质粒载体分类及阅读
☆如何阅读质粒图谱
如何阅读质粒图谱最近由于实验需要,需要查阅载体图谱,到园子里搜罗一番,发现虽然有人问载体图谱阅读的问题,也有前辈回答,但都不详细,借自己也在琢磨这个问题的机会,将我学到的东西整理一下,于大家分享。
载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
一、一个合格质粒的组成要素#复制起始位点Oril 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
＃抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+l ,Kan+＃多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段l＃P/E 启动子/增强子l＃Termsl 终止信号＃加poly（A）信号l 可以起到稳定mRNA作用二、如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（卡那霉素衍生物）失活（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。
它具有多个限制酶的单一切点。
便于外源基因的插入。
如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。
质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。
一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
这是用来区别克隆载体与表达载体。
克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。
选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号＃启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
第四章 基因工程的质粒载体
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
质粒载体种类
质粒载体种类
质粒载体是在基因工程中经常使用的一种工具，常见的质粒载体种类包括：
1. Shuttle质粒载体：能够在多个宿主生物中复制的质粒载体，通常用于在不同宿主中进行基因表达或基因转导的研究。
2. 表达质粒载体：用于将特定基因的DNA序列插入到质粒载
体中进行表达的载体，通常包括启动子、转录终止子和选择标记基因等。
3. 空质粒载体：通常只包含质粒的骨架结构，没有包含具体的基因，常用作对照实验的负对照。
4. 感受态质粒载体：这种质粒载体可与RNA或DNA片段融合，形成DNA-RNA复合体，通常用于RNA干扰实验。
5. 水平转移质粒载体：这种质粒载体能够在细菌中进行一种称为水平转移的传递，用于研究基因在不同细菌中的传播。
6. 呈味性质粒载体：这种质粒载体能够在菌落中形成代谢产物，在实验室中常用于菌落筛选。
以上是一些常见的质粒载体种类，不同种类的质粒载体在基因工程中扮演不同的角色，被用于不同的研究目的。
质粒载体
质粒载体简介质粒在所有的细菌类群中都可发现，它们是独立于细菌染色体外自我复制的DNA分子。
自然界中，质粒是在营养充足时出现的，它在结构、大小、复制方式，每个细菌的拷贝数，在不同的细菌体内的繁殖力，在菌种之间的转移力等方面都会变化，可能最重要的是质粒所携带的特征的改变。
大多数原核生物的质粒是双链环状的DNA分子；但是无论是在革兰式阳性还是阴性菌体内都可以发现线状质粒。
质粒大小变化很大，可从几个到数百个kb。
质粒依靠宿主细胞提供的蛋白质进行复制，但也可以使宿主细胞获得质粒编码的功能。
质粒复制可以与细菌的细胞周期同步，导致菌体内质粒的拷贝数较低，质粒复制也可独立于细胞周期，使每个菌体内扩增了成百上千个质粒拷贝。
一些质粒在菌种间可自由地转移它们的DNA分子，另一些只转移质粒给同种细菌，而有些却根本不转移它们的DNA。
质粒带有具有许多功能的基因，这些功能包括对抗生素和重金属道德抗性、对诱变原的敏感性、对噬菌体的易感或抗性、产生限制酶、产生稀有的氨基酸和毒素、决定毒力、降解复杂有机分子，以及形成共生关系的能力和在生物界内转移DNA的能力。
人工构建的质粒载体分类高拷贝数的质粒载体ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。
适合大量增殖克隆基因，或需要大量表达的基因产物。
低拷贝数的质粒载体由pSC101派生来的载体特点是分子量小的拷贝数。
它有特殊的用途：当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌的死亡时，就需要低拷贝的载体。
失控的质粒载体这是一类温度敏感型复制控制质粒。
如pBEU1、pBEU2。
插入失活型克隆载体。
载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。
如pDF41、pDF42。
正选择的质粒载体直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。
质粒载体的筛选特征选择质粒载体的要素是要了解可用到的载体的特征和预测重组克隆所用于的实验。
所有的质粒载体都有三个共同的特征：一个复制子、一个选择性标志和一个克隆位点。
质粒种类与应用
无菌落
筛选重组子
阳性菌落
Ampr Tcs
提取DNA 电泳
重组DNA
pUC质粒系列
pUC质粒系列也是在pBR322基础上改建成旳。 它具有pBR322旳大部分，涉及完整旳ampr基因和复制起 始点。清除了pBR322旳tetr区段，换用了M13噬菌体旳
476bp片段，含LacZ 基因及其开启子旳操纵基因、M13旳
mob 基因决定
20230421
质粒旳基本特征
质粒
携带特殊旳遗传标识
野生型旳质粒DNA上往往携带一种或多种遗传标识基因，这
使得寄主生物产生正常生长非必需旳附加性状，涉及：
物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物
物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱
这些标识基因对DNA重组分子旳筛选具有主要意义
EcoRI
HindIII
LacZ
pUC19
Ori复制起点
APR
质粒
质粒DNA旳分离纯化 试验室一般使用下列三种措施制备质粒DNA ： 氯化铯密度梯度离心法 质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染 沸水浴法 质粒DNA纯度底、迅速、操作简便 碱溶法 质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间
载体旳功能及特征
载体应具有旳条件
具有针对受体细胞旳亲缘性或亲和性（可转移性） 具有与特定受体细胞相适应旳复制位点或整合位点 具有较高旳外源DNA旳载装能力 具有多种单一旳核酸内切酶辨认切割位点 具有合适旳筛选标识
质粒(plasmid )
