微生物实验手册
《微生物学实验》操作步骤
实验一培养基的制备与灭菌实验步骤：（一）伊红美蓝培养基（EMB，用成品，分离大肠杆菌用）每组1瓶，250 ml三角瓶×200 ml培养基。
按成品说明称量、放入搪瓷杯，加水，加热完全溶化，倒入三角瓶，塞棉花塞，牛皮纸封口，包扎，作标记（培养基名称、批次组别、日期，下同），灭菌。
（二）营养琼脂培养基（即牛肉膏蛋白胨培养基，用成品，分离芽孢杆菌用）每组1瓶，250 ml三角瓶×200 ml培养基，方法同上，灭菌。
（三）PDA培养基（即马铃薯蔗糖培养基，分离酵母菌、根霉用）每组1瓶，250 ml三角瓶×200 ml培养基。
培养基配方：马铃薯20%、蔗糖（白砂糖）2%、琼脂 2%，加水至所需体积，pH自然。
配制方法：马铃薯去皮，称量，切成小方块，放入搪瓷杯，加水适量，煮沸20 min，取汁液，补水至所需体积，加入蔗糖（白砂糖），加热溶化，最后加入琼脂（琼脂要预先单独用水浸泡，然后挤干再加入），加热至琼脂完全溶化，分装三角瓶，塞棉花塞，牛皮纸封口，包扎，灭菌。
培养基统一高压蒸汽灭菌（121℃25 min）。
（四）无菌平皿准备（下次实验倒平板用）每组10套，报纸包扎，高压蒸汽灭菌（121℃25 min）后，置干燥箱80℃烘干1 h。
（五）枯草样预处理及预培养（下次实验分离芽孢杆菌用）枯草样预处理：每组1瓶。
100 ml三角瓶＋自来水约50 ml，加5%可溶性淀粉，溶解。
枯草若干，剪短，浸入三角瓶水中，牛皮纸封口，包扎，置水浴中煮沸10 min，然后置培养箱30℃预培养3～7 d。
（六）葡萄样（或其它水果）酵母菌预培养（下次实验分离酵母菌用）每组1瓶。
葡萄（或其它水果）适量，捏碎，皮渣与汁液一起放入250 ml 三角瓶（装量1/2～2/3），封口，置培养箱25℃预培养3～7 d，观察自然发酵过程。
实验二微生物的分离与纯化实验步骤：（一）污水中大肠杆菌的分离（稀释倒平板法）1）用三角瓶取污水样适量。
微生物实验技术操作手册
微生物实验技术操作手册一、实验介绍微生物实验技术操作手册旨在为研究人员提供详细的实验步骤和操作指南，以确保实验的准确性和可重复性。
本手册涵盖了微生物实验的基本原理、实验材料和设备的准备、实验步骤以及结果分析等内容。
通过遵循本手册的操作指南，研究人员可以顺利进行微生物实验，并获得可靠的实验结果。
二、实验材料和设备准备1. 实验材料：- 微生物培养基：根据实验需要选择适当的培养基，如LB培养基、TSB培养基等。
- 微生物菌种：根据实验目的选择所需的微生物菌种。
- 试剂：如抗生素、染料等。
- 培养皿、试管、移液器等实验器材。
2. 实验设备：- 培养箱：用于控制培养温度。
- 离心机：用于离心培养物。
- 恒温振荡器：用于培养物的摇床培养。
- 显微镜：用于观察微生物的形态和结构。
三、实验步骤1. 准备工作：- 消毒操作台和实验器材：使用适当的消毒剂对操作台和实验器材进行消毒处理，以确保实验环境的无菌。
- 培养基制备：按照培养基配方准备培养基，并进行高压灭菌处理。
- 微生物菌种制备：选择适当的菌种进行预培养，以获得足够的菌量。
2. 培养操作：- 接种：将预培养的菌种接种到含有适当培养基的培养皿或试管中。
- 培养条件控制：根据菌种的生长要求，设置适当的培养温度、pH值和培养时间。
- 培养物观察：使用显微镜观察培养物的生长情况，并记录相关数据。
3. 实验操作：- 抗生素敏感性实验：将不同浓度的抗生素添加到含菌培养基中，观察菌落的生长情况，以确定菌株对抗生素的敏感性。
- 染色实验：使用适当的染料对微生物进行染色，观察染色后的微生物形态和结构。
四、结果分析根据实验操作所获得的结果，进行相应的数据分析和结果解读。
通过比较不同实验组的结果，可以得出结论并提出相应的讨论。
五、注意事项- 操作前需仔细阅读实验操作手册，并按照操作指南进行实验。
- 严格遵守实验室的安全操作规程，佩戴适当的个人防护装备。
- 实验过程中保持实验环境的无菌和洁净。
微生物实验教程
实验 1—1 普通光学显微镜的使用……………………………………………………………
实验 1—2 细菌的形态结构观察 (简单染色、革兰氏染色、抗酸染色) ……………………
实验 1—3 细菌的特殊结构和运动性观察 (芽胞染色、荚膜染色、鞭毛染色) ……………
实验 1—4 放线菌的形态结构观察 …………………………………………………………
