版中国药典微生物检验规程

微生物检验规程

1.实验注意事项

无菌操作要求

接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。

专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。

接种样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。

进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。

从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。

接种样品、转种细菌必须在酒精灯旁操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞（即硅氟胶塞）都要通过火焰消毒。

接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处。

吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。?

无菌间使用要求

无菌间内应保持清洁，工作后用消毒溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。??

无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。???

处理和接种样品时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。

消毒灭菌要求

灭菌前准备

（1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。（2）装培养基的三角瓶，内容物不应超过总体积的2/3（例如500mL的三角瓶最好装300～350mL培养基，以防再次加热融化时爆沸）。

（3）无菌室内使用的毛巾、脱脂棉球用纸包裹，进行湿热灭菌。

装放

（1）干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。

（2）大型高压蒸气锅：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。

设备检查

（1）检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。

（2）检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞。

（3）对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否符合于进行灭菌处理的要求。

灭菌处理

(1) 干热灭菌法：用于玻璃器皿、金属制品、陶瓷制品等的灭菌。灭菌完毕后或温度升温过程中，须在60℃以下才能打开箱门。

(2)立式压力蒸气灭菌器：待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下再开盖取物，以防突然减压液体剧烈沸腾或容器爆破。

（3）物品取出,随即检查包装的完整性,若有破坏或棉塞脱掉、包装有明显的水浸者,不可作为无菌物品使用。培养基或试剂等,应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态,未达到者应废弃。取出的物品掉落在地或误放不洁处,或沾有水液,均视为受到污染,不可作为无菌物品使用。取出的合格灭菌物品,应存放于贮藏室或防尘柜内,严禁与未灭菌物品混放。凡属合格物品,应标有灭菌日期及有效期限。

有毒有菌污物处理要求

经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地点，待统一进行高压灭菌（经微生物污染的培养物，必须经121℃30min高压灭菌）。

染菌后的吸管（即进行阳性菌操作后的），使用后放入5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液体不得低于浸泡的高度）再经121℃30 min高压灭菌。

涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，强致病菌的冲洗液必须冲在烧杯中，经高压灭菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5﹪煤酚皂溶液中浸泡24 h后，煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤。

打碎的培养物，立即用5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。污染的工作服或进行强致病菌试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。?????

培养基制备要求

根据培养基配方的成分按量称取（可根据产品说明书用量和方法进行），然后溶于蒸馏水中，在使用前对应用的试剂药品应进行质量检验。

因高压灭菌可影响一些培养基的PH降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培养基的质量。

盛装培养基不宜用铁、铜等容器，使用洗净的中性硬质玻璃容器（三角烧瓶）为好。

每批培养基制备好后，应做无菌生长试验（空白平皿试验）及所检菌株生长试验。如果是生化培养基，使用标准菌株接种培养，观察生化反应结果，应呈正常反应，培养基不应贮存过久，必要时可置4℃冰箱存放。

2.实验操作

准备用具，配制培养基、稀释液、培养箱

：需氧菌菌总数胰酪大豆胨琼脂培养基、

霉菌和酵母菌总数沙氏葡萄糖琼脂培养基

控制菌胰酪大豆胨液体培养基

肠道菌增菌液体培养基

麦康凯液体培养基

RV沙门增菌液体培养基

接种平板紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基

麦康凯琼脂培养基

木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基

：0. 9%无菌氯化钠溶液

培养箱：3个（30?35℃、20?25℃、42?44℃）

培养基配制

灭菌

无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24至48小时，以检查灭菌是否彻底。

无菌室准备：用消毒液擦拭无菌室，将本次试验所用的器皿、培养基通过传递窗送到无菌室，，样品置于传递窗，一次性使用物料（工作服、口罩、手套）置于缓冲间。开启净化系统1小时，关闭净化系统，打开紫外灯小时，关闭紫外灯，至少小时后进入无菌室。

微生物计数检验（平皿倾注法）

：一般供试品的检验量为10g或10ml;膜剂为100cm2; 贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。检验时，应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于4 丸，膜剂还不得少于4 片。

：0. 9%无菌氯化钠溶液

：3个稀释级（常用10-1、10-2、10-3）（每稀释级每种培养基至少制备2 个平板），同时做空白（等量稀释剂）〖供试液用量为适应性试验确定的，常用1ml〗

取培养基，融化并让其冷却至45℃左右，倾入已加入供试液的平皿中，每个平皿约15mL（即倾倒时液面刚刚闭合时），在超净台面上轻轻晃动使供试液均匀混合于培养基中，放置一旁待冷却凝固。

培养：待平皿完全冷却凝固，通过传递窗取出，倒置叠放置于培养箱中。培养时间及温度：需氧菌菌总数 30?35℃培养3?5 天

霉菌和酵母菌总数 20?25℃培养5?7 天，

控制菌检验

取供试品10g，用稀释剂制成1 : 10供试液，混匀，在20?25℃培养约2小时(可以在无菌室中先做这一步，等其余试验步骤完成，再继续进行控制菌的下一步)。

耐胆盐革兰阴性菌胰酪大豆胨液体培养基

大肠埃希氏菌 0. 9%无菌氯化钠溶液

沙门菌直接取样品10g或10ml

（增菌培养）：取供试液10mL（相当于1g样品），加在 ml增菌液体培养基（经方法适用性试验确定）中，30?35℃培养24?48小时。

耐胆盐革兰阴性菌肠道菌增菌液体培养基

大肠埃希氏菌胰酪大豆胨液体培养基

沙门菌胰酪大豆胨液体培养基