Plasmid 独立于细菌染色体外旳双链环DNA分子。
Plasmid
以14C标识旳半乳糖作底物,检测生成旳*Gal-1-P旳放射性。
质粒载体分类及阅读
质粒载体分类及阅读质粒载体分类及阅读一.九种表达载体Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C,pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA二.克隆载体pTZ19R DNApUC57 DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescript II KS (+)L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD926三.PET系列表达载体Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Dsb Fusion Systems 39b and 40bProtein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Expression System 33b Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? p ETExpression Systems Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Expression Systems plus Competent CellsProtein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET GST Fusion Systems 41 and 42Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET NusA Fusion Systems 43.1 and 44Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Vector DNAProtein Purification ? Purification Systems ? Strep?Tactin Resins and Purification Kits四.PGEX系列表达载体T EcoR pGEX-1 I/BAPpGEX-2TpGEX-2TKpGEX-3XpGEX-4T-1pGEX-4T-2pGEX-4T-3pGEX-5X-1pGEX-5X-2pGEX-5X-3pGEX-6P-1pGEX-6P-2pGEX-6P-3五.PTYB systemPTYB1PTYB2PTYB11PTYB12六.真核表达载体pCDNA3.1(-)pCDNA3.1(+)pPICZ alpha ApGAPZαAPYES2.0pBI121pEGFP-N1pEGFP-C1pPIC9KpPIC3.5K如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
质粒载体解析.pptx
第三节质粒载体的构建
• 1．天然质粒用作克隆载体的局限性
• 2．质粒载体必须具备的基本条件
• 3．质粒载体的选择记号
• 4．不同类型的质粒载体
•
(1)高拷贝数的质粒载体
•
(2)低拷贝数的质粒载体
•
(3)失控的质粒载体
•
(4)插入失活型的质粒载体
•
(5)正选择的质粒载体
•
(6)表达型的质粒载体
第69页/共99页
pBR32 2
EcoRI
EcoRI Klenow
HaeⅢ λ pla c
EcoR I
HaeⅢ
EcoR I
HaeIII
ligation HindIII
pBH20
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BamHI
lac
Hha HindIII
EcoRI
pBH2 0
HindII I
lac
Hha HindIII
III
EcoRI PstI
EcoRI PstI
ligation PstI
Amp
EcoRI
pSomII
Somastetin
BamHI
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EcoRI
Samast etin BamH I
PstI Amp
EcoRI
pSomII
Somastetin
BamHI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
Lac-β-gal
•
(2)杂种质粒拷贝数的控制
第39页/共99页
Co1El、pSCl 01及其杂种质粒pSCl34的DNA复制
第40页/共99页
4．质粒复制控制的分子模型
质粒载体种类
质粒载体种类
质粒载体种类繁多，可以根据其功能和用途进行分类。
以下是一些常见的质粒载体类型：
1. 克隆载体：这种类型的质粒主要用于克隆和扩增DNA片段。
它们通常具有易于克隆的限制性酶切位点，以及细菌选择标记和多克隆位点。
2. 表达载体：表达载体用于在宿主细胞中表达目的基因。
这些载体包含可调控的启动子和终止子，以及选择标记和目的基因的克隆位点。
3. 干扰基因表达载体：这种载体主要用于抑制目标基因的表达。
它们通常包含干扰RNA（RNAi）的序列，以沉默特定基因的表达。
4. 病毒载体：病毒载体可以利用病毒的特性来传递遗传物质。
它们可以携带治疗性基因或用于基因编辑，并通过感染宿主细胞来传递这些基因。
此外，还可以根据质粒的拷贝数、复制起始区、选择标记基因区、多克隆位点等特征对质粒载体进行进一步分类。
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质粒载体分类及阅读
一.九种表达载体
Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C,
pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA
二.克隆载体
pTZ19R DNA
pUC57 DNA
PMD18T
PQE30
pUC18
pUC19
pTrcHisA
pTrxFus
pRSET-A
pRSET-B
pVAX1
PBR322
pbv220
pBluescript II KS (+)
L4440
pCAMBIA-1301
pMAL-p2X
pGD926
三.PET系列表达载体
Protein Expression » Prokaryotic Expression » pET Dsb Fusion Systems 39b and 40b
Protein Expression » Prokaryotic Expression » pET Expression System 33b Protein Expression » Prokaryotic Expression » p ET Expression Systems Protein Expression » Prokaryotic Expression » pET Expression Systems plus Competent Cells