一滴镜油作为介质。国产显微镜的油镜常标有“油”字，国外产品则常用“oil”（oil Immersion）
或“HI”（Hemcyeneous Immersion）字样，以供识别。物镜上通常标有放大倍数、数值孔径
（亦称镜口率）、工作距离等主要参数。
3、聚光器：也叫集光器，由聚光镜和可变光阑组成。聚光镜由一片或数片透镜组成，
面是平面镜，另一面是凹面镜，其作用是使光源发出的光或自然光射向聚光镜。光强时用平
面镜，光弱时用凹面镜。有的显微镜的人工光源安装在镜座内，其反光镜也固定在镜座内。
（三） 普通光学显微镜的光学原理
心
由单透镜构成的放大镜和由几块透镜组成的实 体显微镜（解剖镜）称单式显微镜生物学教学及科 研所用的光学显微镜一般是复式显微镜。
高学生的综合能力与创新意识。
教
验
实 3. 提高学生分析问题和解决问题的能力。根据本学科的特点，逐步使学生认识微生物的基本
学 特性，比较它们与其它生物的相似和不同之处，知道如何研究微生物以及对研究中所出现的
问题点样分析，
范
师
京
南
第一节 微生物的形态结构观察
微生物的个体微小，肉眼难以看见，必须借助显微镜才能观察到。因此．显微镜就成为 微物学研究工作者不可缺少的基本工具，从事有关微生物学教学、科研和生产的人员，都应 该了解显微镜的种类、结构、功能和正确地掌握不同显微镜的使用方法。
(完整版)微生物学实验指导书
03微生物在自然界和人类生活中的作用阐述微生物在生态系统、工业生产、医疗卫生等领域的重要性。
01微生物的定义与分类包括细菌、真菌、病毒等微生物的基本概念和分类方法。
02微生物的生物学特性介绍微生物的形态、结构、生理生化特性等。
微生物学概述01实验室安全制度包括实验室安全守则、危险标识识别、紧急情况下的应对措施等。
02实验操作规范介绍实验前准备、实验过程中的操作规范、实验后清理等注意事项。
03生物安全阐述生物安全的概念、生物安全级别的划分及相应防护措施。
实验室安全与规范介绍显微镜的种类、使用方法和维护保养。
显微镜介绍离心机的类型、使用方法和维护保养。
离心机阐述培养箱和摇床的工作原理、使用方法和注意事项。
培养箱与摇床包括分光光度计、电泳仪、PCR 仪等设备的简要介绍和使用方法。
其他常用设备常用仪器与设备实验报告格式包括标题、作者、摘要、正文、结论、参考文献等部分的撰写要求。
数据处理与图表制作介绍数据处理的方法、图表的制作规范及注意事项。
实验结果分析与讨论阐述实验结果的分析方法、讨论实验结果的合理性及可能存在的问题。
实验报告提交与评审说明实验报告的提交方式、评审标准及相关注意事项。
实验报告撰写要求03根据实验需求，选择适当的培养基类型，如营养琼脂、马丁氏琼脂等。
选择合适的培养基按照培养基配方准确称量各成分，加入蒸馏水或去离子水，加热溶解后调整pH 值。
配制培养基将配制好的培养基分装到试管、培养皿等容器中，采用高压蒸汽灭菌法或干热灭菌法进行灭菌处理。
培养基分装与灭菌培养基制备与灭菌微生物接种与培养接种前准备准备好无菌操作台、无菌接种环、酒精灯等接种工具，确保无菌操作环境。
微生物接种采用划线法、倾注法等方法将待测微生物接种到培养基上。
培养条件设置根据微生物的生长需求，设置好培养温度、湿度和光照等条件。
观察前准备准备好显微镜、载玻片、盖玻片等观察工具，确保无菌操作环境。
微生物形态观察通过显微镜观察微生物的形态、大小、排列方式等特征，记录并描述观察结果。
微生物实验操作规范
细菌实验操作部分㈠培养基的配置操作步骤1.称量：按培养基配方比例依次准确称量放入烧杯中（用称量勺，称量纸和电子天平）。
2.在烧杯中先加入少量所需蒸馏水，用玻璃棒搅匀，然后再石棉网上加热使其溶解。
待药品完全溶解后，补充水分到所需总体积。
如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底。
3.调pH：在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基pH值，如果偏酸，用滴管向培养基中加入1mol/L NaOH,边加边搅拌，并随时用pH试纸测，反之用1mol/L HCL。
4.分装：（1）液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。
（2）固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。
（3）半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
