Protein Crystallography-蛋白质结晶学
蛋白质结晶和晶体学研究方法及其在抗体药物研发中的应用
蛋白质结晶和晶体学研究方法及其在抗体药物研发中的应用蛋白质结晶及晶体学研究方法是现代生物科技研究领域中不可或缺的研究方法之一。
由于蛋白质的体积和结构较大，难以直接观察和研究，于是人们就提出了结晶的方法来解决这一难题。
在人们持续的努力下，结晶及晶体学研究方法不断地得到改进和创新，并在生物药物研发中被广泛应用，取得了显著的研究成果。
一、蛋白质结晶的方法蛋白质结晶是将分子间的生物分布在一个适当的环境中，使它们形成固态晶体的一种方法。
蛋白质结晶的方法有几种，如扫描无水乙醇法、坩埚法、插板法和烧结法等。
1、扫描无水乙醇法扫描无水乙醇法是将无水乙醇涂在玻璃板上，然后将蛋白液滴于板上，接着慢慢地吸干水分，待结晶出现时，将其滴入冰冷的硫酸铵或硫酸钾中。
这种方法适用于弱溶剂条件下晶体生长和微重力条件下的生长。
2、坩埚法坩埚法是将蛋白液通过坩埚滴入一种宿主结晶材料中，如PEG、铵盐等。
这种方法适用于大多数蛋白质和其它材料。
3、插板法插板法是用金属或塑料板制成的插板，在其间滴上蛋白溶液，等待结晶出现，然后将其转移到盘中。
这种方法适用于间接毒性的还原剂和其它有毒物质。
4、烧结法烧结法是将蛋白溶液和烧结剂混合后烘干，然后在其中加入所需的溶液来促进结晶的出现。
这种方法适用于微量和低批量生产。
二、晶体学研究方法晶体学研究方法是指对蛋白质晶体进行分析研究的方法，可以是X射线晶体学，也可以是NMR等。
1、X射线晶体学X射线晶体学是晶体学研究中最核心的方法之一。
其通过测量晶体中光的散射来研究晶体的分子结构和空间排列。
X射线晶体学可用于研究分子的结构、功能和生物反应机理。
通过X射线晶体学技术，人们已经得到了多种蛋白质晶体的结构信息，例如转化生长因子、胞嘧啶、Rhodopsin等。
2、NMRNMR是核磁共振的缩写，它是一种利用核磁共振来测定物质中核子的位置、局部周围环境、质量和化学位移的技术。
NMR技术在蛋白质结构研究中常被用于研究蛋白质的溶液结构。
Crystallographic analysis of protein structures
Crystallographic analysis of proteinstructures蛋白质是生命体中不可或缺的基本单位，其结构与功能密不可分。
了解蛋白质的结构对于理解其功能以及药物研发至关重要。
蛋白质的晶体学分析，即晶体学计算机成像技术，是一种重要的手段，用于确定蛋白质结构。
本文将介绍蛋白质晶体学分析的一些基本知识和应用。
一、晶体学的概念晶体学是研究物质的周期性结构的科学。
晶体是一种有序排列的分子或原子，具有平面或面板对称性。
晶体的结构可以通过X射线衍射技术来确定。
晶体学分析是一种计算机成像技术，用于确定蛋白质在晶体中的结构。
二、晶体学分析的原理晶体学分析是通过测量X射线在晶体上散射的路程和强度来确定蛋白质的结构。
X射线具有波粒二象性，它们的波长非常短，可以穿透许多普通光线不能穿透的物体。
当X射线通过晶体时，它们会在晶体中发生散射。
这些散射信号产生了X射线衍射图，提供了晶体内原子的位置和排列方式。
三、晶体学分析的步骤晶体学分析通常有以下几个步骤：1.纯化蛋白质：在晶体学分析之前，需要从生物组织中提取和纯化蛋白质。
2.制备晶体：通过结晶方法将蛋白质晶体生长到足够大的大小。
3.收集X射线数据：使用X射线衍射技术测量晶体上的X射线衍射图案，并记录每个数据点。
4.解析结构：使用计算机程序解构和绘制3D模型来描绘晶体中分子的位置和结构。
四、晶体学分析的应用晶体学分析在许多领域都有广泛的应用，如生命科学和化学科学。
在药物设计中，了解蛋白质结构是非常重要的。
药物通常通过与目标蛋白质结合来发挥作用。
因此，确定药物分子和蛋白质结构之间的相互作用是非常有用的。
在生命科学中，晶体学分析用于理解特定蛋白质的功能和结构，这对于治疗疾病是非常关键的。
总之，晶体学分析是一种强大的技术，用于研究物质的周期性结构，特别是在解析蛋白质结构和在药物设计中发挥重要作用。
晶体学分析的技术以及其应用领域的不断发展，使其成为现代科学研究中的一项不可或缺的技术之一。
生物分子相互作用的实验方法与分析技术
生物分子相互作用的实验方法与分析技术生物分子相互作用是指生物体内分子之间的相互作用，包括蛋白质与DNA、RNA、低分子化合物等的相互作用。
了解生物分子相互作用的方法可以帮助我们更好地理解生命过程，从而为疾病治疗、药物研发等提供有益的指导。
下面将介绍几种常用的生物分子相互作用实验方法与分析技术。
