酶联免疫吸附实验常用方法
酶联免疫吸附实验常用方法
1.间接法
检测抗体最常用的方法, 主要用于对病原体抗体的检测。
优势：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它最多的免疫反应性。
缺点：交互反应发生的机率较高
2.双抗体夹心法
检测大分子抗原最常用的方法。
优势：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化。
缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。
3.竞争法
检测小分子半抗原（药物、激素等）。
优势：可适用比较不纯的样本，而且数据再现性很高。
缺点：整体的敏感性和专一性都较差。
酶联免疫吸附试验
实验三酶联免疫吸附试验（ELISA） 一、实验目的 了解ELISA的基本原理，掌握间接ELISA方法的原理与操作步骤。 二、实验原理 将抗原或抗体固化于某种载体的表面，并保持其免疫活性，加入待检血清（抗体），然后加入与其相对应的既有酶活性又有免疫活性的酶标抗体或抗原，它们之间反应后，通过洗涤去掉未结合的标记物。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，酶的降解底物和呈现的色泽在一定条件下是呈正比的，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析，因此可用分光光度计进行测定，计算出参加反应的抗原或抗体的含量，从而达到测定抗原或抗体的目的。 常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色 辣根过氧化物酶（HRP） RZ>3.1 碱性磷酸酶（AP） 邻苯二胺（OPD） 四甲基联苯胺（TMB） 对硝基苯磷酸酯（p-NPP） 橙黄色 蓝色 黄色 棕黄色 黄色 黄色 根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。常用的三种类型： 1、间接法测抗体（间接ELISA）
间接法用于测定抗体。它的原理是将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。 2、双抗体夹心法（双抗夹心ELISA） 双抗体夹心法用于检测抗原。它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。操作：将抗体吸附于固相表面；加抗原，形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物。底物的降解量＝抗原量。 3、竞争ELISA 竞争法既可用于检测抗原又可用于检测抗体。它是用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。 三、主要仪器及试材 以伪狂犬全病毒（PRV）间接酶联免疫吸附试验（PRV－ELISA）为例。 使用猪伪狂犬抗体检测试剂盒。本试剂盒含: 1、包被抗原的微孔板； 2、阴、阳性对照血清； 3、抗猪IgG-HRP结合物； 4、洗涤液； 5、底物A液、B液； 6、终止液； 7、样品稀释液 本实验所需仪器和试剂： 1、酶联免疫测定仪 2、已包被抗原（Ag）的酶标板（PRV蛋白） 3、血清：PRV阳性血清、PRV阴性血清、待检样品血清 4、酶标抗体（E-Ab）：兔抗猪IgG-HRP 5、包被液（0.025mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液）： 1.59g NaCO 3，2.93g NaHCO 3 ，加 ddH 2 O至1000mL 6、洗涤液（0.05% Tween-20的PBS（pH7.4））： 8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na 2HPO 4 ·12H 2 O，0.2g KH 2 PO 4 ，0.5mL吐温-20（Tween-20），加ddH 2 O至1000mL。 7、保温液（含0.1% BSA 的洗涤液）：0.1g 牛血清白蛋白（BSA），洗涤液100mL
酶联免疫吸附实验
