临床微生物学检验

临床微生物学检验确保高压效果的可靠性。

【适用范围】蒸气式高压锅。

【该SOP变动程序】本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。

【操作方法】1．将水加到高压锅内至其刻度线，将欲灭菌物品放入锅内，关闭锅门，拧紧螺丝并确认已经封闭。

2．打开排气阀。

3．打开蒸汽开关，向锅内输入蒸汽或接通电源，使产生蒸汽。

4．观察排气阀的排气情况，待排出的气体由冷气变为蒸汽，压力表达到0.05mPa 时，关闭排气阀。

5．观察压力表，当压力升至0.15mPa时，开始计时。

6．压力达0.15mPa后，可调节进气阀，减少进气量，维持压力并使其稳定在0.15mPa。

电加热时，可切断电源，维持压力持续15分钟，至多不超过30分钟，否则营养物质破坏。

7．关闭进气阀门或切断电源，让锅内物品自然冷却，不可马上打开排气阀，以免发生意外。

8．待锅内压力降为零时，可打开锅盖，取出物品。

操作人员部门主管质量负责人姓名唐玉贞检验科检验科日期 06年06月06日确保培养箱温度恒定。

【适用范围】各种类型隔水式、温度设定为27℃、35℃、42℃、56℃培养箱。

【该SOP变动程序】本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。

【操作方法】1．培养箱应放置于水平地面（或坚固的水平台），电源电压须匹配。

2．从注水口先将隔水箱内的水注满到浮标要求的位置。

3．将温度调节旋扭调至所需温度，然后将电源开关拨至“开”处。

4．每次使用时应在培养箱顶部插入标准温度计，监测实际温度。

5．培养箱工作温度波动范围应控制在±10C以内。

6．培养箱正面贴有温度记录表，记录每天上班和下班时温度，如温度超出正常范围，指示该温度的刻度应划上红圈，并把修正温度记录下来。

7．培养箱内外应保持清洁。

操作人员部门主管质量负责人姓名唐玉贞检验科检验科日期 06年06月06日保证培养基的质量。

【适用范围】使用成品培养基干粉制备各种分离培养基。

【该SOP变动程序】本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。

【步骤】1.在玻璃容器中加入所需蒸馏水的二分之一量，然后放入一定量培养基干粉，补足水量，轻轻搅拌以促进溶解。

2.校正pH：高压灭菌前可用pH计或精密pH试纸校正培养基的pH。

3.分装：液体培养基一般在灭菌前分装，分装时应注意每管的分装量不应高于试管的2/3。

琼脂平板是在培养基高压灭菌后冷至50-600C时再倾注平板。

4.质量检查[1] 无菌试验：将制好的培养基在350C孵育过夜，判定是否灭菌合格。

[2] 效果检验：按不同的培养要求，接种相应的菌种，观察细菌的发育、菌落形态、色素、溶血等特征，判断培养基是否符合要求。

5.保存：液体培养基及琼脂平板须在40C保存，一般不超过7天，如用塑料袋密封至多保存2周。

操作人员部门主管质量负责人姓名唐玉贞检验科检验科日期 06年06月06日确保染色结果清晰可靠。

【该SOP变动程序】本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。

【试剂】1.结晶紫溶液A液：结晶紫 2g95%乙醇 20mlΒ液：草酸铵 0.8g蒸馏水 80ml使用前24小时将A液Β液混合后，过虑后装入试剂瓶内备用。

2.碘液碘 1g碘化钾 2g蒸馏水 300ml3.脱色液：95%乙醇4.复染液储存液：沙黄 2.5g95%乙醇 100ml应用液：储存液 10ml蒸馏水 90ml【方法】1.待检标本用无菌生理盐水涂片，经自然干燥或火焰固定。

