重叠延伸PCR技术的基本原理及其简单运用
重叠延伸pcr
重叠延伸pcr重叠延伸PCR一、前言重叠延伸PCR（Overlap Extension PCR，又称OE-PCR）是一种基于PCR技术的DNA重组技术，它可以实现在DNA两端同时进行定向变异、插入、删除等操作。
重叠延伸PCR广泛应用于基因工程、遗传学、生物学等领域，成为分子生物学研究中的一项重要技术手段。
二、适用场景2.1 定向变异定向变异是指在已知序列中有目的地进行基因改造，如点突变、插入、缺失等。
这种改造方式在药物研发、基因治疗等方面有广泛应用。
重叠延伸PCR可以实现在DNA两端同时进行定向变异，从而避免在后期回溯过程中的麻烦。
2.2 DNA连接DNA连接是指将不同组织来源的DNA片段进行连接的技术。
重叠延伸PCR在连接过程中，可以通过PCR技术将两个片段的连接点相互重叠，从而实现快速、准确的连接。
三、操作流程3.1 设计引物首先，需要根据实验需要，设计出两对带有同义语突变位点的引物组合。
3.2 预扩增将目的片段引物体系与目的DNA模板进行PCR扩增，以获得适当浓度的DNA模板。
3.3 扩增突变位点将模板进行分开再扩增，由于引物不具有重复序列，可以杜绝非特异性放大的情况发生。
3.4 扩增合成将扩增突变位点与预扩增产物进行重叠延伸PCR反应，合成所需DNA 片段。
3.5 二次PCR利用扩增产物进行二次PCR反应，获得所需突变的DNA产物。
四、优点4.1 准确性高在重叠延伸PCR中，引物端使用了一些具有重叠序列的引物，可以减少模板串扰，从而大大提高了反应的准确性。
4.2 可控性强由于引物设计合理、重叠合成区域明确，重叠延伸PCR能够实现精确控制产物长度，避免了延伸过程中产生多余的DNA序列。
4.3 操作简便重叠延伸PCR是一种简单、快速、方便的重组技术，操作简便，前期准备工作少。
五、结论重叠延伸PCR是一种高频使用的分子生物学技术手段，具有诸多优点。
在实际应用中，重叠延伸PCR能够实现定向变异、DNA连接等操作，为生物学和基因工程的研究提供了强有力的支持。
重叠延伸PCR技术及其在生物学中的应用
的抗逆能力 。其具 有的综合抗逆 能力是在 特殊生态 环 境下长期发育进化形成 的， 对其抗逆机理及其生物 特性
进行系统研究有助于揭开新 的生物抗逆机制。
研究 人员通 过 对 新疆 木 耳 蘑 菇 的化 学 成分 分 析 后， 发现该 菌子 实体 中含有 ｌ ８种氨基酸 ， 菌盖 、 菌柄氨 基酸含 量（ ｒ ／ｋ ｇ ） 分别 是 １ ９ ． ４ ６和 ｌ ３ ． １ ４ ； ８种必需 氨基 酸含量分 别是 ９ ． ２ ６和 ２ ． ４ １ ； 饱和脂 肪 酸有粗 脂肪 、 棕 榈酸 、 硬脂 酸、 棕 榈油酸、 花生四烯酸 ， 在 菌盖和 菌柄含
生 物 学教 学 ２ ０ １ ３ 年（ 第３ ８ 卷） 第４ 期
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６ ５・
重 叠 延伸 Ｐ Ｃ Ｒ技 术 及 其在 生物 学 中的应 用
李 守宇 （ 江 苏 省 宜 兴 第 一 中 学２ １ ４ ２ ０ ６ ）
摘 要 重叠延伸 Ｐ Ｃ Ｒ技术是一种通 过寡 聚核苷酸链之 间重叠 的部分 互相搭桥 、 互 为模板 ， 通 过多次 Ｐ Ｃ Ｒ扩增 ， 从而获 得 目的 重叠延伸 Ｐ Ｃ Ｒ技术 片段基因合成 融合基因构建 基 因定点诱变 Ｄ Ｎ Ａ基因片段的方法。该技术高效 、 快捷 、 经济 ， 在基因功能研究方面显示 良好 的应用前景 。 关键词
１ 重叠延伸 Ｐ Ｃ Ｒ技术简介 重叠延伸 Ｐ Ｃ Ｒ技术 （ Ｓ Ｏ Ｅ Ｐ Ｃ Ｒ） 是采 用具 有互 补 末 端 的引物 ， 使 Ｐ Ｃ Ｒ产 物形 成 了重 叠链 ， 从而 在 随后 的扩增反应 中通 过重 叠链 的延伸 ， 将 不 同来 源 的扩增 片段重叠拼接起来 的技术 。
PCR衍生技术的原理和应用
PCR衍生技术的原理和应用一、PCR的原理PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种在体外扩增DNA片段的技术，其原理是通过反复进行DNA的复制，最终得到大量目标DNA片段。