酶联免疫吸附实验 一、实验目的 1、用间接竞争酶联免疫吸附实验（ELISA法）测定多抗血清(pAb)敏感性，从而 筛选出融合备用鼠融合前3～5d腹腔注射OTA的计量。 2、采用间接ELISA 法测定pAb效价，采用阻断ELISA法鉴定pAb敏感性，从 而筛选出效价高且IC50（赭曲霉毒素A（OTA）多抗血清对OTA的50%抑制浓度）低的小鼠做细胞融合备用鼠。 3、用间接ELISA 和间接竞争ELISA 筛选出效价高、敏感性好、细胞生长旺盛 的杂交瘤细胞株。 4、采用间接ELISA 法测定单克隆抗体效价，采用阻断ELISA法测定单克隆抗 体敏感性，采用间接ELISA 检测方法进行单克隆抗体同种型及亚类鉴定。 二、实验原理 ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。 ELISA法根据种类和变化可分为以下几类：双抗体夹心法、间接法、竞争法、阻断法双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。 在本实验中应用了间接法、阻断法和竞争法，利用酶分子与小鼠血液中的抗体共价结合，在底物的作用下，产生颜色反应，通过颜色的深浅筛选出融合备用鼠融合前腹腔注射OTA的计量和效价高且IC50低的小鼠做细胞融合备用鼠。 三、实验试剂与器材 1、实验试剂 在本测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂） 在此实验中所采用的免疫吸附剂是1μg/mL OTA-OV A；标记物是1:1000 倍用含5% 猪血清的PBST 稀释的50μL/ 孔的GAM-IgG-HRP；显色剂是50μL/ 孔的T M B OTA、牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OV A)、小鼠单抗同种型检测试剂盒美国Sigma公司； 碳化二亚胺(EDC)英国Thermo Scientific 公司； 弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、基础培养基1640、选择培养基HAT、HT、PEG21500美国Invitrogen公司； 羊抗鼠酶标二抗(GAM-IgG-HRP)华美生物工程有限公司； 实验用水为重蒸去离子水
酶联免疫吸附测定法
酶联免疫吸附测定法（ELISA） 1.定义 (3) 2.原理 (3) 2.1抗原抗体反应 (3) 2.2免疫测定在临床检验中的应用 (5) 3.ELISA的类型 (5) 3.1双抗体夹心法测抗原： (6) 3.2双抗原夹心法测抗体 (6) 3.3间接法测抗体 (6) 3.4竞争法测抗体 (7) 3.5竞争性测抗原 (7) 3.6捕获包被法测抗体 (7) 3.7ABS-ELISA法 (8) 4.ELISA试剂的组成 (9) 4.1固相载体： (9) 4.2包被的方式 (9) 4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。 (10) 4.4包被的条件： (10) 4.5洗涤液： (10) 4.7酶的催化性； (11) 4.8结合物的制备 (11) 4.9结合物的保存 (12) 4.10酶的底物 (12) 4.11酶反应终止液 (12) 4.12参考标准品 (13) 4.13加样： (13) 4.14保温 (13)
4.15保温方式： (13) 4.16室温温育的反应 (13) 4.17洗涤 (14) 4.18显色 (14) 4.19比色 (14) 4.20酶标比色仪 (15) 4.21结果判定 (15) 4.22定量测定 (16) 4.23ELISA的操作要点 (16)
1.定义 酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。 2.原理 采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。 2.1抗原抗体反应 2.1.1可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为： Ag+Ab→Ag·Ab 抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原和抗体均能保持原有的结构和活性。 2.1.2特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。因此，在很多时候，测定某一特定的物质不需分离待测物。2.1.3最适比例 只有当抗原抗体的浓度比例是当时，才出现可见反应。 以沉淀反应为例（Ab量固定，Ag量递增）
酶联免疫吸附试验(双抗夹心法)原理