1. 亲和层析法（affinity chromatography）亲和层析法是一种利用特定配体与目标分子的亲和作用进行分离和纯化的方法。
一般分为亲和柱层析和免疫沉淀两种。
亲和柱层析是将特定配体固定在柱子上，利用配体与目标分子的亲和作用将其吸附在柱子上，在洗脱过程中分离目标分子。
免疫沉淀则是利用特异性抗体与目标分子结合，再将抗体-目标分子复合物通过一系列的洗涤步骤分离。
2. 免疫共沉淀法（co-immunoprecipitation）免疫共沉淀法利用抗体特异性地结合目标分子，然后以抗体为桥梁将与目标分子结合的其他分子一同沉淀下来。
通过分析沉淀物中的分子成分，可以确定目标分子与其他蛋白质的相互作用关系。
该方法通常与免疫检测技术（如免疫印迹）相结合使用，可以用来研究蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA/RNA等之间的相互作用。
3. 蛋白质结晶与X射线晶体衍射（protein crystallization andX-ray crystallography）蛋白质结晶与X射线晶体衍射是研究蛋白质三维结构的常用方法。
首先通过体外重组表达得到目标蛋白质，并将其进行纯化和结晶处理。
然后在适当的缓冲溶液中形成结晶，最后通过X射线衍射测定结晶体的晶体学参数，通过计算和解析来得到蛋白质的三维结构。
蛋白质结晶和X射线晶体衍射为药物研发提供了重要的结构信息，例如为针对特定蛋白质的药物设计提供靶标。
4. 双杂交法（yeast two-hybrid）双杂交法是研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验方法。
该方法利用酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）的生殖特点，将转录因子中的DNA结合域（DNA binding domain，DBD）和激活域（activation domain，AD）分别与两个蛋白质结合。
Advanced Approaches to Protein Crystallization
Advanced Approaches to ProteinCrystallization随着现代生命科学技术的发展，人们对蛋白质的研究也越来越深入。
但是，蛋白质的研究离不开蛋白质结晶，因为只有获得足够清晰的结晶，才能解析出分子的内部结构。
手工结晶已经是过去式，现在科学家们探索先进的蛋白质结晶方法，不断提高结晶效率，以推动蛋白质的研究进一步发展。
本文将介绍几种先进的蛋白质结晶方法。
一、晶体工程在晶体工程技术中，美国女科学家哈里特·科甘（Harriet Kung）被认为是创始人之一。
她提出的“极端条件”法被视为难以结晶蛋白质的突破。
传统结晶过程中，空间中的一种或多种有机固体或无机盐类在凝胶中逐渐结晶，生成斑驳有致的晶体。
然而，这个过程对于许多重要而复杂的蛋白质非常难实现。
为了克服这些困难，科学家们创造了许多不同的条件。
在“极端条件”法中，科学家在结晶的过程中添加一种称为毛细池（capillary well）的通道，分离出结晶的反应混合物。
这种逼迫样品生成小结晶核，然后逐渐增长的微观环境极大地改善了结晶的速度。
二、电泳晶体研究(Electrocrystallization)电泳晶体研究技术对于获得均匀的晶体很有帮助，通过将样品带电后置于电介质中，可以在非均匀电场中促进结晶。
这样，不同的离子可以受到不同的力，从而形成更宽的结晶颗粒尺寸。
在某些情况下，这种方法可以实现均一晶体的生长并获得良好的治疗性响应。
三、超声波晶体(Crystal by Ultrasound)超声波结晶是将溶液置于超声波中以形成均匀的晶体的方法。
这种方法的优点是可以提高溶液的浓度，从而加快结晶过程并生成更大的结晶。
在蛋白质方面，这意味着更快的结晶速度并更高的结晶效率。
四、板区极小化技术(Microfluidic Platform)结晶研究中的板区极小化技术是一种最近提出的技术。
该技术利用微流控制可控的离子交换实现多种蛋白质的合成过程，同时可以精确控制溶液的体积和质量，利用奇妙的微流控设备实现更精确的分子构象和晶体结构分析。
检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术
检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术蛋白质之间的相互作用对于生物体的正常功能和生理进程至关重要。