PCR的原理主要包括以下几个步骤： 1. 反应体系的配制：PCR反应需要包含DNA模板、引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）和聚合酶等关键成分。
2. Denaturation（变性）：将PCR反应体系加热至95℃，使DNA双链解开，得到单链DNA。
3. Annealing（退火）：将PCR反应体系温度降至50-65℃，使引物与DNA的互补序列结合。
4. Extension（延伸）：将PCR反应体系温度升至72℃，聚合酶将新的DNA链合成。
5. 重复步骤2-4：以上三步循环反复进行，使DNA分子指数级增加。
PCR的原理基于DNA的双链结构可变性和DNA聚合酶的体外聚合能力，能够在短时间内扩增目标DNA片段。
二、PCR的应用PCR技术已经广泛应用于许多领域，包括医学、生物学、法医学和环境科学等。
下面列举了PCR在不同领域的应用：1.分子诊断•PCR在临床诊断中的应用：PCR技术可以检测病原体、基因突变和单倍体多态性等，用于疾病的早期诊断和基因型鉴定。
•PCR在遗传疾病筛查中的应用：PCR可以检测染色体缺陷、遗传突变和基因变异等，有助于遗传疾病的筛查和诊断。
2.基因工程和遗传学研究•PCR在基因克隆中的应用：PCR可以从复杂的基因组中扩增目标基因，为基因克隆提供模板DNA。
•PCR在DNA指纹技术中的应用：PCR技术可以扩增特定的重复序列，用于DNA指纹图谱的构建和个体鉴定。
•PCR在基因表达研究中的应用：PCR可以检测基因的表达水平和转录变异，从而揭示基因功能和调控机制。
3.药物研发•PCR在药物快速筛选中的应用：PCR技术可以高通量地检测药物对特定基因的影响，用于快速筛选药物靶点和药效评价。
4.环境监测•PCR在微生物污染监测中的应用：PCR技术可以快速检测环境中的微生物污染，例如水源、土壤和食品中的致病菌。
重叠延伸PCR技术
反应机理
F2 引物 F1 引物
5’ 3’ 3’ 5’
基因B
5’ 3’
R2 引物
3’ 5’
基因A
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
R1引物
加入酶，buffer等反应液。PCR仪中解链， 退火——单链模板结合
5’ 3’ 5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’ 加入F1引物、R2引物
5’ 3’
5’
3’
无目标产物
5’ 3’
F1 引物
3’ 5’
R2 引物
重叠延伸PCR技术
（SOE PCR）
1. 重叠延伸PCR技术的概念
• 重叠延伸PCR技术(SOE PCR)是指在PCR技术的基础上，采 用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,通过重叠链的 延伸,将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。该技术可以 很快获得依靠其它限制性内切酶消化的方法难以得到的产物，其 成功的关键是重叠互补引物的设计。SOE PCR在基因的定点突变、 长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独 特的应用。
答案： （1）越高 （2）引物2和引物3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失 去作用 （3）3 （4）2 （5）目的基因与载体结合 将重组DNA导入受体细胞
解析：重叠延伸PCR技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、 基因的定点诱变等方面有广泛的应用。老师要予以关注，在讲评中可适当拓展。G 与C碱基对之间是三个氢键，引物中G—C含量越多，越稳定。由图可知，因为引物 2、3有互补片段，但引物1、4没有互补片段。利用引物1、2进行扩增，可产生 两种DNA片段，利用引物3、4进行扩增，可产生 ，其中a、c 分别是以引物1和引物4扩增产生的DNA片段，是相同的DNA片段，b、d分别是以引 物2和引物3扩增的DNA片段，碱基序列是不同的，共三种。因为新的核苷酸链必须 从5′端到3′端，在第二阶段，含引物1和引物4的脱氧核苷酸链因为有互补的碱基序 列，而部分互补，并能互为模板进行延伸，但含引物2和引物3的脱氧核苷酸链虽 能部分互补，但因方向问题，不能延伸。