酶联免疫吸附试验（ELISA），又称酶联免疫吸附测定法，是目前广泛用于生物化学和免疫学领域的一种重要实验方法。该技术结合了免疫 学和生物化学的原理，能够高灵敏、高特异地检测抗原或抗体的存在，对临床诊断、生物医学研究以及生物制药等领域有着广泛的应用。在 本文中，我们将深入探讨酶联免疫吸附试验的原理、方法和应用。 一、酶联免疫吸附试验原理 酶联免疫吸附试验的原理主要是利用酶标记抗体、抗原和底物的相互 作用来检测特定物质的存在。在双抗夹心法中，试验基本步骤如下： 1. 用待测抗原溶液在固相酶标记抗体包被的微孔板上，充分接触和结合。 2. 经洗涤后，底物溶液被加入，并与酶标记抗体包被的复合物结合。 3. 底物受酶催化分解后，生成有色产物，通过比色法测定其光密度， 间接测定抗原的含量。 在实验过程中，我们不能忽视的是标本处理、试剂选用、仪器操作等 一系列实验细节，这些都对实验结果的准确性和重复性有着重要的影响。 二、酶联免疫吸附试验的方法 不同类型的酶联免疫吸附试验方法包括间接法、夹心法、竞争法和直 接法等。在这次我们重点讨论的是双抗夹心法。该方法通过将待测抗
原与固相酶标记抗体和液相抗体结合，从而提高了对待测抗原的灵敏度和特异性。这种方法在免疫学研究、传染病诊断和药物检测等方面具有重要的应用价值。 除了双抗夹心法，间接法通过检测待测抗体也是常用的酶联免疫吸附试验方法。在实验设计中，根据不同的研究目的和样本特性，我们可以选择不同的方法来进行实验设计和操作。 三、酶联免疫吸附试验的应用 酶联免疫吸附试验在临床诊断、疫苗研制、传染病监测、生物药品开发等领域有着广泛的应用。它能够高灵敏、高特异地检测抗原或抗体的存在，为疾病诊断和药物研发提供了重要的技术支持。 在临床诊断中，酶联免疫吸附试验被广泛应用于传染病的早期诊断和鉴定。HIV抗体检测、甲型肝炎抗原检测等都是通过酶联免疫吸附试验来完成的。酶联免疫吸附试验还被应用于药物和疫苗的开发和监控过程中，能够全面地评价新药和疫苗的免疫原性和保护效果。 四、个人观点和理解 酶联免疫吸附试验作为一种成熟的实验技术，其在生物医学领域的广泛应用为我们提供了便利。在未来的研究和实践中，我认为酶联免疫吸附试验会进一步得到发展，不仅在技术上实现更高的灵敏度和特异性，同时也会在实验设计和数据分析上做出更多的创新。
酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附试验ELISA 一种酶联免疫技术。用于检测包被于固相板孔中的待测抗原(或抗体)。即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。 酶联免疫吸附试验(以下简称ELISA) ：是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体( 聚苯乙烯微量反应板) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。 ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体
由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。目前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。 1.辣根过氧化物酶（HRP） 过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%），分子量约40 000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH 3-9，催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH 5左右。
酶联免疫吸附(ELISA)实验具体步骤及详细说明
酶联免疫吸附(ELISA)实验具体步骤及详细说明 酶联免疫吸附(ELISA )可以:(1)免疫酶染色各种细胞内成份的定位o(2)研究抗酶抗体的合成。(3 )显现微量的免疫沉淀反应。(4 )定量检测体液中抗原或抗体成份。 本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体Z经洗涤后加入含有抗原之待测样品,如待检样品中有相应抗原存在,即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合Z经保温孵育洗涤后,即可加入酶标记特异性抗体,再经孵育洗涤后,加底物显色进行测定Z底物降解的量即为欲测抗原的量。 这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位,因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用Z而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定。