质粒载体的发展
基因工程-载体
常用的质粒载体 pUC系列
University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造 而成。属正选择载体。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。 1、元件来源 复制起点ori---pBR322的 ori Ampr 基因---pBR322的Ampr基因 大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ’基因） 多克隆位点（MCS）区段---位于lacZ’基因 中的靠近5`-端。 2、长度 约2.7kb
Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 ApS Tcr为重组子
Apr Tcr为原载体
即为非重组子
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息， 但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一
个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin ）。符合 基因工程的安全要求。
大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠 杆菌素免疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数 量的作用。 大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1 。
第一节 质粒载体
质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
第四章 基因工程的质粒载体
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
质粒
pMB1
15-20
pUC系列质粒
pMB1
500-700
pACYC及其衍生质粒
p15A
10-12
pSC101及其衍生质粒
pSC101
∽5
ColE1
ColE1
15-20
1. 质粒复制的方式
质粒的复制主要是通过θ型复 制和滚环复制两种方式之一进 行的，其中以θ型复制为主。 在θ型复制中，有单向复制和 双向复制两种类型。
R100
产生抗生素或细菌素的质粒
产生毒素的质粒
降解质粒
水扬酸盐
萘
乙醛 丙酮酸盐
致病性质粒
Opines:冠樱碱 Octopine（章鱼碱） Nopaline（胭脂碱）
共生固氮质粒 隐蔽质粒
第三节 质粒的检测
一、质粒的消除
1. 理化因子消除法 质粒消除有两种作用机制： a. 对质粒本身的复制和分离产生抑制作用，从而在 细菌生长繁殖过程中逐步淘汰 b. 选择性抑制带有质粒的菌的生长
革兰氏阴性细菌中多数质粒是 以θ型方式复制，R1、R100等 是单向复制，F、R6k等是双 向复制类型。
在革兰氏阳性细菌 中大多数质粒是以 滚环方式复制。
2. 复制起点(ori)区的功能
复制起点是一段特定的DNA序列，长约几百碱基对，在 其相关的调控元件中含有由质粒或宿主染色体编码的、 参与DNA合成起始调控因子的结合位点。
2. 原生质体诱导的质粒消除
第三节 质粒的检测
二、遗传转移 三、分子杂交 四、质粒的分离、检测与纯化
1. 琼脂糖凝胶电泳 2. 氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心 3. 电镜观察
第四节 质粒的复制和调节
一、 质粒的大小和拷贝数
1. 质粒大小的测定 与标准质粒电泳比较，酶切分析，电镜照片推算，序列 分析。
质粒载体的概况及构建 ppt课件
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④ 用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞时转化细菌 有两个基本方法：
一是化学法，即用CaCl₂处理并加热激以促进DNA进入 菌体；
二是电激法，即施加短脉冲的电荷以促进DNA吸收。
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⑤ 筛选时会有三种结果：
一是要插入的序列自连，结果没有菌落形成；
二是切开的质粒重连，结果表现为蓝色菌落；
三是要插入的序列与质粒相连产生白色的抗氨苄青霉素菌 落。
pptቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ件
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THANKS
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（2）不相容性 同一复制系统的不同质粒在同一细菌中不能相容 不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存
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（3）可扩增性
• 质粒能自主地进行复制，这样它才能随着细菌细胞的 分裂而稳定地遗传。