3个片段重叠延伸pcr比例
3个片段重叠延伸PCR比例PCR（聚合酶链式反应）是一种基因工程中常用的技术，通过在体外复制DNA片段，可以迅速扩增目标DNA序列。
3个片段重叠延伸PCR是一种特殊的PCR方法，它可以在同一反应中同时扩增3个相邻的DNA片段，并在这些片段之间引入重叠序列。
本文将介绍3个片段重叠延伸PCR的原理、操作步骤以及相关应用。
原理3个片段重叠延伸PCR的原理基于PCR的基本原理，通过两个反向引物和一个重叠引物，同时扩增3个相邻的DNA片段。
在引物设计上，每个片段的两个端部分分别与相邻片段的重叠序列相匹配，确保扩增时各片段能够连接起来。
重叠引物的设计需要考虑到引物的长度、GC含量和熔解温度等因素，以确保扩增效率和特异性。
在反应过程中，PCR反应液中含有4种核苷酸和聚合酶酶链，以及模板DNA和引物。
反应的温度循环包括变性、退火和延伸三个阶段，使引物与目标DNA序列进行特异性结合，聚合酶依次合成新的DNA链。
重叠引物在扩增过程中连接不同片段的DNA 段，最终得到完整的DNA序列。
操作步骤1.引物设计：根据目标DNA序列，设计两端引物和一个重叠引物。
两端引物的设计需考虑到其与相邻片段的重叠序列的匹配，重叠引物的设计需确保与各引物的熔解温度相近。
2.PCR反应体系组成：将所需核酸、引物和聚合酶按照比例准确加入PCR反应管中，确保反应体系配比正确。
3.温度循环：根据引物的特性和扩增片段的长度，设置合适的温度循环参数。
常规的循环程序包括变性（94-98°C）、退火（50-70°C）和延伸（68-72°C）等步骤。
4.分析扩增产物：可以通过琼脂糖凝胶电泳或其他方法，检测扩增产物的大小和纯度。
应用3个片段重叠延伸PCR在分子生物学研究中具有广泛的应用。
它可以用于基因克隆、基因组测序、遗传变异分析等领域。
在基因克隆中，3个片段重叠延伸PCR可以用于连接两个DNA片段之间的缺失序列，扩增目标片段并进行拼接。
重叠延伸pcr原理
重叠延伸pcr原理重叠延伸PCR（Overlap Extension PCR）是一种用于DNA片段重组的特殊PCR技术。
它的原理是通过两轮PCR反应，将两个不同的DNA片段在它们的重叠部分进行延伸，最终得到一个重组的DNA片段。
这种技术在分子生物学研究中有着广泛的应用，特别是在基因工程领域。
首先，我们来看一下重叠延伸PCR的基本原理。
在第一轮PCR中，我们需要设计两对引物，每对引物包含一个与目标DNA片段的末端相互重叠的序列。
这样，当PCR反应进行时，引物会将两个目标DNA片段的重叠部分进行延伸，形成两个带有重叠序列的DNA片段。
然后，在第二轮PCR中，我们使用这两个DNA片段作为模板，再次进行PCR反应。
这样，重叠部分会在第二轮PCR中连接起来，最终得到一个重组的DNA片段。
重叠延伸PCR的关键在于引物的设计。
引物的选择需要考虑到两个目标DNA片段的重叠部分，以及引物之间的相互作用。
通常情况下，引物的长度在20-30个碱基对之间，GC含量在40-60%之间，Tm值在55-65°C之间。
此外，引物的末端需要与目标DNA片段的重叠部分完全匹配，以确保延伸的准确性。
在实际操作中，重叠延伸PCR需要进行两轮PCR反应。
在第一轮PCR中，我们需要对引物的浓度、反应条件等进行优化，以确保两个目标DNA片段的重叠部分能够被准确延伸。
在第二轮PCR中，我们需要对引物的浓度、反应条件等进行进一步的优化，以确保重叠部分能够被准确连接。
此外，我们还需要对PCR产物进行酶切、测序等验证，以确保重组的DNA片段的准确性和完整性。
总的来说，重叠延伸PCR是一种用于DNA片段重组的特殊PCR技术，它的原理是通过两轮PCR反应，将两个不同的DNA片段在它们的重叠部分进行延伸，最终得到一个重组的DNA片段。
在实际操作中，我们需要对引物的设计、反应条件的优化、PCR产物的验证等进行精细的操作，以确保重组的DNA片段的准确性和完整性。
重叠PCR (Overlap
Cycling conditions
Pre-denaturation: Denaturation: Annealing: Extension: Extension: Finally:
98℃, 2 min.