我们用在霍乱肠毒素的测定。HbSAg及HbS 的测定。 具体步骤 —、包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度(1 ~ 10 ug /ml),每凹孔加0.3 ml , 4°C过夜Z或37。C水浴3小时,贮存冰箱。 二、洗涤：移去包被液Z凹孔用洗涤缓冲液(含0.05%吐温-20 )洗3次，每次5分钟。 三、每凹孑I J加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37°C作用1~ 2小时。
四、洗涤：移去包被液Z凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20 ）洗3次，每次5分钟。 五、加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液,37。C作用1 ~ 2 小时或由预试实验确定作用时间。 六、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20 ）洗3次，每次5分钟。 七、加入0.2ml底物溶液于每个凹孔（OPD或OT）,室温作用30分钟（另作一空白对照，0.4 ml底物加0.1 ml终止剂）O 八、加终止剂：每凹孔加2M H2SO4或2 M柠檬酸0.05 ml o 九观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（OPD用492nm ）OD值。 注意事项 L可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式,这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖甘、琼脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELlSA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。 2.包被所用的抗原必须是可溶性的,而且要求是优质和稳定的制剂,纯度和免疫原性
酶联免疫的操作方法
酶联免疫的操作方法 酶联免疫是一种常见的免疫测定方法，常用于检测抗原或抗体的存在和浓度。其操作方法如下： 1. 抗原包被：首先，将待检测样品中的抗原加入到含有特异性抗体的孔或固相载体表面，通过吸附或共价键结合的方式，将抗原固定在孔或固相载体上。这样做是为了使抗原与特异性抗体充分结合，形成抗原-抗体复合物。 2. 洗涤：将包被好的板子或固相载体进行洗涤，去除非特异性结合物，减少误差的发生。 3. 反应：将与抗原-抗体复合物结合的二抗（或识别抗体）加入孔或固相载体中，与复合物发生特异性结合。该二抗预先被连接上与酶（通常是辣根过氧化物酶HRP）结合的分子，因此称之为辣根过氧化物酶标记的二抗。 4. 洗涤：将孔或固相载体进行洗涤，去除非特异性结合物。 5. 底物添加：将染色底物加入孔或固相载体中，底物在酶的作用下，发生可见的颜色反应。该底物通常是染色体底物或亚硝酸4-硫酸钠。 6. 反应停止：通过加入酸或碱，停止底物的反应，并阻止底物继续发色。
7. 反应评估：测量底物反应产生的颜色强度或发光强度，使用光度计或发光仪等设备进行测定。 酶联免疫方法优点如下： - 高灵敏度：酶标记可提供较强的信号，使检测到的目标物浓度可达到可靠的程度。 - 特异性：通过使用具有特异性的抗体或抗原，酶联免疫能够准确检测目标物。- 简单易行：操作相对简单，无需复杂的实验条件和设备。 - 可量化：根据底物反应的强度，可以定量测定目标物的含量。 - 高通量：酶联免疫可同时处理多个样品，提高工作效率。 然而，酶联免疫也有一些局限性，例如： - 检测范围受限：传统的酶联免疫方法通常只能在较低至中等浓度范围内进行可靠的检测，对于高浓度的目标物可能不敏感。 - 受干扰物影响：某些样品中可能含有干扰物质，如脂质、乳糖、硫醇等，它们可能影响酶的活性或干扰底物的测定。 - 特异性限制：一些高度相似的抗原或抗体可能导致交叉反应，从而降低特异性。 总的来说，酶联免疫是一种常用的免疫测定方法，通过将抗原或抗体固定在固相载体上，并利用酶的催化反应使其产生可见的颜色或发光信号，从而实现对目标物的检测和定量。该方法操作简单，具有高灵敏度、特异性和可量化等优点，广
elisa常用方法