Protein Expression » Prokaryotic Expression » pET GST Fusion Systems 41 and 42
Protein Expression » Prokaryotic Expression » pET NusA Fusion Systems 43.1 and 44
Protein Expression » Prokaryotic Expression » pET Vector DNA
Protein Purification » Purification Systems » Strep•Tactin Resins and Purification Kits
四.PGEX系列表达载体
T EcoR pGEX-1 I/BAP
pGEX-2T
pGEX-2TK
pGEX-3X
pGEX-4T-1
pGEX-4T-2
pGEX-4T-3
pGEX-5X-1
pGEX-5X-2
pGEX-5X-3
pGEX-6P-1
pGEX-6P-2
pGEX-6P-3
五.PTYB system
PTYB1
PTYB2
PTYB11
PTYB12
六.真核表达载体
pCDNA3.1(-)
pCDNA3.1(+)
pPICZ alpha A
pGAPZαA
PYES2.0
pBI121
pEGFP-N1
pEGFP-C1
pPIC9K
pPIC3.5K
如何阅读分析质粒图谱
载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
一、一个合格质粒的组成要素
复制起始位点Ori即控制复制起始的位点。
原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+
多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段
P/E启动子/增强子
Terms 终止信号
加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用
二、如何阅读质粒图谱
第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）
第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。
它具有多个限制酶的单一切点。
便于外源基因的插入。
如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。
质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA 片段。
一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
这是用来区别克隆载体与表达载体。
克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。
选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号
启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。
其作用与增强子所在的位置或方向无关。
即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。
/沉默子－负增强子，负调控序列。
核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。
转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。
结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA 的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。
回答有人之前提出的一个问题：为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上.
三、介绍一下关于载体的知识（虽然课本上都有写）
1. 什么是载体
即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。
P.S.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA
2. 载体的分类
―――按功能分成：（1）克隆载体都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。
它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。
（所以有时实验时扩增效率低下，要注意是不是使用的严谨行载体）
（2）表达载体具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译
所必需的DNA顺序的载体。
―――按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）.
P.S. 穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子，以确保两类细胞中都能扩增。
3. 基因工程载体的3个特点：
（一）都能独立自主的复制：载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被动的跟着载体一起复制/扩增，就像载体的正常成分一样。
（二）都能便利的加以检测：如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因，将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。
（三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。
4. 载体的选择和制备：
选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：
【1】构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：
（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意3点：
①选择合适的启动子及相应的受体菌；
②用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；
③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。
选用质粒（最常用）做载体的4点要求：
①选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；
②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；
④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得分子，以便于与目的基因片段进行连接。