2.加结晶紫液染1分钟，清水冲去染液。

3.加碘液染1分钟，清水冲去染液。

4.加95%乙醇脱色液，不时摇动约10-30分钟，至紫色已脱落为至，水冲洗。

5.加复染液（伊红），染30分钟，水冲洗。

6.待涂片自然干燥后，油镜镜检。

操作人员部门主管质量负责人姓名唐玉贞检验科检验科日期 06年06月06日确保染色结果清晰可靠。

【方法】（一）碱性复红染色法【试剂】1、萋纳石炭酸复红溶液碱性复红乙醇饱和溶液 10ml5%石炭酸溶液 90ml2、脱色剂浓盐酸 3ml95%乙醇 97ml3、复染液（吕弗勒美蓝液）美蓝乙醇饱和溶液 30ml10%氢氧化钾 0.1ml蒸馏水 100ml【染色步骤】1、涂片经自然干燥或火焰固定后，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾。

染5分钟（若染色奴卡菌需要加长时间），水洗。

2、加脱色剂，不时摇动坡片至无红色脱落为至，水洗。

3、加复染液，染0.5-1分钟。

4、干后镜检。

分枝杆菌呈红色，背景为蓝色。

注：奴卡菌、放线菌标本染色时，脱色剂改用2%硫酸水溶液。

（二）金胺O-罗丹明Β染色法【染剂】1、罗丹明Β液：罗丹明Β 0.1g加蒸馏水100ml；2、0.1%金胺O液：金胺O 0.1g加蒸馏水95ml，再加入纯石炭酸5ml，混匀。

3、3%盐酸酒精。

4、稀释美蓝液：吕弗勒美蓝液10ml，加蒸馏水90ml，混匀。

【方法】1、涂片固定后加第1液30-90分钟。

2、弃去第1液后加第2液染15分钟。

3、用第3液脱色1-2分钟，水洗。

4、滴加第4液染30分钟，水洗，待干，荧光镜检。

【结果】抗酸菌在暗背景中呈现金黄色荧光。

操作人员部门主管质量负责人姓名唐玉贞检验科检验科日期 06年06月06日指导血液标本的正确采集。

【该SOP变动程序】本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。

【步骤】1.选择一适当的静脉穿刺处，先以70%酒精擦拭。

2.再用棉签沾取2%碘酊涂于欲作静脉穿刺处，让其干后再用70%酒精擦拭。

3.全部手续再作一此（如必要）4.用一支无菌的21号针头与10ml针筒抽空（成人约抽取10ml血液，小孩约抽取1-5ml）。

5.血液抽出后，立即注入血液培养瓶，马上充分混匀后，再送入检验。

操作人员部门主管质量负责人姓名唐玉贞检验科检验科日期 06年06月06日保证血（骨髓）培养结果的正确性。

【该SOP变动程序】本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。

【实验条件】培养箱或厌氧培养箱（或厌氧罐）或全自动血培养仪。

【操作程序】（一）标本采集严格无菌技术取血液10ml（儿童血液1-5ml）、骨髓0.5-1 ml注入血培养瓶后立即送实验室，注入厌氧瓶时要注意勿将注射器内的空气注入瓶内，培养瓶在送试验室前，不可放冰箱暂存。