5.加塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞或硅胶塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。
6.包扎：加赛后，将全部试管用皮筋捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸（报纸即可），以防止灭菌时冷凝水润湿。
用记号笔注明日期名称。
7.灭菌：将上述培养基放入121摄氏度，20分钟高压蒸汽灭菌。
8.搁置斜面：将灭菌的试管培养基冷至50°C左右，将试管塞端搁在玻璃帮上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
9.无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24至48小时，以检查灭菌是否彻底。
几种常用培养基成分1．LB Medium (LB 培养基)Yeast extact (酵母膏) 5g Peptone (蛋白胨) 10gNaCl 10g Agar (琼脂) 1-2%Distilled water (蒸馏水) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠埃希氏菌（大肠杆菌）2.Trypton Soy Agar胰蛋白胨17.0g 大豆胨 3.0g葡萄糖2.5g 琼脂20.0gNaCl 5.0g K2HPO4 2.5g蒸馏水1000ml3.Nutrient Agar (营养肉汁琼脂)Pepton (蛋白胨) 5g Beef extract (牛肉膏) 30gNaCl 5g Agar (琼脂) 15gDistilled water (蒸馏水) Adjust (调) pH to 7.0-7.24.RSL-盐酸鸟氨酸6.5g 氯化钠5.0gL-盐酸赖氨酸5.0g 脱氧胆酸钠1.0gL-盐酸半胱氨酸0.3g 酵母提取物3.0g麦芽糖 3.5g 溴麝香草酚蓝0.03g硫代硫酸钠6.8g 新生毒素0.005g枸橼酸铁铵0.8g 琼脂12.5g蒸馏水1000mL5.麦康凯蛋白胨20.0g 乳糖10.0g牛胆盐5.0g 氯化钠5.0g中性红0.03g 琼脂14.0gpH 6.9-7.3㈡几种试剂的制备波恩试剂：75% 饱和苦味酸25%福尔马林5%冰乙酸㈢细菌的分离1．待检材料的处理无菌采集的病料不经处理可直接用于分离；污染较严重的病料，接种前必须处理后方可进行分离培养。
微生物的实验
微生物的实验实验一油镜的使用方法与革兰氏染色实验目的:掌握油镜的使用方法与革兰氏染色的方法实验原理: 革兰染色法⑴革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，脂质含量多，乙醇易透入。
⑵革兰阳性菌等电点（pI 2~3）比革兰阴性菌（pI 4~5）低，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固，不易脱色。
⑶革兰阳性菌菌体含大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；革兰阴性菌含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色。
实验步骤: 1.涂片取洁净载玻片1张，用接种环取1～2环生理盐水放于载玻片上，用灭菌的接种环在固体培养基上挑取少许细菌与盐水混合，涂布成直径１cm左右的菌膜（可视挑取菌落的多少涂片范围相应变化）。
若采用液体培养物，可直接取1～2环菌液涂布。
接种环须经火焰灭菌方可放回原处，以免造成污染。
2.干燥涂片最好在室温中自然干燥，或将标本接种面向上，置酒精灯火焰高处慢慢烘干，切勿在火焰上烤。
3.固定干燥后的标本面向上迅速通过火焰3次，这样既可杀菌，又能将细菌固定在玻片上，以免玻片上细菌在染色过程中被水冲洗掉。
2.染色(1)初染：滴加结晶紫染液2～3滴于涂布细菌处，覆盖菌膜，1min后以细水漫过轻洗，将积水甩干。
(2)媒染：滴加卢戈碘液同上，1min后水洗，并将标本片上的积水甩净。
(3)脱色：加95%乙醇数滴于标本片上，轻轻摇晃数秒，斜持玻片使乙醇流掉，再滴加乙醇直至无紫色脱下为止（约30s，灵活掌握时间），细水冲洗，甩干。