elisa常用方法 酶联免疫吸附测定(ELISA)为免疫学中的经典实验。下面是店铺为您带来的elisa常用方法，希望对大家有所帮助。 elisa常用方法：双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法。夹心法利用两种一抗对目标抗原进行捕获和固定，在确保灵敏度的同时大大提高了反应的特异性，该方法的检测灵敏度可提高到pg级的水平。将已知抗体包被到固相表面，加入待检标本，标本中若含有相应抗原即与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合成分，加入该抗原特异的酶标记抗体，洗去未结合的酶标记抗体，加底物后显色。若标本中无相应抗原，固相表面即无抗原结合，加入的酶标记抗体则不能结合于固相并被洗涤去除，当加入无色底物后，因无酶催化故不显色。双抗体夹心法适用于测定2价或2价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。 elisa常用方法：间接法 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。先将待测的蛋白包被在孔板内，然后依次加入一抗、酶标记的二抗和底物显色，通过仪器(例如酶标仪)定量检测抗原。这种方法操作简单但由于高背景而特异性较差，目前已逐渐被夹心法取代。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标二抗建立检测相应抗体的方法。间接法成功的关键在于抗原的纯度。间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体。 elisa常用方法：竞争法 竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中?体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被于固相。如抗原
酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理
酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 是一种常用的生物化学分析方法，用于检测并定量测定生物样品中的抗体 或抗原。ELISA方法包括直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞 争ELISA等。下面将对这些方法的类型和反应原理进行详细介绍。 1.直接ELISA 直接ELISA是最简单的ELISA方法之一、在这种方法中，微孔板表面 上涂覆有抗原，然后加入待检测样品，如血清等。待检测样品中的抗体与 涂覆的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。然后加入特异性抗体，这些抗 体已标记有酶，比如辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP），然后加入适当的底物。酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与 待测样品中抗原或抗体的浓度成正比。 2.间接ELISA 间接ELISA是常用的ELISA方法之一，比直接ELISA灵敏度更高。在 这种方法中，微孔板表面上涂覆有抗原，然后加入待检测样品，如血清等。待检测样品中的抗体与涂覆的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。然后加 入与待测抗体特异性的二抗，这些二抗已标记有酶，如HRP，再加入适当 的底物。酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与待测样品中抗 原或抗体的浓度成正比。 3.竞争ELISA 竞争ELISA是一种用于测定样品中抗原或抗体浓度的ELISA方法。在 这种方法中，微孔板表面上涂覆有特异性抗体，然后加入待检测样品和已 标记的抗原或抗体。待检测样品中的抗原或抗体与涂覆的抗体竞争结合，