（二）培养1.实验室接到血培养瓶后，放350C孵育。

2.经过12-18小时，350C孵育后，在血平板或巧克力平板上盲传一次。

3.盲传后继续孵育，每日早晨观察有无细菌生长，直至第7天。

4.无细菌生长表现的培养瓶，在观察的7天中，最少应做2次盲目传种。

5.全自动血培养仪培养时，待其仪器报警，涂片、接种；若仪器未报警，5天后盲种，仍为阴性，才能报告。

（三）分离鉴定1.盲传阳性或肉眼可见生长现象，直接涂片做革兰染色，所见结果应及时报告临床医师。

2.根据涂片结果，如为一种细菌生长，则直接以增菌液做鉴定实验；如有两种或多种细菌同时生长，则必须经过分离培养，以获得纯菌种后做鉴定。

3.细菌鉴定要做到种的鉴定。

（四）药敏实验1.根据涂片结果，直接以培养瓶内的增菌液做直接药物敏感性测试，争取在较短时间内得出初步结果，供临床医师作为治疗的参考。

2.标本经平板分离纯培养后，做标准化药敏实验正式报告给临床。

【结果的判断】1.疑有细菌生长者，经涂片、革兰染色镜检后，电话通知主管医师。

2.任何时候平板上长出单个菌落，应立即完成鉴定就及标准化药敏实验，并发出报告，报告形式为“XXX细菌生长”，药敏实验报告形式为“XXX敏感”等。

3.培养3天为阴性的标本，应电话通知临床医师，培养7天仍为阴性者，应报告“经7日培养无细菌生长”。

操作人员部门主管质量负责人姓名唐玉贞检验科检验科日期 06*年06月06日保证质量评价的准确可靠。

【目的】保证纸片扩散法药敏结果的可靠性。

【材料】（一）培养基Mueller-Hinton琼脂平板，只适合肠杆菌科、铜绿假单胞菌、不动杆菌、葡萄球菌、肠球菌、霍乱弧菌；HTM琼脂，只适合嗜血杆菌；GC琼脂＋1％特定的生长因子，只适合淋病奈瑟菌；Mueller-Hinton琼脂＋5％羊血，只适合链球菌。

（二）药敏纸片抗菌药物纸片直径约为6.0-6.35mm，每片的吸水量约20ml。

（三）质控菌株K-Β法质量控制用菌株常规用：金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853。

（四）菌液比浊管接种菌液浓度为1.5x108/ml，相当于0.5的麦氏比浊管。

【方法】1.制备接种菌液：挑选琼脂平板上，形态相同的菌落移种于M-H液体培养基中，置350C温箱中孵育4小时，校正浊度，或用接中环挑取菌落，置浮于生理盐水中振荡混匀后与标准化浊管比浊，调整浊度与比浊管相同。

2.接种平板：用无菌棉签蘸取已制备好的接种好的菌液，在管壁上旋转挤压九次，去掉过多的菌液，涂布整个M-H培养基表面，并将平板旋转60℃，反复几次，最后沿平皿周边绕两圈，保证涂布均匀。

3.贴纸片：待平板上的水分被琼脂完全吸收后（约15分钟），用无菌镊子取纸片贴在琼脂平板表面，并用镊尖轻压一下，使其贴平。

每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。

4.孵育：把贴好药敏纸片的平皿放进350C孵平板，最好单独摆放，不超过2个叠在一起，孵育18-24小时后，读取结果。

5.判定结果：培养后取出平板，用游标卡尺测量抑菌环的直径，抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限，然后根据抑菌环直径大小、NCCLS判断细菌的敏感性，并加以记录。

二、稀释试验【目的】1.为了决定抗生素的最低抑菌浓度（MIC）。

2.为了决定抗生素杀菌能力，或实验两种以上抗生素对细菌的协同作用或对抗作用。

【方法】（一）肉汤稀释试验1.适用情况：[1] 血液培养。

[2] 病人对适当治疗方法无效。

[3] 免疫机能障碍病人[4] 病人经治疗后复发者。

2.培养基的选择：一般细菌用调节好阳离子的M-H肉汤（CAMHB），如肠杆菌科、铜绿假单胞菌、不动杆菌、葡萄球菌、肠球菌、霍乱弧菌；某些挑剔性细菌则根据其生长的营养需要，向M-H肉汤中加入适当的营养物进行实验，如HTM肉汤，只适合嗜血杆菌；CAMHB＋2－5％冻融马血，适合肺炎链球菌以及以外的链球菌。

3. 肉汤的连续稀释：[1] 将各种抗微生物药物库存液稀释成200ug/ml或200u/ml。

[2] 取10支无菌试管，写上编号1-10，为一组每种抗生素需一种。

[3] 自第2管至10管各加入无菌肉汤1。