因此，了解和研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用对于疾病研究和新药发现具有重要意义。
本文将介绍常见的用于检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术。
1. 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）免疫沉淀是一种常用的方法，用于鉴定和分离与特定抗原相互作用的蛋白质。
该方法利用特异性抗体结合特定蛋白质并沉淀出来，然后通过电泳、质谱或免疫印迹等分析方法进行检测。
这种方法不仅可以用于识别特定的蛋白质-蛋白质相互作用，还可以捕获整个蛋白质复合物。
2. 酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）酵母双杂交是一种广泛应用于蛋白质-蛋白质相互作用的实验技术。
该方法利用了转录因子的两个功能域的相互作用来检测蛋白质-蛋白质相互作用。
这种方法包括构建两个融合蛋白质：一个与DNA结合域融合的结构域和一个与激活域融合的结构域。
当两个融合蛋白质相互结合时，它们能够重新组装转录因子并激活报告基因的表达。
3. 质谱（Mass Spectrometry，MS）质谱是一种常用于分析蛋白质-蛋白质相互作用的技术。
图谱可以通过分析蛋白质混合物的质量和荷质比来确定蛋白质相互作用的可能性。
质谱技术包括多肽和蛋白质质量指纹图谱（Peptide and protein mass fingerprinting），包括基于基质辅助激光脱附电离（Matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）和电喷雾（Electrospray Ionization，ESI）的方法。
4. X射线晶体学（X-ray crystallography）X射线晶体学是一种用于解析蛋白质-蛋白质相互作用的高分辨率结构的技术。
该方法涉及到将蛋白质复合物结晶成晶体，然后通过测量和分析这些晶体所产生的X射线散射模式来确定蛋白质的结构及相互作用。
检测蛋白之间相互作用的方法
检测蛋白之间相互作用的方法蛋白质之间的相互作用是细胞内许多生物过程的基础。
因此，了解和研究蛋白质之间的相互作用对于理解细胞功能和疾病发展非常重要。
目前已经发展了许多方法来检测蛋白质之间的相互作用，本文将介绍其中一些重要的方法。
一、免疫共沉淀（Immunoprecipitation，IP）免疫共沉淀是一种经典的方法，用于检测蛋白质之间的相互作用。
它利用抗体的特异性与目标蛋白结合，然后通过沉淀的方法将目标蛋白及其结合的蛋白一起分离出来。
这种方法可以用于检测稳定和瞬时的蛋白相互作用，并可以在原位和体外条件下进行。
二、酵母双杂交（Yeast Two Hybrid，Y2H）酵母双杂交是一种常用的方法，用于检测蛋白质之间的相互作用。
这种方法利用酵母细胞内的转录活性报告基因，将目标蛋白与一个转录激活因子和一个报告基因组合起来。
如果目标蛋白与转录激活因子相互作用，则该报告基因将被激活，并通过对报告基因的表达进行检测。
三、荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）荧光共振能量转移是一种基于能量传递的方法，用于检测蛋白质之间的相互作用。
这种方法基于两个蛋白质上的荧光标记物之间的能量传递效应。
当两个蛋白质相互作用时，一个荧光标记被激活并传递能量给另一个荧光标记，从而观察到荧光变化。
四、质谱法（Mass Spectrometry，MS）质谱法是一种高通量的方法，用于检测蛋白质之间的相互作用。
通过将目标蛋白和其结合的蛋白分离后，使用质谱仪对其进行分析和鉴定。
质谱法可以识别和定量蛋白质相互作用的数量和强度。
五、表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）表面等离子共振是一种基于光学原理的方法，用于检测蛋白质之间的相互作用。
这种方法基于蛋白质结合时的光学信号变化。
通过将一个蛋白质固定在表面上，并通过流通目标蛋白质，可以监测蛋白质结合的实时动态过程。
蛋白质晶体学中的结晶和解析
蛋白质晶体学中的结晶和解析蛋白质是生命中不可或缺的一种生物大分子。
它们具有复杂的三维结构，因此对于生命活动中的许多过程都起到了至关重要的作用。
因此，了解蛋白质的结构和功能对于研究生命机理和开发新药物都是至关重要的。
而蛋白质晶体学就是在这一领域中发挥着不可替代的作用。