(4)复染：滴加石炭酸复红染液，30s～1min后水洗，用吸水纸吸去积水。
3. 镜检用油镜观察，并判断细菌的染色性。
记录实验结果。
4.实验后处理擦干油镜镜头，整理、清洁显微镜，把显微镜放回原处，把标本片放入消毒缸中。
注意事项: 1.标本片涂的太薄或太厚，菌体分散布不均匀，都可影响染色结果。
微生物学实验指导
微⽣物学实验指导微⽣物实验守则微⽣物学实验的⽬的是：加深对微⽣物学理论知识的理解；扎实掌握实验的基本操作，并牢固建⽴⽆菌操作的概念；培养学⽣认真观察、发现问题、分析问题和解决问题的⼯作能⼒；树⽴学⽣实事求是、严肃认真的科学态度和勤俭节约、协作攻关的优良作风。
为了提⾼教学效果，保证实验质量和实验室安全，特提出如下注意事项。
1.每次实验前必须充分预习实验教材，以了解实验的⽬的、原理和⽅法，熟悉实验操作中的主要步骤和环节。
2.⾮必要的物品不要带⼊实验室，必须带进的物品应放在不影响实验操作的地⽅。
3.实验时认真听教师的讲解，仔细观察⽰范操作。
4.许多微⽣物有潜在的致病能⼒。
实验中要严格⽆菌操作，以免培养的微⽣物进⼊外界环境，并保证所培养的微⽣物不受污染。
①实验室内严禁餐饮。
②实验前洗⼿并⽤酒精棉球擦拭⼿和台⾯。
③实验操作过程中，要严格进⾏⽆菌操作，以防⽌菌体间交叉感染或致病菌对⼈体造成危害。
④在进⾏接种操作时，要关闭门窗，以防⽌空⽓对流，要尽量减少⾛动和讲话，以防⽌尘埃飞扬和唾沫四溅。
⑤⽤过的带菌吸管、滴管、玻⽚、涂布棒和移液器枪头等，⽤酒精或来苏尔等浸泡以后再进⾏清洗。
⑥离开实验室之前要⽤肥皂洗⼿。
⑦实验室中的菌种和物品等，未经教师允许，不得携带出实验室。
凡需进⾏培养的材料，都应注明菌种名、接种⽇期、处理⽅法及操作者姓名（或组别），放在制定的培养箱中进⾏培养。
5.如发⽣培养菌的器⽫打破、⽪肤破伤或菌液吸⼊⼝中等意外情况时，应⽴即报告指导教师，及时处理，菌液污染实验台⾯或其他物件时，应及时⽤3％的来苏尔或5％的⽯炭酸液擦拭消毒。
6.爱护仪器、设备，严格按照操作规程使⽤仪器、设备，以确保仪器的安全和学⽣的⼈⾝安全，并做好使⽤记录，确保仪器的正常使⽤。
7.按时观察实验现象，认真及时的做好实验记录，对于当时不能得到实验结果⽽需要连续观察的，则需记下每次的实验结果，以便分析。
清晰填写实验报告作业，科学阐述实验结论。
微生物培养技术手册
微生物培养技术手册一、前言微生物是生命科学中重要的一个研究领域，微生物培养技术是微生物研究的基础。
本手册旨在提供一份简明易懂的微生物培养技术指南，介绍微生物分类、培养方法和培养基制备等实验步骤。
二、微生物基础知识微生物是指体型微小的生物，包括细菌、真菌和病毒等。
微生物在自然界中广泛存在，是环境检测、生产加工和医学诊断等方面的重要对象。
1.微生物分类微生物按照形态分类可分为细菌、真菌和病毒，按照营养及生长需求分类可分为需氧菌和厌氧菌。
2.微生物培养基础微生物培养需要一定的培养基，培养基是一种支持微生物生长的营养溶液。
根据微生物的分类和需求，培养基可分为营养琼脂培养基、选种培养基、富集培养基等。
三、微生物培养方法根据不同的微生物分类和实验条件，微生物培养方法也有所不同。
下面介绍常用的细菌和真菌培养方法。
1.细菌培养方法（1）液体培养：将含有细菌的营养液置于培养器中，在适宜的条件下（光照、温度、氧气等），细菌在其中生长繁殖。
（2）平板培养：将含有细菌的营养琼脂培养基平铺在培养皿上，待琼脂凝固后，将细菌接种于平板上，细菌在琼脂表面形成菌落。
（3）斜面培养：与平板培养类似，只是将琼脂斜置于培养皿中，使细菌在琼脂表面上生长而不扩散至其它区域。
2.真菌培养方法（1）液体培养：将含有真菌孢子的液体营养基置于培养器中，在适宜的条件下（光照、温度、氧气等），真菌在其中生长繁殖。
（2）平板培养：将含有真菌孢子的营养琼脂培养基平铺在培养皿上，待琼脂凝固后，将真菌接种于平板上，真菌在琼脂表面形成菌落。
（3）分生子囊培养：真菌的生殖方式为分生子形成，可在特定的富集培养基上进行分生子囊培养，观察其分生子形成和发育过程。
四、微生物培养基制备微生物培养基的制备需要遵循一定的原则和步骤，下面以制备营养琼脂培养基为例，介绍具体的制备步骤。
1.原材料准备淀粉、蛋白胨、琼脂粉、氯化钠、磷酸氢二钠、葡萄糖、蛋白酶胨、磷酸氢氢二钾、氯化钙等原材料按照一定比例准备。
