入噬菌体及质粒载体
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体一、单链噬菌体的一般生物学1．单链噬菌体的优越性2．M13噬菌体的生物学特性二、M13克隆体系1．M13克隆体系2．M13克隆体系-半乳糖苷酶的显色反应原理3．M13载体系列的发展4．M13载体系列的优点三、噬菌体展示载体1．噬菌体展示载体的构建原理2．噬菌体展示载体3．噬菌体表面展示文库4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例四、噬菌粒载体1．M13噬菌体载体克隆的若干难点2．噬菌粒3．若干常用的噬菌粒载体4．pBluescript噬菌粒载体5．pUC118和pUC119噬菌粒载体第八讲单链噬菌体载体一、单链噬菌体一般生物学大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd 噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。
1．单链DNA phage的优越性A．具有双链的复制型DNA(RF DNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RF DNA：Replication Form DNA。
B．RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。
C．不受包装的限制。
因为单链DNA phage的大小是受其DNA 多寡制约的。
D．可容易地测出外源DNA的插入取向。
E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途(作为模板)：*1用作双脱氧链终止法进行DNA测序*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针*3利用寡核苷酸进行定点突变2．M13 phage的生物学特性A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如：①基因组组织形式相同；②病毒颗粒大小、形状相近；③DNA同源性高达98%以上。
B．在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。
噬菌体、质粒dna复制方式
噬菌体、质粒dna复制方式
噬菌体是一种病毒，它感染细菌并利用细菌的机制进行自我复制。
质粒则是细菌染色体外的、能自主复制和稳定遗传的双链环状DNA分子。
下面是噬菌体和质粒DNA的复制方式。
噬菌体的复制方式：
1. 吸附：噬菌体通过尾部特异性地吸附到宿主细胞的表面。
2. 侵入：噬菌体的尾部通过酶的作用切开宿主细胞的外膜，注入内部的DNA。
3. 复制：噬菌体的DNA进入宿主细胞的核，利用宿主细胞的机制进行DNA复制。
首先，噬菌体的DNA作为模板，利用宿主细胞的酶和能量进行复制，产生新的噬菌体DNA。
然后，这些新的DNA与蛋白质外壳组装，形成新的噬菌体颗粒。
4. 成熟与释放：最后，成熟的噬菌体颗粒通过宿主细胞的裂解被释放出来，进行下一次的感染。
质粒DNA的复制方式：
1. 自我复制：质粒DNA可以在宿主细胞内进行自我复制。
质粒DNA的复制依赖于宿主细胞的机制，包括使用宿主细胞的DNA聚合酶进行复制，以及利用宿主细胞的能量进行ATP合成等。
2. 分配：在宿主细胞分裂时，质粒DNA会被平均分配给两个子细胞。
质粒DNA 的复制和分配是受调控的，以确保其在宿主细胞内的稳定遗传。
无论是噬菌体还是质粒，它们在复制过程中都受到各种因素的调控，以确保其稳定性和适应性。
这些过程涉及许多生物化学反应和结构变化，为深入理解这些过程需要研究更多的科学细节。
基因工程中常用载体及其主要特点
基因工程中常用载体及其主要特点基因工程这一话题，听起来就像科幻小说里的情节，其实离我们并不遥远。
今天咱们就聊聊基因工程中的一些常用载体，简单明了，让你听得懂，明白得了！准备好了吗？那就跟我一起走进这奇妙的基因世界吧！1. 什么是载体？首先，得先搞清楚，什么是载体。
简单来说，载体就是那些能“背负”外来基因的“快递小哥”。