蛋白质晶体学是一种通过将蛋白质分子进行结晶，然后通过X射线衍射对其原子结构进行解析的技术。
这一技术的核心是蛋白质分子结晶。
而蛋白质结晶的过程是非常复杂的，需要非常精密的操作和处理技巧。
蛋白质晶体学中的结晶蛋白质分子的结晶是由多个分子组成的晶体。
这一过程需要多种因素的相互作用和影响。
其中最重要的因素是结晶缓冲液和结晶试剂。
这两个因素都具有很大的难度和操作上的限制。
结晶缓冲液是一种通过调节pH值、离子强度和缓冲剂等因素，使得蛋白质分子在溶液中达到充分稀释的化学环境。
这种化学环境可以促进蛋白质分子间的相互作用、吸引和排斥，从而达到结晶的效果。
但是，要确定最优的缓冲液配方并不容易。
需要对每一个蛋白质都进行独立的缓冲液筛选实验，才能找到最适合其结晶的缓冲液配方。
另一个需要注意的因素是结晶试剂。
结晶试剂是一种可以通过与蛋白质分子相互作用从而向其提供晶体生长的必要因素的物质。
试剂可以是石蜡烃、聚乙二醇、磷酸盐等各种物质。
重要的是要确定最适合蛋白质结晶的试剂配方。
这也是一项至关重要的工作。
蛋白质晶体的解析蛋白质晶体的解析是通过使用X射线分析技术来确定其原子结构。
X射线是一种高能量的电磁波辐射。
当X射线遇到蛋白质晶体时，它们会在晶体中发生散射，从而产生一个广泛的、经过衍射后的X射线图案。
这个X射线图案被称为衍射峰。
根据这些衍射峰的位置和强度，可以确定蛋白质分子的原子结构。
这个过程需要先将蛋白质晶体进行完全地冷冻，并在低温环境下进行扫描。
然后，可以通过专门的计算机程序进行数据处理和计算。
这一过程需要创新和计算机技术、数理化学等多种科学领域的交叉。
蛋白质晶体学的应用蛋白质晶体学已经广泛应用于许多领域。
蛋白质结晶技术
蛋白质结晶技术是一种将蛋白质分子以晶体形式进行研究和分析的技术，在现代生物医学领域具有重要的应用价值。
蛋白质结晶是蛋白质生物学、药物设计和合成、小分子结晶学以及材料科学的交叉学科研究。
一、的意义蛋白质是生命体内最重要的有机分子之一，它们参与了包括酶促反应、免疫防御、传递信息、细胞结构和运动在内的众多生物活动过程。
但直接观察和研究蛋白质分子的结构和性质却是困难的。
因为单个蛋白质分子太小，无法用光学显微镜等传统手段进行观察，而且蛋白质分子的性质又是非常复杂的，需要对其进行进一步的分析。
的主要作用就是将单个蛋白质分子以晶体的形式进行研究和分析。
晶体结构可以让我们很清晰地看到蛋白质分子的三维空间结构，同时还能帮助我们了解蛋白质分子的动力学行为、生物活性以及在疾病中的作用机制等。
二、的基本原理蛋白质分子的结晶是一个复杂的过程，主要包括晶体生长前期的核心形成和后期的晶格完善。
根据这一基本原理，我们可以通过控制蛋白质溶液的物理、化学和结晶条件等方法来促进晶体的形成和生长。
在进行蛋白质结晶实验之前，我们需要先准备好目标蛋白质的样品。
通常情况下，目标蛋白质的纯度需要达到一定标准，才能确保实验的可重复性和准确性。
同时，在样品的制备过程中，需要引入一些辅助试剂（例如缓冲液、离子强度调节剂、沉淀剂等），以控制蛋白质的溶解度和晶体生长速度等参数。
一般而言，蛋白质结晶实验分为三个步骤：筛选结晶条件、晶体识别和晶体优化。
其中，筛选结晶条件是整个实验中最为困难和重要的步骤，它需要在满足一定条件下找到最适合目标蛋白质结晶的物理、化学参数。
晶体识别和晶体优化步骤分别用于确定目标蛋白质的晶体结构和提高晶体的质量和稳定性。
三、的发展历史是一个相对较新的生物学技术，起源于20世纪40年代。
当时，科学家们发现，用X射线穿过蛋白质晶体，可以在屏幕上观察到一组或多组色斑，这些色斑是由于X射线被晶体原子反弹或贯穿而导致的。
这一现象为人们提供了一种全新的方法来研究蛋白质分子的结构和性质。
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-precipitate protein from solution in organized fashion. -by increasing protein concentration > So (solubility)
Methods
-vapor diffusion
2ul protein + 2ul well solution
Crystal and Lattice
Crystal 3-D solid composed of an arrangement of atoms, molecules and ions that are regularly repeated throughout the volume of the solid.