• 质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨 型复制。
• 松弛型复制：拷贝数高，一个细胞中可达上千个拷贝；
★ 质粒不是细菌生长所必须的 ★ 可赋予细菌抵御外界因素不利影响的能力 ★ 分子量在1~200kb之间
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质粒（plasmid）
特点：
能在宿主细胞内独立复制；带有某些遗传信息，会赋予
宿主细胞一些遗传性状。 ppt课件
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（二）质粒的基本特性
(1) 自主复制性 质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori） 控制质粒拷贝数的基因 能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制
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质粒的制备
实验室一般使用两种方法制备质粒： （一）碱裂解法 （二）沸水浴法
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（1）碱裂解法
原理：利用溶菌酶在NaOH与SDS的混合溶液中破坏细菌 外壁，去除染色体DNA及变性蛋白质，离心，苯酚—氯仿 溶液处理，乙醇或异丙醇沉淀水相质粒。
质粒的分子生物学与质粒载体
质粒的分⼦⽣物学与质粒载体第三章质粒的分⼦⽣物学与质粒载体⼀、填空题1．基因⼯程中有3种主要类型的载体：——-------、------------⼀、-----------.2.由于不同构型的DNA插⼊EB的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同，SC DNA的泳动速度—----------—，OC DNA泳动速度—---------—，L DNA居中，通过凝胶电泳和EB染⾊的⽅法可将不同构型的DNA分别开来。
3.质粒的复制像染⾊体的复制⼀样，是从特定的起始点区开始的。
然⽽，质粒的复制可以是—---—向的、或是—----—向的。
在杂种质粒中，每个复制⼦的起点都可以有效地加以使⽤。
但是在正常条件下只有⼀个起点可能居⽀配地位。
并认为：当某些具有低拷贝数的严紧型质粒与松弛性质粒融合后，在正常情况下—------—的复制起点可能被苯闭。
4.就克隆⼀个基因(DNA⽚段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：—-----—、—---------—、—----------------—。
另外，⼀个理想的质粒载体必须具有低分⼦量。
5.如果两个质粒不能稳定地共存于同⼀个寄主细胞中，则属于—---------—群，这是因为它们的——————————所致。
6.质粒拷贝数是指细胞中—------------------------—。
7.复制⼦由三部分组成：(1)—-----------------—---(2)——-----------————(3)—--------------—。
8.酵母的2µm质粒有------------，可以配对形成哑铃结构。
9.⼀个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养⼀段时间后，⼀部分细胞中已测不出质粒，这种现象叫----------------。
10.pBR322是⼀种改造型的质粒，它的复制⼦来源于----——，它的四环素抗性基因来⾃于—-----------—，它的氨苄青霉素抗性基因来⾃于—---------—。
质粒与载体
质 质粒 粒与 与载 载体体 中央研究院 植物研究所 杜 镇 研究员一、质粒绝大多数的生物都是以 DNA 的形式来储藏其遗传信息。
遗传物质要能生生不息地传给后代 的首要条件就是它至少要具有一个复制原(ori, origin of replication ，或译为复制起点)，使整 个基因体得以复制。
含有复制原的遗传物质称为 replicon ，我们姑且把它译为为复制体吧！。
原核性复制体分为原核染色体、质粒(plasmids)和噬菌体基因体(phage genome)等三类。
其中 质粒的基因体和原核染色体类似，是由双绞炼 DNA 构成，并以超卷曲的形式存在。
它们的 基因体约由 2,000 至 150,000 个碱基对组成，绝大多数呈环状，但也有极少数是线状构造(如 Borrelia burgdorfferi)。
事实上你可以把它们视为比较小的原核染色体。
在自然环境中它们相 当普遍地生存在原核生物细胞内，并和其宿主的许多特殊功能有关，诸如：赤贺氏杆菌 (Shigella)的抗药、根瘤菌(Rhizobium)的固氮、农杆菌(Agrobacterium)的引瘤及假单胞杆菌 (Pseudomonas)对环状有机物的分解等等。
以下我们谈的以细菌性质粒为主，尤其是革兰氏阴 性菌的质粒。
二、质粒的类型当我们谈到质粒的类型时，就要看你从哪个角度来看它们，譬如说抗药性、结合生殖能力、 宿主范围及 DNA 复制方式等等。
这些分型标准之间并无横向关联。
你无法说能结合生殖的 质粒一定抗药或不抗药，也无法确定宿主范围和质粒套数的调控有何关联。
我们用到这些名 词时，只是对特定质粒的性状做一些描述而已。
质粒的真正系统分类标准并非靠些性状，而 是依据它们的不共容性(incompatibility)。