它们把我们想要的基因装上，然后送到目标细胞里。
这就像是你点了一份外卖，外卖小哥把美味的食物送到你家。
没有它们，我们的基因工程可就没法开展了。
想象一下，如果没有这些小哥，基因可怎么进得了细胞的大门呢？1.1 质粒载体说到载体，质粒可算是老前辈了。
质粒就像是细菌的“USB闪存”，它能自我复制，携带外来基因，简直就是基因工程的明星。
质粒的特点是操作简单、成本低，而且它们在细菌中可以很稳定地传递下去。
想想看，若是你把一张重要的文件放在闪存里，不仅可以在一台电脑上使用，还能借给朋友，这种“共享经济”在基因界也在不断上演。
质粒载体就是这样的存在，方便又实用，真是个好帮手！1.2 噬菌体载体再说说噬菌体载体。
这个名字听起来就有点威风，实际上它就是一种能感染细菌的病毒。
噬菌体载体像个特种部队，能精准地将目标基因送到细菌里。
它的特点是能在细菌中以极高的效率进行复制。
想象一下，像忍者一样悄无声息地完成任务，真是酷毙了！当然，它的使用相对复杂，需要一定的技术支持，不过一旦掌握，可是非常厉害的工具。
2. 常见的真核载体讲完细菌的载体，咱们再来看真核细胞的载体，这可得好好聊聊了。
2.1 真核表达载体真核表达载体，是为了在真核细胞中表达外来基因而设计的。
这就像是在高档餐厅里，得有专业的厨师才能把菜做好。
真核表达载体通常含有强大的启动子、终止子和选择标记。
它们能够确保外来基因在真核细胞中顺利表达。
举个例子，就像你去商场买了新衣服，得先试穿才知道合不合适，对吧？这载体也得确保外来基因在细胞中能够“穿”得合适，才能发挥作用。
大肠杆菌的λ-噬菌体
•功能区：裂解相关S和R，复制相关O和P
3、感染周期（溶菌循环）
•λDNA复制早期：一个ori ，双向复制 •晚期：滚环复制--多个λDNA分子形成线状多联体
尾巴上的微丝可以把噬菌 体的DNA注入细菌内。
噬菌体或病毒的DNA能被开发
成为基因工程的有用载体，因为：
1.高效率的感染性能使外源基
因高效导入受体细胞；
2.自主复制繁殖性能使外源基
因在受体细胞中高效扩增。
大肠杆菌的λ-噬菌体
（一） λ-噬菌体的生物学特性 1、由外壳包装蛋白和λ-DNA组成 2、 λ-DNA的物理图谱
必须携带标记基因
经改造后只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点,长度 为37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，允许插入 片段最大为14kb.
取代型载体（substitution vector）
具有成对的克隆位点,空载的载体DNA只26kb，不能被包 装，无法进入受体细胞中去,不需要标记基因.
应用：
（1）功能相近的基因在基因组中聚集在一起 目前已经被确定的基因至少61种，一半为必需 基因
（2）线状双链DNA，两端各有一个12bp的互补单链 （粘性末端，cohesive-end site），称λcos site ，粘性末端粘连接变成环状DNA。
λco基因大致分为3个区：
cI基因：编码阻遏蛋白，是感染了λ噬菌体的寄主细胞进 入溶源化的必要条件。cI基因失活或缺失的λ噬菌体无法 使寄主细胞发生溶源化效应。
DNA重组技术一般需要噬菌体处于溶源状态。
λ噬菌体DNA的整合与删除：
噬菌体转导的操作方法
噬菌体转导的操作方法噬菌体是一种可以侵染并感染细菌的寄生病毒。
也可以通过一定的操作方法进行噬菌体的转导，即将噬菌体导入到目标细菌中。
噬菌体转导的方法有多种，包括传统的混合转染和现代的质粒张量传递等。
下面将详细介绍这些方法以及其他与噬菌体转导相关的操作步骤。
一、传统的混合转染方法1. 实验室条件准备：首先需要在无菌环境下操作，在实验室环境中设置无菌台，准备好所需的培养基、细菌菌种、噬菌体溶液和培养皿等。
2. 培养目标细菌：首先，将目标细菌分别接种到含有适合其生长的培养基中，培养至合适的生长状态。
3. 噬菌体溶液制备：将待转导的噬菌体培养物取出，可以进行多次离心洗涤，以去除一些不必要的物质。
然后将噬菌体溶液稀释合适的倍数，通常以MOI （Multiplicity of Infection）为计量单位，即用噬菌体粒子数和目标细胞数的比值来衡量噬菌体转染的效果。