- relationships of identical objects in 3-D space (operations, elements) e.g. rotations: 2, 3, 4, 6 fold axes mirror: m screw axis: 21, 31, 32, 41, 42, 43, 61, 62, etc - a set of symmetry operations existing in a certain crystal ~230 space groups in total - 65 space groups for protein crystal
General Steps
Expression Purification Crystallization
Structural analysis X-ray diffraction
Major Steps in Crystallography
• • • • • Grow crystals Measure the intensities of the diffraction pattern Compute an electron density map Interpret the electron density map and construct model Refine molecular model to fit experimental observations
Solutions:
-Skip the nucleation stage -Separate the nucleation and crystal growth stages -increase size of crystals -reduce showers of crystals -improve crystal quality
[protein]
2Cp
ed t ra u at s er p Su
Precipitation Nucleation
Cp
Metastable
Undersaturated
2Co Co
solubility
[ppt]
Purpose: to find the conditions that nucleation and mtastable regions exist in the phase diagram and hit the right concentrations.
Space group and International table
• Symmetry contents -International tables for crystallography (Vol. I) • Asymmetric unit (AU) -multiplicity (Z) e.g. P21212, four AUs, so Vau = 1/Z x V unit cell
lattice for translational repeats in 3-D space. - a translational symmetry - cell parameters: a, b, c, α, β, γ, in right-handed axis systems
• Symmetry and Space group
Protein Crystallography
Crystallography -technique reveals the three dimensional structures of molecules by X-ray diffraction. Why X-ray -λ = 1-2 Å, comparable to the C-C bond length of ~1.5 Å -Interaction of X-ray with matter is through electrons which are around nulei, so electron distribution tells us where atomic nuclei (i.e. atoms) are. Why Crystal - signal from one molecule is too weak - diffraction of hundreds of thousands molecules in a crystals can be detected
Unit cell Crystal lattice: 3-D array of unit cells
periodical translational repeats of basic pattern “unit cell”
Crystal Lattice and Unit Cell
Three onal lattice
P- Primitive I- body centered C- C centered F- Face centered
Symmetry and Unit Cell
• Unit cell: A minimum repeating unit (parallelepiped) in a crystal
Space group P21212
Space group P21212
X-ray crystallography
Diffracted X-ray X-ray Beam Crystal
Detector Plate
λ=1.54 Å
protein
Image of molecules in crystal
Hampton site: /support/
Protein Crystallization
• Screening/optimization
crystal growth depends on: type of precipitants, [ppt], pH, T, salts, organic solvents, etc.
Protein Crystallization
• Principles of protein solubility
ed t ra u at s er p Su
[protein]
Precipitation Nucleation
Undersaturated [PPt]
Metastable
solubility
c
β α γ a, b, c, α, β, γ
b
a
Crystallography 101 /Xray/101index.html
14 Bravis Lattices
4 lattice types P, I, C, F 7 crystal systems
Protein Crystallography
Lecture 1 Introduction Symmetry and diffraction principles protein crystallization Structure factor and phase problems Experimental phasing methods Lecture 2 Molecular replacement Direct method Solvent modification Refinement and evaluation Cross validation
Protein crystallography
Lecture 3 Applications (case study) Use of Coot (practice in Ling lab) Lecture 4 Short presentations by students crystallization (seeding, new methods) Introduction of heavy atoms -Halides, Sel-Met, I-phe, Xe chamber etc. MR method MAD, SAD, MIR etc Rfree/v alidation Applications (structure case study)
Major Steps in Crystallography
• • • • • Grow crystals Measure the intensities of the diffraction pattern Compute an electron density map Interpret the electron density map and construct model Refine molecular model to fit experimental observations
Lattice and Planes
Assembly of a set of planes
Bragg’s Law
X-rays are diffracted by lattice planes of atoms when the path difference equal to integral (n) folds of the wavelength.