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微生物实验室规则与安全微生物学实验室规则医学微生物学实验的对象大多为病原微生物，具有传染性，因此要求进入实验室后必须严格遵守以下实验室规则：1．进入实验室应穿白大衣，离室时脱下，反折放回原处，不必要的物品不得带入实验室，必须带入的书籍和文具等应放在指定的非操作区，以免受到污染。
无菌操作时必须戴口罩，并不得开电风扇。
2．实验室内禁止饮食、抽烟，不得高声谈笑或随便走动。
3．各种实验物品应按指定地点存放，用过的器材必须放入消毒缸内，禁止随意放于桌上及冲入水槽。
4．须送温箱培养的物品，应做好标记后送到指定地点。
5．实验过程中发生差错或意外事故时，禁止隐瞒或自作主张不按规定处理，应立即报告老师进行正确的处理。
如有传染性的材料污染桌面、地面等，应立即用0.2%~0.5% “84”消毒液浸泡污染部位，作用5～10min后方可抹去。
如手被活菌污染也应使用上述消毒液浸泡5～10min后，再以自来水反复冲洗干净。
6．爱护室内仪器设备，严格按操作规则使用。
节约使用实验材料，不慎损坏了器材等，应主动报告老师进行处理。
7实验完毕，应物归原处并将桌面整理清洁，实验室打扫干净。
最后以0.2%~0. 5% “84”消毒液浸泡手5min，洗净后方可离开实验室。
实验一器皿包扎及消毒与灭菌一、实验目的1、了解玻璃器皿的清洗、棉塞制作、移液管和培养皿的包扎方法。
2、了解干热灭菌、紫外线灭菌、微孔滤膜过滤除菌和高压蒸汽灭菌的原理和应用范围。
3、掌握高压蒸汽灭菌的操作技术。
二、实验原理（1）实验室中使用的玻璃器皿简介微生物学实验所用的玻璃器皿，大多要进行消毒、灭菌和（将“和”改为“才能”）用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。
玻璃器皿的质量一般要求硬质玻璃，才能承受高温和短暂灼烧而不致破坏；玻璃器皿的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；对玻璃器皿的形状和包装方法的要求，以能防止污染杂菌为准；洗涤玻璃器皿的方法不当也会影响实验的结果。
目前微生物学实验室中，有些玻璃器皿（如培养皿、吸管等）已被一次性塑料制品所代替，但玻璃器皿仍是重要的实验室用具。
（2）灭菌的常用方法和基本原理实验室常用的灭菌方法有干热灭菌法、紫外线照射法、微孔滤膜过滤除菌法和高压蒸汽灭菌法等。
A.干热灭菌是用电热干燥箱（图1）加热，利用高温使微生物细胞内的酶、蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
B.紫外线杀菌机制主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制。
C.微孔过滤除菌（图2、图3）是通过机械作用滤去液体或气体中细菌、真菌孢子等的方法。
D.高压蒸汽灭菌也是使蛋白质变性而灭菌，高压蒸汽灭菌锅（图4、图5、图6）灭菌时是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。
待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。
导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
图1 电热干燥箱的外观和结构图2图3图4 高压蒸汽灭菌锅图5 卧式灭菌锅 图6 手提式灭菌锅1.安全阀；2.压力表；3.放气阀；4.软管；5.紧固螺栓；6.灭菌桶；7.筛架；8.水干热灭菌与高压蒸汽灭菌的灭菌效果与所灭物品的蛋白质含水量有很大的关系（表1）。
就效果而言，湿热灭菌效果要比干热灭菌效果好（表2）。
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要（表3），因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。