98℃, 30 sec. 60℃, 30 sec. 72℃,1 min. 72℃,5 min. 4 ℃, ∞.
重叠PCR (Overlap PCR)的基 本原理 及其简单运用
刘梦鸽6.06.08
简介
重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称 SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重 叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源 的扩增片段重叠拼接起来的一项技术。
5 cycle
加入100 μM浓度的F和R引物各0.5 μl
Maker
目的基因条带 2154bp
胶回收得浓度： 40μg/mL
Cycling conditions
Pre-denaturation: Denaturation: Annealing: Extension: Extension: Finally:
98℃, 2 min.
98℃, 30 sec. 65℃, 30 sec. 72℃,2 min. 72℃,5 min. 4 ℃, ∞.
12 cycle
12
F2引物 R2引物
R2引物
突变碱基：可以在引物上换成任何其他碱基。
碱基同源区域：保证20bp左右，这样有利于Overlap PCR 得到目标序列。
8
上述反应体系中，反应液的加入有两种不同的方式
一种是先加入酶，模板（基因A和B）buffer，dNTP，水。经过5个循 环得到完整的目的基因。然后入引物，大量扩增目的基因。虽然这样操作 繁琐，但是可以得到特异性扩增产物。 另外一种是直接一步加入所有需要的反应液。虽然此操作简单省时， 但是会出现非特异扩增条带，影响胶回收，产量也会减少。
重叠延伸pcr技术及其在基因工程上的应用
重叠延伸PCR技术及其在基因工程上的应用1. 介绍重叠延伸PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种用于在DNA序列中特定区域进行增加或修改的重要工具。
它结合了两种PCR 技术，即延伸PCR和重叠PCR，能够在不需要进行复杂的克隆操作的情况下，实现特定DNA序列的扩增和修改。
在基因工程领域，重叠延伸PCR技术被广泛应用于基因的突变、合成和定向进化等研究领域。
2. 原理重叠延伸PCR技术主要依赖于两个PCR基本原理：延伸和重叠。
在延伸PCR中，引物和DNA模板结合后由热稳定DNA聚合酶进行DNA链的延伸，从而扩增目标DNA序列。
而在重叠PCR中，则通过设计引物使得重叠的部分在不同的引物对应的DNA片段间，从而实现目标DNA片段的扩增。
重叠延伸PCR技术则结合了这两种原理，通过巧妙的设计引物，可以在目标DNA序列特定区域进行精准的扩增和修改。
3. 应用在基因工程领域，重叠延伸PCR技术被广泛应用于基因的突变、合成和定向进化等研究领域。
通过合理设计引物序列，可以在基因的特定位点进行突变或插入，从而研究基因在结构和功能上的变化。
重叠延伸PCR技术还能够用于合成人工基因和调控基因表达水平，为基因工程研究提供了强有力的工具。
4. 个人观点在我看来，重叠延伸PCR技术是基因工程领域的重要利器，它不仅能够帮助研究人员快速高效地进行基因的改造和合成，也为基因工程研究提供了更大的灵活性和可能性。
随着基因工程领域的不断发展，重叠延伸PCR技术将会扮演更加重要的角色，为基因工程研究的进步和创新提供有力支持。
总结重叠延伸PCR技术作为一种重要的DNA工程技术，在基因工程领域扮演着重要的角色。
通过精准设计引物序列，可以在目标DNA序列特定区域进行扩增和修改，为基因工程研究提供了有力的工具。
未来，随着基因工程领域的不断发展，重叠延伸PCR技术将继续发挥重要作用，推动基因工程研究的进步和创新。
重叠延伸PCR技术在基因工程中的应用是非常广泛的，它不仅可以在基因编辑、合成和定向进化等领域发挥作用，还可以用于分析DNA序列和检测特定基因的存在。
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特点：
可简单迅速将两个DNA片段连在一起，用于嵌合体基因 的构建。此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重 组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术 很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产 物. 可以进行定点突变。 可以在两基因片段间加入其他序列——酶切位点或者标 签。 丰富的PCR的扩增范围，尤其在获得长DNA片段方面，省 去常规克隆的繁琐。
