好，达纳克水平，经济安全，不需要特殊设备等特点而在临床医学检验中得到广泛应用。
但是，在检验的实际操作过程中，由于各种客观和主观因素的影响，可能对检测结果产生误(漏)诊，直接影响临床医师正确诊断患者所患疾病和对患者病情的判断。
为此，本文对ELISA试验操作的各个环节中容易出现的问题和注意事项进行了如下总结，以提高临床检验质量。
1试剂的准备目前各种ELISA试验均有商品化的专用试剂盒。
应选择质量优良、有批准文号且在有效期内的检测试剂，严格按照试剂说明书进行实际操作。
从冰箱中取出的试剂应放在室温下或37℃平衡30min再进行测试。
保存试剂盒的冰箱应经常检查储存温度并做好记录，冰箱应避免频繁开关。
试剂使用前应摇匀。
2标本的采集和保存ELISA试验所用标本主要为血清，也可以用经过预处理的唾液、尿液、粪便等生物材料。
患者标本可能含有干扰试验的免疫物质，导致假阳性或者假阴性的结果，干扰因素一般可分为两类，即内源性和外源性干扰因素。
内源性干扰因素包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异性免疫球蛋白等，避免内源性干扰因素主要通过选择合理的试剂。
外源性干扰因素包括标本溶血、标本被细菌污染、储存时间过长及标本凝固等。
在血液采集和运输过程时，应注意避免溶血[1]。
否则，红细胞溶解时会释放出血红蛋白，血红蛋白中的亚铁血红素具有过氧化物酶活性的物质，在以HRP为标记的ELISA试验测定中，可能会增加非特异性显色而出现假阳性结果。
血清标本适宜在新鲜时检测，若推迟检测需将标本低温保存。
一般说来，在7天内检测的血清标本，可放置于2℃~8℃保存，超过1周检测的需低温冰存。
因反复冰融会使抗体效价降低，所以，对需要保存做多次抗体测定的血清标本，应少量分装并冰存。
血清标本应充分离心，否则可因残留的纤维蛋白原非特异吸附于微孔而造成假阳性结果。
3加样在ELISA试验操作中，依次有3次加样，即加标本、加酶结合物、加底物。
加标本一般采用手工加样或者加样器。
手工加样每次必须更换吸嘴，以避免交叉感染。
要掌握好并在实际操作中揣摩使用技巧，避免吸样量过多或过少。
加样器在长时间使用时会因机械磨损或推动杆内附着的血痂等原因造成加样不准，因此必须定期对加样器进行维护和校准。
加酶结合物和底物一般可直接滴加。
每次加样时，应将所加物置于ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，注意不可溅出，不能产生气泡，加酶试剂后要用吸水纸在酶标板上轻轻擦拭吸干。
加底物操作时应注意各试剂盒显色剂不能混用，添加顺序不能颠倒，不能溅出孔外。
标本较多时，需要分批操作，以免加样板过多，造成加样后放入孵箱前等待时间过长(尤其是在室温较高时)。
最后，在微型振荡器上震荡lmin，以保证混匀。
4温育ELISA反应是抗原、抗体的结合在固相表面上发生的一系列的反应，抗原抗体结合是一个逐步平衡的过程，需要经过扩散才能达到反应的终点，因此ELISA反应需要一定时间的温育。
温育也是影响检测结果的关键因素，尤其是对弱阳性标本影响最为明显[2]。
温育方式常采用温箱法、微波辐射法和水浴法。
其中水浴法能较好地解决因受热不均衡所致的周围孔与中央孔结果的吸光度差异(即“边缘效应”)。
温育常采用的温度是43℃、37℃、室温和4℃，其中最常用的是37℃，也是大多数抗原抗体反应的适合温度。
为了保证各板的温度能迅速平衡，可将反应板放在水浴箱中，漂浮在水面上，但反应板不应叠放。
为避免标本或稀释液蒸发而吸附于孔壁，反应板应加盖或贴封纸。
注意温育的温度和时间，应按规定力求准确无误。
因为孵育时间过长，可以出现非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底，导致花板。
5洗涤洗涤是ELISA不同于均相免疫学检测技术的一大特征，洗涤在整个ELISA反应过程虽不是一个反应步骤却非常关键。
操作者应严格按照要求洗涤，因为ELISA试验就是依靠洗涤来达到分离游离的酶标记物和结合的酶标记物的目的。
通过洗涤，可以清除残留在板孔中没有与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。
采用自动洗板机洗板，洗板机设置时间、间隔、次数要保持一致，不能过多或过少。
洗板次数较少，造成残留，引起假阳性结果。
洗板次数过多，可造成抗原抗体结合物洗脱，造成假阴性结果[3]。
要保证洗液注满各孔，防止在反应孔中形成气泡而造成洗涤不充分。
洗板结束后，最好在干净无尘的吸水纸上轻轻拍干。
如洗液量不足可致洗板不彻底，洗板针堵塞，抽吸不完全，洗板不畅，导致洗板效果差。
6显色显色是ELISA试验中最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。
反应的温度和时间仍是影响显色的因素。
适当提高温度，有助于加速显色。
在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。
在定量检测中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。
ELISA显色结果最好通过酶标仪进行，可减少实验误差，提高临界值样本的分析准确度。
尽量避免肉眼直接判断结果，因为不同个体的视觉存在差异。
应注意，加显色剂时，要保持显色剂不外流。
加终止液时应避免产生较多气泡，否则可能使假阳性结果的出现概率增加。
7比色比色的方法有目视法和酶标比色法2种。
目视法简单明了，但对同一标本，操作者的不同有时会出现不同的结果，具有一定的主观性。
比色的结果通常用光密度表达，现按规定用吸光度表达。
酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时的适宜室温在15℃~30℃之间，使用前要先预热仪器15~30min，使测得结果更为准确。
比色前，应先用洁净的吸水纸擦拭干净板底附着的液体，然后将板正确放在酶标比色仪的比色架上。
综上所述，优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。
在实际应用过程中，操作者必须熟练掌握基本操作技能，对每个环节进行严格仔细的核查，尽量避免假阳性和假阴性反应的出现，保证检测结果真实可靠，为临床诊断和疾病防治提供可靠的理论依据。
【参考文献】1孙鑫，陈彦，张继瑜，等.不同程度溶血对ELISA法检测血清HBVM的影响.世界感染杂志，2004，4(2)：174-176.2徐锡霞，邓巍. 温育条件对ELISA定性测定HBsAg结果的影响.实用肝病杂志，2005，8(1)：16-18.3刘祖勇. 增加洗板次数对HBsAg ELISA检测影响.中国输血杂志，2006，19(2)：135-136.。