形成复合物。然后加入特异性的抗原或抗体，这些抗原或抗体已标记有酶，比如HRP，继续竞争与涂覆抗体结合。酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与待测样品中抗原或抗体的浓度成反比。 4.间接竞争ELISA 间接竞争ELISA是一种用于测定样品中抗原或抗体浓度的高灵敏度ELISA方法。在这种方法中，微孔板表面上涂覆有抗原。首先，加入待检 测样品和已标记的抗原或抗体。待检测样品中的抗原或抗体与特异性抗体 竞争结合，形成复合物。然后加入未标记的特异性抗体，再加入已标记的 二抗，如HRP，继续竞争与涂覆抗原结合。酶与底物反应产生比色或荧光 信号，信号的强度与待测样品中抗原或抗体的浓度成正比。 ELISA的反应原理是利用抗原与抗体之间的特异性结合反应。ELISA 的微孔板表面通常涂覆有抗原或抗体，待检测样品中的抗体或抗原与涂覆 的物质结合形成复合物。经过清洗步骤，加入与样品中的抗体或抗原特异 性结合的二抗，这些二抗已标记有酶。然后加入适当的底物，底物与酶反 应产生比色或荧光信号。这些信号的强度与待测样品中抗体或抗原的浓度 成正比，通过比色或荧光检测设备可以定量测定待测样品中抗体或抗原的 浓度。 总的来说，ELISA是一种简单而有效的生物化学分析方法，广泛应用 于医学诊断、生物学研究、药物研发等领域。不同类型的ELISA方法有不 同的适用范围和优势，可以根据具体实验需求选择合适的方法进行检测和 分析。
酶联免疫吸附实验的原理及分类
酶联免疫吸附实验的原理及分类 酶联免疫吸附实验的原理及分类如下 原理：将抗原包被在固相载体上，加入待测样本形成固相抗原-受检抗体复合物；经温育洗涤后，加入酶标二抗，常用羊抗人IgG，在固相上即形成固相抗原-待测抗体-酶标抗抗体复合物，加入底物后根据显色的深浅确定待测抗体含量。多用于检测IgG类型抗体。 分类如下 1.间接法：最常用的方法，属非竞争性结合试验。原理：将抗原包被在固相载体上，加入待测样本形成固相抗原-受检抗体复合物；经温育洗涤后，加入酶标二抗，常用羊抗人IgG，在固相上即形成固相抗原-待测抗体-酶标抗抗体复合物，加入底物后根据显色的深浅确定待测抗体含量。多用于检测IgG类型抗体。 2.双抗原夹心法 此法可检测各类抗体，因此双抗原夹心法的灵敏度和特异性要高于间接法。其原理及操作步骤类似双抗体夹心法，也可采用一步法。由于机体产生抗体IgG的效价有限，一般不会出现钩状效应。 临床上乙型肝炎表面抗体的测定常用此法。 3.竞争法 一般抗体检测是较少采用，当相应抗原材料中含有与抗人IgG 反应的物质，而且不易得到足够的纯化抗原或抗原的结合特异性不稳定时，可采用这种方法测定抗体，目前临床运用较多的是乙型肝
炎病毒核心抗体（HBcAb）和乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）的检测。 竞争抗体与待测抗体的特异性及亲和力越接近，则测定的可靠性越强。 4.捕获法又称反向间接法 主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定，最常用的是病原体急性感染诊断中的IgM型抗体。原理：先将针对IgM的二抗包被于固相载体，加入待测标本，其中IgM类抗体可被固相抗体捕获，再加入特异性抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标记特异性抗原的抗体，形成固相二抗-IgM-抗原-酶标记抗体复合物，加底物显色后，即可对待测标本中IgM是否存在及含量进行测定。
abc elisa原理
abc elisa原理 ABC ELISA原理 ABC ELISA（Avidin-Biotin Complex Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的酶联免疫吸附实验方法，用于检测特定抗原或抗体的存在。该方法利用亲合性较高的生物素与亲合性较高的亲和素（例如抗体）结合，形成稳定的复合物，从而实现对目标分子的检测。 ABC ELISA的原理是基于酶标记的间接免疫法。在实验中，首先将待测样品加入到酶标板孔中，使目标抗原或抗体与酶标抗体结合。然后，通过一系列洗涤步骤去除未结合的物质，以减少背景信号的干扰。 接下来，加入生物素标记的二抗（biotinylated secondary antibody）。生物素与亲和素（例如亲和素化酶标抗体）结合，形成稳定的复合物。这样，目标分子就被生物素标记，便于后续的检测。 随后，加入辣根过氧化物酶标记的亲和素（例如辣根过氧化物酶标记的亲和素化酶标抗体）。辣根过氧化物酶（HRP）能够与生物素结合，在酶标抗体的作用下，HRP会与基质反应产生显色产物。 加入底物溶液，通过底物与HRP的反应，产生可见的颜色变化。根
