2015年版中国药典微生物限度检查方法验证方案

人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案1. 概述2. 验证目的和范围3. 组织及职责4. 验证进度计划表5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认7. 验证项目和验证方法7.1试验菌株7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证一离心沉淀-薄膜过滤法7.5控制菌检查方法验证一离心沉淀-薄膜过滤法8. 偏差与漏项控制9. 验证报告会审1. 概述我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。

参照《中国药典》2015版四部附录1105:微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。

通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。

人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。

甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。

本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。

本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。

2. 验证目的和范围验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。

本验证方案采用3批按GMF要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。

3. 组织及职责3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。

验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。

3.2验证方案的培训验证方案在经质量负责人批准后，，由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，并将该次的培训记录归档。

3.3验证方案实施过程中的变更和偏差验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。

3.4验证工作小组成员表4. 验证进度计划表本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是2015年12月至2016年1月。

5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认5.1. 主要检验仪器设备确认表: 52验证所需文件的确认表检查人/日期：复核人/日期:6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认6.1. 试验菌种检查表检查人/日期: 复核人/日期:复核人/日期:7. 验证项目和验证方法7.1试验菌株人工牛黄甲硝唑胶囊需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证所用的菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；控制菌检查方法验证所用的菌株为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌。

试验菌株的传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。

7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中，30〜35C培养18〜24小时，取此培养液1ml加0.9 %无菌氯化钠溶液9ml，采用10 倍递增稀释法，稀释至10-5〜10-7,制成50〜100cfu/ml的菌悬液备用。

接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml沙氏葡萄糖液体培养基中，20〜25C培养2〜3天，取此培养液1ml加0.9 %无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5〜10-7，制成50〜100cfu/ml的菌悬液备用。

接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面上，20〜25C培养5〜7天，直到获得丰富的孢子。

力口入3〜5ml含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将抱子洗脱，吸至无菌试管中，取1ml加含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5〜10-7,制成50〜100cfu/m的孢子悬液备用。

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2〜8C,可在24小时内使用。

黑曲霉孢子悬液可保存在2〜8C,在验证过的贮存期内使用。

验证时，对各试验菌的回收率逐一进行验证。

7.3. 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.3.1. 供试液的制备取供试品10g,加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml，振摇，制成1：10的供试液。

7.3.2. 试验组取1 : 10的供试液1ml和7.2项下制备的50〜100cfu的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注不超过45C的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。

置30〜35C培养箱中培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。

另取1: 10的供试液1ml和7.2项下制备的50〜100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，立即倾注不超过45C的沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。

置20〜25C培养箱中培养5天，点计菌落数。

7.3.3. 供试品对照组取1 : 10的供试液1ml注入平皿中，立即倾注不超过45C的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，平行制备2个平皿。

置30〜35 C培养箱中培养5天，点计菌落数。

另取1 : 10的供试液1ml注入平皿中，立即倾注不超过45 C的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀，平行制备2个平皿。

置20〜25 C培养箱中培养5天，点计菌落数。

7.3.4. 菌液对照组取0.9%无菌氯化钠溶液1ml和7.2项下制备的50〜100cfu的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注不超过45 C的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。

置30〜35 C培养箱中培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。

另取0.9%无菌氯化钠溶液1ml和7.2项下制备的50〜100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，立即倾注不超过45C的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。

置20〜25C培养箱中培养5天，点计菌落数。

7.3.5. 常规倾注平皿法方法验证的接受标准试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值（即试验菌的回收率）应在0 .5 ? 2范围内。

7.3.6. 常规倾注平皿法方法验证的结果7.3.6.1. 常规倾注平皿法测定需氧菌总数方法验证结果试验次数1:人工牛黄甲硝唑胶囊批号：___________________ ;胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：_________________________培养箱型号_________ 编号 ________ ;培养温度：___________ ;培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天试验次数2:人工牛黄甲硝唑胶囊批号：__________________ ;胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： _________________________ 培养箱型号_________ 编号 ________ ;培养温度：___________ ;培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号：__________________ ;胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： _________________________ 培养箱型号_________ 编号 ________ ;培养温度：___________ ;培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：7362 常规倾注平皿法测定霉菌与酵母菌总数方法验证结果试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号：__________________ ;沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： _________________________试验次数2:人工牛黄甲硝唑胶囊批号：__________________ ;沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： _________________________试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号：__________________ ;沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： _________________________培养箱型号________ 编号_________;培养温度：___________ ;培养时长：5天7.3.7. 常规倾注平皿法测定需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数方法验证小结按照验证方案的要求进行试验，若各试验菌株的回收率在0.5〜2范围内，则可确认常规倾注平皿法适用于本品的需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数检查。

如常规倾注平皿法适用于霉菌与酵母菌总数检查，但不适用于需氧菌总数检查，则下面进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的需氧菌总数检查。

74需氧菌总数检查一离心沉淀-薄膜过滤法7.4.1. 供试液的制备取供试品10g,加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml，振摇，制成1：10的供试液贮备液。

取1:10 的供试液贮备液50ml，经500转/分钟离心3分钟，取上清液得供试液。

7.4.2. 试验组取供试液1 ml，加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径0.45卩m混合纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次（100ml/次），然后在第3次冲洗液（100ml0.9% 无菌氯化钠溶液）中加入7.2项下制备的50〜100cfu的试验菌，过滤。

每株试验菌株平行制备2张滤膜。

取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，30〜35C倒置培养3天（金黄色葡取供试液1 ml ，加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径 0.45卩m 混 合纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜 3次（100ml/次），平行制备2张滤膜。

取出滤 膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，30〜35C 倒置培养5天，点计菌落数。

7.4.4. 菌液对照组取0.9%无菌氯化钠溶液 300 ml , 200ml 通过薄膜（孔径0.45卩m 混合纤维素膜）后，在余下的 100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入7.2项下制备的50〜100cfu 的试验菌，过滤。