4. 转染实验操作步骤：将噬菌体溶液与目标细菌培养物混合均匀，使噬菌体感染目标细菌。
通常，将细菌培养物与噬菌体溶液在37下静置一段时间（通常为10-30分钟）或在摇床上轻微摇动，以促进噬菌体与细菌结合。
然后，将混合物转移到预先加热的琼脂糖平板上，并均匀摇晃，使得细菌和噬菌体充分接触。
然后将含有混合物的琼脂糖平板培养在适当的温度下，通常在37下培养一段时间，让噬菌体感染目标细菌并形成溶菌斑。
5. 结果分析：观察琼脂糖平板上是否出现了溶菌斑，即噬菌体感染目标细菌后引起的溶解区域。
溶菌斑的大小和数量可以用来评估噬菌体的转导效果和细菌对噬菌体的感受性。
二、质粒张量传递方法传统的混合转染方法虽然简单易行，但受到不少限制，如只能传递噬菌体基因组，不能有效转导大分子质粒等。
而质粒张量传递方法则可以绕过这些限制，使得噬菌体转导的应用领域更加广泛。
1. 质粒构建：首先，需要构建带有目的基因的质粒，该质粒通常包括适当的启动子、转录起始序列、编码序列和终止序列。
2. 噬菌体构建：然后，将构建好的质粒导入到适当的噬菌体质粒载体中。
大肠杆菌、质粒和噬菌体
大肠杆菌具有多种抗原构造，包括菌 体抗原（O抗原）、鞭毛抗原（H抗 原）和表面抗原（K抗原）。
大肠杆菌在生物工程中的应用
01
02
03
基因克隆和表达
大肠杆菌是基因克隆和表 达的常用宿主菌，可以通 过质粒载体将外源基因导 入大肠杆菌中进行表达。
蛋白质生产
大肠杆菌可以用于生产各 种蛋白质药物，如胰岛素、 生长激素等。
生物防治
噬菌体可以作为生物防治剂，用于防治某些细菌感染，如食品防腐和植物病害 控制等。
噬菌体的复制和感染机制
DNA复制
噬菌体进入宿主细胞后，利用宿主细胞代谢 系统进行DNA复制，产生多个子代DNA。
蛋白质合成
噬菌体DNA控制宿主细胞代谢系统合成噬菌体蛋白 质，包括头部和尾部蛋白质。
组装与释放
子代噬菌体在宿主细胞内组装完成，通过宿 主细胞裂解或出芽方式释放到外界环境中。
生物催化剂
大肠杆菌可以用于生产各 种生物催化剂，如脂肪酶、 淀粉酶等。
大肠杆菌的致病性
肠道感染
大肠杆菌是肠道感染的主要病原体之一，可引起腹泻、 呕吐等症状。
败血症
大肠杆菌可引起败血症，导致全身感染和多器官功能 衰竭。
尿道感染
大肠杆菌也是尿道感染的主要病原体之一，可引起尿 频、尿急、尿痛等症状。
02 质粒
基因敲除
利用质粒介导的同源重组技术，实 现基因敲除或定点突变。
03
02
表达载体
通过将目的基因插入到质粒上，实 现目的基因的高效表达。
基因治疗
质粒作为基因治疗载体，用于将治 疗基因导入病变细胞。
04
质粒的复制和传播机制
复制机制
质粒通过独特的复制机制， 在宿主细胞内自主复制， 并遗传给后代细胞。
λ噬菌体包装质粒原理
λ噬菌体包装质粒原理
噬菌体包装质粒是通过利用噬菌体感染细菌并将质粒DNA包装入噬菌体颗粒中来制备。
其原理包括以下几个步骤：
1. 噬菌体感染：选择一种合适的寄主细菌，使其被特定的噬菌体感染，噬菌体一般是属于细菌的病毒，在细菌被噬菌体感染后，噬菌体将控制细菌的合成机制并复制自身。
2. 质粒DNA插入：将感兴趣的质粒DNA插入到被感染的细菌中，这一步骤一般通过细菌转化技术实现，使质粒DNA进入细菌细胞质。
3. 质粒DNA复制和包装：被插入的质粒DNA在被感染的细菌中进行复制，同时噬菌体的复制机制也被激活。
在病毒复制的过程中，质粒DNA被包装入噬菌体颗粒中，形成带有质粒DNA的新的噬菌体。
4. 细菌溶解和收集：当感染的细菌数量达到一定程度时，噬菌体会释放，溶解宿主细菌。
此时，溶解的细菌中含有大量包装有质粒DNA的噬菌体颗粒，通过离心等方法，可以收集到纯净的噬菌体和质粒DNA。
通过以上步骤，可以利用噬菌体包装质粒原理，制备纯净的质粒DNA。
这种方法在基因工程实验中被广泛应用，包括基因克隆、重组蛋白表达、基因组库构建等。
入噬菌体及质粒载体
理想的质粒载体
(1)分子量小、多拷贝、松弛控制型; (2)具有多种常用的限制性内切酶的单切点; (3)能插入较大的外源DNA片段; (4)具有两个以上的遗传标记物，便于鉴定和 筛选。 (5)对宿主细胞无害。常用的质粒载体大小一 般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、 PGEM系列和pBluescript(简称pBS)等。