有的质粒带有显著特征可供我们侦测它们的存在，无已知特征的质粒称为隐性质粒(cryptic plasmids)；有特征者称为显性质粒(acryptic plasmids)；带有抗药基因的天然质粒称为 R质 粒(Rplasmids)。
基因工程基因工程的载体
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体的基本功能
1. 运送外源基因高效转入受体细胞 2. 为外源基因提供复制能力或整合能力 3. 为外源基因的扩增或表达提供条件
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叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体必须具备的基本条件
1）标记基因与宿主细胞 2）标记基因产物的作用机制: Apr 3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起始
序列, 密码子偏爱性
4）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS
4. 常用的遗传标记基因
1) 四环素抗性基因（Tcr）
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白 质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码 一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分 子进入细菌细胞。
第三章 基因工程的载体
载体：携带外源基因进入受体细胞的工具 用于基因工程的载体
•细菌质粒载体 •噬菌体λ衍生载体 •Cosmid载体 •Phagemid载体
•酵母质粒载体 •真核病毒载体 •Bacmid载体 •YAC载体
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发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，
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2) 氨苄青霉素抗性基因（Apr）
Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr 抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β—内酰胺环的 水解，使氨苄青霉素失活。
3) 氯霉素抗性基因（Cmr）
质粒载体的概况及构建
特性
稳定性
质粒载体可以在宿主细胞内稳 定存在，不易丢失或发生突变
。
可复制性
质粒载体可以在宿主细胞内自 主复制，扩增DNA分子。
可选择性
质粒载体通常携带抗性基因， 可以通过抗生素筛选和富集。
可修饰性
质粒载体可以通过限制性酶切 和连接等分子生物学技术进行
修饰和改造。
质粒载体的应用领域
克隆技术
质粒载体是基因克隆和DN择
天然质粒载体
01
存在于生物体内的天然质粒，具有自我复制能力，可在宿主 细胞内稳定存在。
02
天然质粒通常具有抗生素抗性基因，可作为筛选标记基因。
03
天然质粒载体的复制能力有限，拷贝数较低，且容易丢失。
人工构建的质粒载体
通过基因工程技术人工构建的质粒载体，具有特 定的复制起始位点和筛选标记基因。
转化与筛选
转化
将连接产物导入受体细胞中，常用的受体细胞有细菌、酵母、动物细胞等。
筛选
通过抗性筛选、PCR鉴定等方法对转化子进行筛选，获得阳性克隆。
04
质粒载体的改造与
优化
启动子的优化
选择合适的启动子
启动子突变
根据基因的表达需求，选择合适的启 动子，如强启动子、弱启动子等。
通过突变启动子序列，改变其转录活 性，以实现基因表达的调控。
功能元件
选择含有合适功能元件的质粒载体，如启动 子、多克隆位点等，以满足实验需求。
稳定性
选择稳定性好、不易丢失的质粒载体，以确 保目的基因在宿主细胞内的稳定表达。
03
质粒载体的构建过
程
目的基因的获取与鉴的基因。
目的基因的鉴定
通过测序、限制性酶切、PCR扩 增等手段对目的基因进行鉴定， 确保其准确性。
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质粒载体的发展
质粒载体即，在由限制性核酸内切酶修饰过的质粒DNA序列中插入外源的目的基因，以质粒为载体，将目的基因通过转化或转导的方法导进宿主细胞，进行重组、筛选、扩增的过程。
目录
编辑本段质粒载体简介
质粒是小型环状DNA分子，在基因工程中作为最常用，最简单的载体，必须包括三部分：遗传标记基因，复制区，目的基因。
质粒在所有的细菌类群中都可发现，它们是独立于细菌染色体外自我复制的DNA分子。
自然界中，质粒是在营养充足时出现的，它在结构、大小、复制方式，每个细菌的拷贝数，在不同的细菌体内的繁殖力，在菌种之间的转移力等方面都会变化，可能最重要的是质粒所携带的特征的改变。
大多数原核生物的质粒是双链环状的DNA分子；但是无论是在革兰式阳性还是阴性菌体内都可以发现线状质粒。
质粒大小变化很大，可从几个到数百个kb。
质粒依靠宿主细胞提供的蛋白质进行复制，但也可以使宿主细胞获得质粒编码的功能。
质粒复制可以与细菌的细胞周期同步，导致菌体内质粒的拷贝数较低，质粒复制也可独立于细胞周期，使每个菌体内扩增了成百上千个质粒拷贝。