间不宜过长。高温会使 DNA 受到损伤，造成 DNA 酶终止合成。考虑
到DNA 聚合酶的扩增效率、错配率，每一轮反应的循环数控制在 20-
25 个为宜。循环次数过多，碱基错配的几率增大；循环次数太少，则
得不到足够的拷贝数进行下一轮反应。四条引物的TM值尽量保持相同
或一致，利于引物的灵活使用。
10
片段中间引入突 变
B基因： 上游（F2）与A基因终止密码子附近的序列及B基因5 ’ 端起始密码子附近的序列相对应，同样去除A基因终止密 码子TAA；下游（R2）与B基因的开放阅读框终止密码子 序列互补，并在5’末端添加酶切位点和2个保护碱基。
先分别用F1、R1，F2、R2扩增出A和B基因，然后再用F1 和R2将两基因连接起来，得到融合基因。
4
过程
设计引物
PCR扩增 基因两端
回收两端 片段
两端片段 退火延伸
扩增全长 基因
5
基本原理
6
两基因的引物设计
A基因： 上游（F1）与开放阅读框起始密码子附近的序列相对应， 并在5 ’末端添加酶切位点和3个保护碱基；下游（R1） 与A基因终止密码子附近的序列及B基因5’末端起始密码 子附近的序列互补，并去除A基因的终止密码子TAA
姓名：黄保洋 学号：20192118030 专业班级：生物化学与分子
生物学191
2020.05.28
2
简介
重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称 SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重 叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源 的扩增片段重叠拼接起来.
d.基于重叠PCR原理，上图中第二步A D 链直接的退火很关键，所以退 火温度很重要。 反应的退火温度也要根据引物而定，在保证产物扩增 效率的前提下，应尽量提高退火温度以提高产物的特异性，为下一轮 PCR反应提供高质量的模板，从而降低反应的错配率
热循环条件
对于重叠延伸 PCR 反应，循环不宜过多，变性的温度也不宜过高，时
提出问题：两个基因或者说一个 启动子和一个基因，你要将他们 连接到一起，我们首先想到的方 法当然是借助于酶切的方法，但 有时我们并不一定能构找到合适 的酶切位点，或者说我们找到了 酶切位点，但这种酶非常特殊或 者又很贵，我们可能只用一次， 这样购买酶就变成了一种浪费
1
重叠延伸PCR技术的基本 原理及其简单运用
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引物的设计
F1 引物
基因1
PCR扩增
基因1
R1引物
F2 引物
基因2
R2引物
PCR扩增
基因2
基因1 基因1
基因2
碱基相同区域， 至少20bp
PCR怎么样发生反应？ 基因2
8
反应机理
F1 引物
5’ 3’
基因A
F2 引物
5’ 3’
3’ 5’
R1引物
基因B
3’ 5’
R2 引物
加入酶，buffer等反应液。PCR仪中解链， 退火——单链模板结合
5’ 3’
3’ 5’
3’
5’ 3’
F1 引物
5’ 3’
Hale Waihona Puke 3’ 5’加入F1引物、R2引物
3’ 5’
R2 引物
大量扩增目的基因
5’ 5’
无目标产物
3’
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实际操作注意点
a.第一步PCR之后的产物，可以纯化，也可以吸取几μL作为重叠PCR的 模板。
c.Taq酶会在末端加A，高保真酶有3’— 5’的外切活性，基于重叠 PCR原理和酶的性质，第一步和重叠PCR步骤至少有一步使用高保真酶 （或者如Taq Plus、Es Taq之类的，有3’— 5’的外切活性），如果 第一步和重叠PCR都使用普通Taq可能重叠PCR会失败。
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可以有目的地改变DNA序列中的 碱基，从而阐明基因表达的调 控机理，研究蛋白质结构与功 能间的关系，改造天然蛋白质， 使之更符合应用需求。 突变点最好是位于引物的5’端， 尽量避免出现在3’端
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片段中间引入缺 失
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片段中间引入插 入片段
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片段拼接(如不同结 构域DNA片段拼接)
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谢谢