Β-半乳糖苷酶失活的插入型载体
• 载体基因组中含有一个大肠杆菌的 lac5区段，编码着Β-半乳糖苷酶基因 lacZ。由这种载体感染到的大肠杆菌 lac-指示菌，涂布在添加IPTG和Xgal 的培养基上就会形成蓝色的噬菌斑。
替换型载体
• λ噬菌体的中央部分有一个可以被外源插入 的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。
质粒载体的优缺点
• 质粒载体主要用于DNA分子的亚克隆，表达外源 蛋白，DNA序列的测定和基因的体外重新构建等。 • 1.与外源DNA重组操作简便； • 2.外源DNA在质粒载体中相对较稳定， • 3.质粒DNA的制备和纯化方便，快速简单，所以 得到广泛应用。 • 缺点： • 1.它容纳外源DNA片段有限，通常最多为15kb左 右，因为当质粒大于15kb时，转化效率明显下降。
质粒载体
质粒特点
• ①染色质外的双链共价闭合环形DNA（covalently closed
circuar DNA,cccDNA）可自然形成超螺旋结构，不同质 粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯
化，＞15kb的大质粒则不易提取。
• ②能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomous
注 意
• λ噬菌体感染了寄主细胞之后，究竟是发生溶
菌反应还是溶源反应，这是由cI基因和cro基
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理想的质粒载体
(1)分子量小、多拷贝、松弛控制型; (2)具有多种常用的限制性内切酶的单切点; (3)能插入较大的外源DNA片段; (4)具有两个以上的遗传标记物，便于鉴定和 筛选。 (5)对宿主细胞无害。常用的质粒载体大小一 般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、 PGEM系列和pBluescript(简称pBS)等。
• 右侧区：位于Ｎ基因的右侧，包括全部主要的调控 成分，噬菌体复制基因（Ｏ和Ｐ）以及溶菌基因 （Ｓ和Ｒ）
注意
• λ噬菌体感染了寄主细胞之后，究竟是发生溶 菌反应还是溶源反应，这是由cI基因和cro基 因编码的蛋白质，同λ噬菌体的两个操纵基因 （OL, OR)之间的相互作用来决定的。
• 如果这两个操纵基因都已摆脱了阻遏状态，那 么噬菌体便可以进入溶菌周期，否则进行溶源 周期。
酶形成融合蛋白质的克隆载体。
质粒载体
质粒特点
• ①染色质外的双链共价闭合环形DNA（covalently closed
circuar DNA,cccDNA）可自然形成超螺旋结构，不同质 粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯
化，＞15kb的大质粒则不易提取。
• ②能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomous
构建λ噬菌体载体的基本原理
• 野生型的λ噬菌体DNA，对大多数基因克 隆中常用的核酸内切酶都有过多的限制位 点，通过消除一些多余的限制位点和切除 非必要的区段，才可能将它改造成适用的 克隆载体。
λ噬菌体载体可分为：
插入型载体 替换型载体
插入型载体
• 免疫功能失活的插入型载体：载体基因组 上存在一段免疫区，其中带有一两种核酸 内切限制酶的单切割位点。当外源DNA插 入到这种位点上时，就会使载体所具有的 合成性阻遏物的功能遭受到破坏，而不能 进入溶源周期。因此带有外源DNA插入的 λ重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没 有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成浑 浊的噬菌斑。
Β-半乳糖苷酶失活的插入型载体
