分子标记辅助育种.
分子标记辅助育种技术
分子标记辅助育种技术分子标记辅助育种技术第一节分子标记的类型和作用原理遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。
在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变异。
在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异。
在遗传学研究中，遗传标记主要应用于连锁分析、基因定位、遗传作图及基因转移等。
在作物育种中，通常将与育种目标性状紧密连锁的遗传标记用来对目标性状进行追踪选择。
在现代分子育种研究中，遗传标记主要用来进行基因定位和辅助选择。
1、形态标记形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状。
如、株高、穗型、粒色等的相对差异。
形态标记数量少，可鉴别标记基因有限，难以建立饱和的遗传图谱。
有些形态标记受环境的影响，使之在育种的应用中受到限制。
2、细胞学标记细胞学标记是指能够明确显示遗传多态性的细胞学特征。
如染色体的结构特征和数量特征。
核型：染色体的长度、着丝粒位置、随体有无。
可以反映染色体的缺失、重复、倒位、易位。
染色体结构特征带型：染色体经特殊染色显带后，带的颜色深浅、宽窄和位置顺序,可以反映染色体上常染色质和异染色质的分布差异。
染色体数量特征—是指细胞中染色体数目的多少。
染色体数量上的遗传多态性包括整倍体和非整倍体变异。
细胞学标记优点：克服了形态标记易受环境影响的缺点。
缺点：（1）培养这种标记材料需花费大量的人力物力；（2）有些物种对对染色体结构和数目变异的耐受性差，难以获得相应的标记材料；（3）这种标记常常伴有对生物有害的表型效应；（4）观察鉴定比较困难。
3、蛋白质标记用作遗传标记的蛋白质分为酶蛋白质和非酶蛋白质两种。
非酶蛋白质：用种子储藏蛋白质经一维或二维聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据显示的蛋白质谱带或点，确定其分子结构和组成的差异。
酶蛋白质：利用非变性淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳及特异性染色检测，根据电泳谱带的不同来显示酶蛋白在遗传上的多态性。
蛋白质标记的不足之处：（1）每一种同工酶标记都需特殊的显色方法和技术；（2）某些酶的活性具有发育和组织特异性；（3）标记的数量有限。
分子标记辅助选择育种特点和方法
• 主要包括贮藏蛋白、同工酶和等位酶等。种子中的 贮藏蛋白主要包括白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷 蛋白四种。不同植物种子中的贮藏蛋白含量不同。
• 生化标记的使用首次突破了把整株样品作为研究材 料进行分析的方式，并可以直接反映基因产物的差 异，受环境的影响较小。但标记数量远远不能满足 实际的需要。
2. 细胞学标记(cytological markers)：
• 是指细胞内染色体的变化，包括染色体数目的变化 (如单体、缺体、三体、四体 )或染色体结构的变异 (如缺失、易位、倒位、重等 )。可通过染色体核型 （染色体数目、大小、随体有无、着丝粒位置等）和 带型（C、N、G等）分析来测定基因所在的染色体及 相对位置，或通过染色体置换等进行基因的定位。
棉花多标记基因材料
品系 基因符号
标记性状
品系 基因符号
标记性状
T586
R1
R2
Y1
T1
P1
N1
Lc1
L20
红株 花瓣斑点
黄花瓣 密生茸毛
黄花粉 光籽
棕色纤维 鸡脚叶
T582
cl1
v1
cu
fg
gl1
丛生铃 芽黄 杯状叶 窄卷苞叶 无腺体
第18章 分子标记辅助育种
普通玉米与高直链淀粉玉米籽粒形态
高
直
普
形态学标记（morphological marker） 细胞学标记(cytological marker) 生化标记(biochemical marker) 分子标记(molecular marker)：DNA分子遗传
标记，或DNA标记。
第18章 分子标记辅助育种
作物育种学总论第十四章分子标记辅助选择育种
PCR-based markers
PCR: polymerase chain reaction（多聚酶链式反应）
amplification of tracts of DNA defined by border sequences that hybridize to selected DNA polymerase primers
How to use a genetic marker for marker-assisted selection
Weaver Carrier Sire
M1
M2
W
+
M1
M3 M2
M3
W
++
+
W=Weaver +=Normal
目标基因的标记筛选（gene tagging）是 进行分子标记辅助选择（MAS）育种的基 础。用于MAS育种的分子标记须具备三个 条件：
生化标记