据颜色的强度可以判断样品中目标抗原或抗体的含量或活性。 ABC ELISA方法具有高灵敏度、高特异性和较低的背景信号，被广泛应用于医学、生物学和生物化学等领域。它可以用于检测血清中的抗体水平、病毒或细菌感染的诊断以及药物研发等。 然而，ABC ELISA方法也存在一些限制。首先，该方法需要多个步骤和试剂，操作较为繁琐，需要一定的实验技术。其次，由于标记物的加入，可能会影响目标分子的结构和活性，造成检测结果的偏差。此外，该方法对样品的处理和存储条件要求较高，以避免样品中其他物质的干扰。 ABC ELISA是一种常用的酶联免疫吸附实验方法，通过亲合素的结合和酶标记的作用，实现对特定抗原或抗体的检测。该方法具有高灵敏度和高特异性，被广泛应用于生命科学研究和临床诊断中。尽管存在一些限制，但ABC ELISA仍然是一种重要的实验方法，为科学研究和医学诊断提供了有力的工具。
间接酶联免疫吸附试验(间接elisa)
附件2：间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA） 1．操作步骤： 1.1 血清用PBS 稀释液按1:400、1:800、1:1600、1:3200 稀释。 1.2 取包被钩体抗原的酶标板，将稀释好的阳性血清、阴性血清及样本血清分别加入酶标板 孔中，每孔100^1同时加入2孔空白对照（PBS）。 37C 60分钟，弃去孔中液体。矚慫润厲钐瘗睞枥庑赖賃軔。 1.3洗板，于酶标板每孔加入洗涤液250卩,1洗板3次。 1.4每支酶标羊抗人IgG用0.5ml三蒸水充分溶解均匀后，再用PBS按1:50 稀释，每 孔加稀释好的酶结合物100卩。放置37C 40分钟。聞創沟燴鐺險爱氇谴净祸測。 1.5 洗板：洗板4 次（方法同1.3）。 1.6显色与终止：加底物液A、底物液B各1滴。室温避光显色，10分钟后，每孔加终止液 1 滴，终止反应。残骛楼諍锩瀨濟溆塹籟婭骒。 1.7采用波长405nm的酶标仪测定OD值，阴性OD值X 2.1作为判定界值。检测样本的OD 值昂比判定界值则为阳性。酽锕极額閉镇桧猪訣锥顧荭。 2．试剂配制： 2. 1 洗涤液（PBST，pH7.4）： NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g Na2HPO4.12H2O 2.9g KCl 0.2g Tween 20 0.5ml 硫柳汞0.1g D2H2O 至1000ml 2. 2 稀释液(PBS，pH7.4): NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g Na2HPO4.12H2O 2.9g KCl 0.2g 硫柳汞0.1g D2H2O 至1000ml 2. 3 底物液A（0.1M 柠檬酸-0.2M 磷酸氢二钠缓冲液，0.06%过氧化氢脲，pH 5.0-5.4）彈贸摄尔霁毙攬砖卤庑诒尔。 Na2HPO4.12H2O 36.82g 9.2g 柠檬酸.H2O 10.21g 2.55g 过氧化氢脲0.6g 0.15g D2H2O 至1000ml 250ml 2. 4底物液B（3、3'、5、5' T甲基联苯胺，TMB，作用时终浓度0.1mg/ml） 2．4．1 TMB 贮存液 TMB 贮存液（50mg/ml） TMB 150mg 二甲基亚砜3ml 注意事项：TMB 不易溶解，缓慢加入二甲基亚砜中并不断摇晃或搅拌，水浴适当加热可加速溶解。 2. 4. 2 底物液B 柠檬酸.H2O 1.05g 0.263 EDTA-Na2 (EDTA) 0.146g 0.0365 g D2H2O 至1000ml 250ml TMB 贮存液(50mg/ml) 4ml 1ml 2. 5 终止液：2M H2SO4
酶联免疫吸附实验技术的使用教程
酶联免疫吸附实验技术的使用教程 酶联免疫吸附实验技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用的生物学实验技术，用于检测特定蛋白质或其他生物分子在样本中的存在和浓度。它具有高灵敏度、特异性强、操作简单、快速等优点，被广泛应用于医学诊断、生物学研究和药物研发等领域。本文将为您介绍酶联免疫吸附实验技术的基本原理、步骤和注意事项，以帮助您正确使用该技术。 一、基本原理 酶联免疫吸附实验技术基于免疫学原理，利用抗原与抗体之间的特异性结合反应进行测定。关键步骤包括抗原吸附、抗体结合、酶标记物检测和信号生成。 1. 抗原吸附 将待测物质（通常为蛋白质）吸附到固相载体上，常用的载体有微孔板、磁珠等。将待测样本加入载体，通过吸附作用使样本中的抗原固定在载体表面。 2. 抗体结合 在抗原吸附之后，加入与待测物质特异性结合的抗体，与待测物质形成免疫复合物。该抗体通常被称为一抗，它可以与待测物质的特定表位结合。 3. 酶标记物检测 加入与一抗结合的二抗，二抗的产生可以使用不同的方式，最常见的方式是将二抗与酶（如辣根过氧化物酶HRP）结合。该二抗被称为酶标记物。酶标记物可以与一抗结合的免疫复合物发生结合，形成一抗-酶标记物-二抗的三联复合物。 4. 信号生成