表1 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系卵白蛋白含水量/% 30分钟内凝固所需温度/℃ 50 56 25 74-80 18 80-90 6 145表2 干热、湿热穿透力及灭菌效果比较温度/℃ 时间/h 透过布层的温度/℃ 灭菌 10层 20层 100层 干热130-140 4 86 72 70.5 不完全 湿热105.3 3 101 101 101 完全 表3 灭菌锅内留有不同分量空气时压力与温度的关系压力数全部空气排出时的温度 2/3空气排出时的温度 1/2空气排出时的温度 1/3空气完全排除时的温度 空气完全排除时的温度MPa Kg/cm 2 1b/in 2 0.03 0.35 5 108.8100 94 90 72 0.07 0.70 10 115.6109 105 100 90 0.10 1.05 15 121.3115 112 109 100 0.14 1.40 20126.2 121 118 115 109 压 力 数 全部空气排出时的温度 (℃) 2/3空气排出时的温度 (℃) l/2空气排出时的温度 (℃) 1/3空气排出时的温度 (℃) 空气全不排出时的温度 (℃) MPa kg/cm 21b/in 2 0.03 0.07 0.10 0.14 0.17 0.21 0.35 0.70 1.05 1.40 1.75 2.10 5 10 15 20 25 30 108.8 115.6 121.3 126.2 130.0 134.6 100 109 115 121 126 130 94 105 112 118 124 128 90 100 109 115 121 126 72 90 100 109 115 1212、灭菌锅的使用（步骤）3、玻璃器皿包扎（培养皿、移液管）操作：每人尝试使用手提式灭菌锅1次，每组制作试管塞4个、三角瓶塞3个（2小，1大），练习包扎移液管4根，包扎玻璃培养皿1组灭菌。
七、思考题1、为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高，时间长？请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较的实验方案。
2、高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕之后，为什么待压力降至“0”时才能打开排气阀，开盖取物？3、你知道紫外线灯管是用什么玻璃制作的？为什么不用普通玻璃？实验二培养基的制备一、实验目的1、学习掌握培养基的配制原理；2、通过对几种培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。
二、实验原理培养基是供微生物生长、繁殖和代谢的营养物质，需要适宜的pH值、一定的缓冲能力及合适的渗透压。
在培养皿内培养微生物时需要添加凝固剂，实验室常用凝固剂是琼脂，即从石花菜等海藻中提取的多糖，是应用最广泛的凝固剂，它在96-100℃融化，46℃以下凝固，培养基经灭菌后方可使用。
（1）培养基据组成成分可分为:①合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。
②半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。
③天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。
（2）据用途可分为：①基础培养基：能满足各种微生物的营养需求的培养基。
②选择培养基：加入某种物质抑制其他微生物生长，使目标微生物得到富集，便于分离。
③鉴别培养基：用来检测微生物的某些代谢特性。
鉴别培养基：在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助开快速鉴别某种微生物。
如常用的麦康凯培养基，它含有胆盐、乳糖和中性红。
胆盐具有抑制肠道菌以外的细菌的作用（选择性），乳糖和中性红（指示剂）能帮助区别乳糖发酵肠道菌（如大肠杆菌）和不能发酵乳糖的肠道致病菌（如沙门氏菌和志贺氏菌）（3）从培养基的物理状态可分为：①液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。
②固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。
③半固体培养基：在液体培养基中加入0.2—0.5%凝固剂而成的半固体状培养基。
三、实验材料：1、溶液和试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/L HCl、1mol/L NaOH等。
2、仪器和其他用品：天平、试管、量筒、小烧杯、玻璃棒、药匙、pH试纸、棉花塞、报纸、棉绳、标签、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、电炉等。