一些质粒在菌种间可自由地转移它们的DNA分子，另一些只转移质粒给同种细菌，而有些却根本不转移它们的DNA。
质粒带有具有许多功能的基因，这些功能包括对抗生素和重金属道德抗性、对诱变原的敏感性、对噬菌体
的易感或抗性、产生限制酶、产生稀有的氨基酸和毒素、决定毒力、降解复杂有机分子，以及形成共生关系的能力和在生物界内转移DNA的能力。
编辑本段质粒的基本特征
质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。
其特点如下：
是染色质外的双链共价闭合环形DNA
（covalently closed circuar DNA,cccDNA），可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300kb之间，<15kb的小质粒比较容易分离纯化，>15kb 的大质粒则不易提取。
能自主复制，是能独立复制的复制子
（autonomous replicon）。
一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。
按质粒复制的调控及其拷贝数可分两类：严紧控制（stringent control）型质粒的复制常与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞中只有1个到十几个拷贝；另一类是松弛控制（relaxed control）型质粒，其复制宿主不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。
每个质粒DNA上都有复制的起点，只有ori能被宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制，不同质粒复制控制状况主要与复制起点的序列结构相关。
有的质粒的可以整合到宿主细胞染色质DNA中，随宿主DNA复制，称为附加体，例如细菌的性质粒就是一种附加体，它可以质粒形式存在，也能整合入细菌的DNA，又能从细菌染色质DNA上切下来。
F因子携带基因编码的蛋白质能使两个细菌间形成纤毛状细管连接的接合（conjugation），通过这细管遗传物质可在两个细菌间传递。
质粒对宿主生存并不是必需的
这点不同于线粒体，线粒体DNA也是环状双链分子，也有独立复制的调控，但线粒体的功能是细胞生存所必需的。
线粒体是细胞的一部分，质粒也往往有其表型，其表现不是宿主生存所必需的，但也不妨碍宿主的生存。
某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称R质粒，带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。
所以质粒对宿主不是寄生的，而是共生的。
医学上遇到许多细菌的抗药性，常与R质粒在细菌间的传播有关，F质粒就能促使这种传递。
现在分子生物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工的改造。
从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体，近年来发展很快，新的有特定用途的质
粒不断被创建。
图20-2给出最常用的大肠杆菌克隆用质粒pUC19的图谱，此质粒的复制起点处序列经过改造，能高频率起动质粒复制，使一个细菌pUC19的拷贝数可达500-700个；质粒携带一个抗氨芐青霉素基因，编码能水解β-内酰胺环，从而破坏氨芐青霉素的酶，当用pUC19转化细菌后放入含氨芐青霉素的培养基中，凡不含pUC19者都不能生长，结果长出的细菌就是都含有pUC19的；pUC19还携带细菌lac操纵元中的lacI和lacZ基因编码，β-半乳糖苷酶N端状146个氨基酸的段落，当培养基中含有诱导物IPTG和Xgal时，lacz ' 基因被诱导表达产生的β-半乳糖苷酶N端肽与宿主菌表达的C端肽互补而具有β-半乳糖苷酶活性（质粒和宿主编码的肽段各自都没有酶活性，两都融为一体而具酶活性，称为α-互补，
α-complementation），半乳糖苷酶水解Xgal而使菌落呈现蓝色；在lacz '中间又插入了一段人工设计合成的DNA序列，其中密集多个常用的限制性核酸内切酶的位点，使外来的基因和序列能很方便地被插入此位置，当外来序列插入后则破坏了lacz '编码的半乳糖苷酶活性，生长的菌落就呈白色，这种颜色标志的变化就很容易区分和挑选含有和不含有插入序列或基因的转化菌落，称为蓝白筛选法。
除常用的大肠杆菌质粒载体外，近年来发展了许多人工构建的其它能用于微生物、酵母、植物等的质粒载体。
含有不止一个ori、能携带插入序列在不同种类宿主细胞中繁殖的载体称为穿梭载体（shuttle vectors）。
按复制形式
分为严紧型和松弛型复制。
按基因转移性
分两类：（1）传递性质粒：常为大型、严紧型质粒；
（2）非传递性质粒：多为小型、松弛型质粒。
按遗传性状、产物分类
（1）抗生素抗性：如氨苄西林、氯霉素抗性；
（2）限制酶-修饰酶（R-M）系统：如hsdR-菌株可使DNA甲基化，但不限制外源DNA；hsd-菌株为限制和甲基化双缺陷型。
高拷贝数的质粒载体
ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。
适合大量增殖克隆基因，或需要大量表达的基因产物。
低拷贝数的质粒载体
由 pSC101派生来的载体特点是分子量小的拷贝。