加入底物（通常为染色底物），酶标记物与底物发生反应，产生可见的颜色变 化或荧光。底物被酶催化后，形成染色产物，其量与待测物质的浓度成正比。通过颜色变化或荧光强度的定量测定，可获得待测物质的浓度。 二、实验步骤 酶联免疫吸附实验技术的基本步骤包括涂布、包被、结合、洗涤、检测和分析。 1. 涂布 将待测样本加入微孔板的孔中，使待测物质与孔壁的固相载体进行特异性吸附。一般需在恒温条件下孵育孔板，以确保充分的吸附。 2. 包被 在涂布后，加入与待测物质特异性结合的一抗，使其与待测物质形成免疫复合物。一抗待定时间后，将其洗去，以去除未与待测物质结合的抗体。 3. 结合 加入酶标记的二抗，使其与一抗结合，并形成一抗-酶标记物-二抗的三联复合物。待一定时间后，将未结合的二抗洗去。 4. 洗涤 在包被和结合过程中，通过洗涤步骤去除未结合的物质，以减少非特异性的结合。洗涤液的选择和洗涤次数的控制都对实验结果有重要影响。 5. 检测 加入底物，酶标记物与底物发生反应，产生可见的颜色变化或荧光。反应时间 的控制对结果的准确性至关重要。 6. 分析
酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附实验（ELISA）要点 1 免疫吸附剂 已包被抗原或抗体的固相载体在低温（2~8℃）干燥的条件下一般可保存6个月。有些不完整的试盒，仅供应包被用抗原或抗体，检测人员需自行包被。以下简述固相载体和包被过程。 2 固相载体 固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。 ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。为便于作少量标本的检测，有制成8联孔条或12联孔条的，放入座架后，大小与标准ELISA板相同。ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的ELISA检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加，应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增多，但用于间接法测抗体时空白值较大。 良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大，因此，每一批号的ELISA板在使用前须事先检查其性能。 常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG（一般为10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差，应小于10%。 与聚苯乙烯类似的塑料是聚氯乙烯。作为ELISA固相载体，聚氯乙烯的特点为质软板薄，可剪割，价廉，但光洁度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。 为比较不同固相在某一ELISA测定中的优劣，可应用如下的试验：用其他免疫学测定方法选出一个典型的阳性标本和阴性标本，将它们进行一系列稀释后，在不同的固相载体上按预定的ELISA操作步骤进行测定，然后比较结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果差别最大，这种载体就是这一 ELISA测定项目的最合适的固相载体。 在ELISA中，用作固相载体的小珠一般为直径0.6cm的圆珠，表面经磨砂处理后吸附面积大大增加。ELISA板孔的吸附面积约为 200mm2，小珠均为1000mm2，将近ELISA板孔的5倍。吸附面积的增大即意味着固相抗原或抗体量的增加。再者，球型小珠的表面弧度更有利于吸附的抗原决定簇或抗体结合位点的暴露面处于最佳反应状态，因此珠式ELISA的反应往往更为灵敏。小珠的另一特点是更易于使洗涤彻底，使用特殊的洗涤器，使小珠在洗涤过程中滚动淋洗，其洗涤效果远较板孔的浸泡式为好。但由于磨砂工艺的难度较大，小珠的均一性较差。 小试管作为固相载体也有较大的吸附表面，而且标本的反应量也相应增加。板式及珠式ELISA的标本量一般为100-200ul，而小试管可根据需要加大反应体积，标本反应量的增加有助于试验敏感性的提高。小试管还可以当作比色杯，最后直接放入分光光度计中比色。 也有应用聚苯乙烯胶乳或其他材料制成的微粒作为ELISA固相载体的。其优点是表面积极大，反应在悬液中进行，其速率与液相反应近似。以含铁的磁性微粒作为ELISA固相载体，