四、实验步骤（1）称量。
●蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。
●牛肉浸膏用小烧杯或培养皿称量，然后热水溶化转移。
●称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。
●瓶盖不要盖错。
（2）熔化。
●配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化。
●向烧杯中加入少许所需要的水量，然后隔以石棉网小心加热，用玻棒搅拌，待药品完全溶解后定容，补足水分。
●在琼脂溶化时，应控制火力，以免沸腾而溢出容器。
需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。
（3）调pH。
●pH勿调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
灭菌后pH值会下降0.1～0.2，在做培养基校正pH值时，应比实际值高0.1～0.2。
●若偏酸，滴加1mol/L NaOH调整，若偏碱，滴加1mol/L HCl调整（4）过滤。
用滤纸或纱布过滤，供一般用的培养基此步骤可省略。
（5）分装。
分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上以免引起污染。
注意：固体装入试管中的量不宜超过试管高度的1/5，半固体1/3，装入三角烧瓶中的量以烧瓶总体积的一半为限。
（6）加塞。
培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶上塞好棉塞，以阻止外界微生物污染培养基，并保证有良好的通气性能。
（7）包扎。
加塞后，将全部试管用棉绳捆好，再在棉塞外包一层报纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，最后用扎好。
同时用记号笔注明培养基名称、配制日期、组别。
（8）灭菌。
将上述培养基以0.103MPa，121℃，15min高压蒸汽灭菌。
（9）搁置斜面。
灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管一端倾斜搁在玻璃棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管长的一半为宜。
（10）无菌检查。
将灭菌培养基于37℃，培养24-48h，以检查灭菌是否彻底。
五、注意事项:1. 蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。
另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。
2. 在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。
配置培养基时，不可用铜或铁锅加热熔化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。
3. pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。
4. 分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。
六、实验结果每组配制高氏1号培养基：100ml，试管斜面2个；牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：200ml，试管斜面4个；孟加拉红培养基：100ml，试管斜面2个。
剩余三角瓶内培养基保留瓶内，统一灭菌后，下次实验倒平板操作。
七、思考题1、培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是否为无菌的？2、在配置培养基的操作过程中应主要些什么问题，为什么？3、马丁氏培养基的pH“自然”，根据你配制前2种培养基的经验和所学知识你认为此培养基灭菌后应是偏酸还是偏碱？为什么？实验三无菌操作技术一、实验目的1、熟练掌握从固体培养物和液体培养物中转接微生物的无菌操作技术；2、体会无菌操作的重要性；3、掌握倒平板的基本操作方法。