• 载体基因组中含有一个大肠杆菌的 lac5区段，编码着Β-半乳糖苷酶基因 lacZ。由这种载体感染到的大肠杆菌 lac-指示菌，涂布在添加IPTG和Xgal 的培养基上就会形成蓝色的噬菌斑。
替换型载体
• λ噬菌体的中央部分有一个可以被外源插入 的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。
从而能产生出大量的子代噬菌体颗粒。 • 使感染的细菌细胞释放出子代噬菌体颗粒
λ噬菌体载体
1 λ噬菌体的分子生物学概述 2 λ噬菌体载体
1 λ噬菌体的分子生物学概述
• λ噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分 子，长48 502bp，两端各有12个碱基的5` 凸出黏性末端是互补的。进入细胞的λDNA 通过两端的黏性末端环化。可用来构建柯 斯质粒。
λ- 噬菌体及质粒载体
——郭苋 2014212346
噬菌体的一般生物学特性
• 依赖于寄主细胞存活。脱离了寄主细胞后既不能 生长也不能复制。
• 基本功能： • 保护自己的核酸分子（DNA或RNA）免遭环境化
学物质的破坏 • 将其核酸分子注入到被感染的细菌细胞 • 经被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，
注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA 大小只能： 38kb ~ 52kb。 体外包装：λ噬菌载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白
λ噬菌体载体的良
• 围绕三个目的进行： • 设计可对重组体分子作正选择的克隆载体， • 构建可方便的通过转录作用制备外源DNA
插入序列之RNA探针的克隆载体 • 发展可使插入的真核cDNA与β-半乳糖苷
• λ噬菌体上有些基因可被取代而不影响其 生活周期。
λ噬菌体基因组编码基因区域
• 左侧区：自基因A到基因J，包括参与噬菌体头部蛋 白质和尾部蛋白质合成所需要的全部基因。
• 中间区：介于基因J与基因N之间，这个区又称为非 必要区。本区基因与保持噬菌斑形成能力无关，但 包括了一些与重组有关的基因（redA 和redB）。以 及整合到大肠杆菌染色体中去的int基因。和把原噬 菌体从寄主染色体上删除出去的xis基因。
质粒载体的优缺点
• 质粒载体主要用于DNA分子的亚克隆，表达外源 蛋白，DNA序列的测定和基因的体外重新构建等。
• 1.与外源DNA重组操作简便； • 2.外源DNA在质粒载体中相对较稳定， • 3.质粒DNA的制备和纯化方便，快速简单，所以
得到广泛应用。
• 缺点： • 1.它容纳外源DNA片段有限，通常最多为15kb左
replicon）。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂 而传给后代。
• ③质粒对宿主生存并不是必需的，某些质粒携带的基因
功能有利于宿主细胞的特定条件下生存。
质粒载体的种类
• 在基因工程中，常用人工构建的质粒作为 载体。人工构建的质粒可以集多种有用的 特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗 生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有 pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素 基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含 有27种限制性内切酶的单一识别位点。
• 中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向 重复序列。因此当外源DNA插入时，一对 克隆位点之间的DNA片段便会被置换掉， 从而有效的提高了克隆外源DNA片段的能 力。
λ噬菌体载体的特点
(1)筛选简便； (2)可克隆的片段大，最大可达23 kb，
而质粒最大仅10 kb左右； (3)转化效率高。λ噬菌体载体是主要用于cDNA构建， 也经常用于外源目的基因的克隆。