主要包括同工酶和等位酶标记。同工酶是：指结构 不同、功能相似的酶，也即具有同一底物专一性的 不同分子形式的酶。属于一个以上基因座位编码的 酶的不同形式；而等位酶是指由一个基因座位的不 同等位基因编码的酶的不同分子形式。分析方法是 从植物组织的蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染 色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。
供体
M
R
受体
m
r
M
m
R
r
RR Rr rr
(1-r)2 2r(1-r) r2
目标基因与DNA标记间的遗传距离位p
亲本中DNA标记的带型
M—抗性标记 R—抗性基因 m—感病标记 r—感病基因
F1杂种中DNA标记的带型
在F2分离群体中分子标记类型 即MM,Mm,mm
分子标记辅助的遗传育种实践
分子标记辅助的遗传育种实践分子标记辅助的遗传育种实践遗传育种是农作物改良中的重要手段，为了提高育种效率和准确性，科学家们通过分子标记技术的应用，开展了分子标记辅助的遗传育种实践。
这项技术的出现，极大地促进了农作物育种的进程。
分子标记是一种通过DNA序列检测和分析的方法，可以确定特定基因位点的遗传信息。
借助这项技术，育种者可以更加准确地筛选和选择具有优良基因的个体，从而加速了育种过程中的杂交和选择。
与传统育种相比，分子标记辅助的育种具有更高的效率和准确性。
在实践中，科学家们首先通过分析物种的基因组，发现了与目标性状相关的分子标记。
这些标记可以是单核苷酸多态性（SNP）或简单重复序列（SSR）等。
然后，他们利用这些标记开展杂交和选择。
通过对大量杂交个体进行分子标记的检测，科学家可以快速筛选出携带目标基因的个体，并将其作为亲本进行后续的杂交。
这种方式避免了传统育种中的大量试验和大规模筛选的工作，提高了育种效率。
此外，在分子标记辅助的育种中，科学家还可以利用分子标记数据进行定位和图谱构建。
通过分析标记位点的位置和分布，可以预测携带目标基因的染色体区域，从而缩小育种目标的范围。
同时，构建遗传图谱可以帮助科学家更好地理解物种的遗传结构和基因座位间的连锁关系，为育种的进一步研究提供了基础。
分子标记辅助的遗传育种实践已经在多个农作物中得到了成功应用。
例如，在水稻育种中，通过分子标记技术可以筛选出高产、抗病、抗虫等多种优良性状的基因，从而加速了新品种的培育。
此外，分子标记还可以用于小麦、玉米、大豆等农作物的育种中。
总之，分子标记辅助的遗传育种实践为农作物改良提供了一种高效、准确的方法。
通过利用分子标记技术，育种者可以更加精确地选择优良基因，加速杂交和选择的过程，并为育种研究提供基础。
随着技术的不断发展，分子标记辅助的遗传育种将在农业生产中发挥愈加重要的作用。
第五章分子标记辅助育种
遗传标记主要有四种类型:
形态标记（morphological marker） 细胞标记（cytological markers） 生化标记（Biochemical marker）
–同工酶:酯酶和过氧化物酶 –贮藏蛋白
分子标记（molecular marker）
分子标记的优越性：
直接以DNA形式出现，生物体的各个组织、 各发育时期均可检测到，不受季节、环境 的限制，不存在表达与否的问题；
l 基于Southern杂交的分子标记 基于PCR技术的分子标记
一、 基于Southern杂交的分子标记
限制性片段长度多态性 （Restriction Fragment Length Polymorphism） 小卫星DNA（Minisatellite DNA）
1 RFLP标记
RFLP标记的原理 植物基因组DNA上的
PCR-based markers
1 RAPDs
Anonymous markers - but can be converted to SCARs
Dominant markers - homozygotes cannot be distinguished from heterozygotes
Fast, easy and cheap - commercial primer sets available
植物分子育种
分子标记辅助育种
DNA标记辅助选择育种是利用与重要经济 性状连锁的DNA标记或功能基因来改良动、 植物品种的现代分子育种技术；
基因工程育种
转基因育种则是通过向受体植物转移有重要 功能的基因或一组功能相关的基因来改良植 物性状的育种技术。
分子标记辅助育种
第一节 遗传标记发展
(完整版)分子标记辅助选择育种
分子标记辅助选择育种传统的育种主要依赖于植株的表现型选择(Phenotypieal selection) 。
环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率。
例如抗病性的鉴定就受发病的条件、植株生理状况、评价标准等影响；品质、产量等数量性状的选择、鉴定工作更困难。
一个优良品种的培育往往需花费7〜8年甚至十几年时间。
如何提高选择效率，是育种工作的关键。
育种家在长期的育种实践中不断探索运用遗传标记来提高育种的选择效率与育种预见性。
遗传标记包括形态学标记、细胞学标记、生化标记与分子标记。
棉花的芽黄、番茄的叶型、抗TMV的矮黄标记、水稻的紫色叶鞘等形态性状标记，在育种工作中曾得到一定的应用。
以非整倍体、缺失、倒位、易位等染色体数目、结构变异为基础的细胞学标记，在小麦等作物的基因定位、连锁图谱构建、染色体工程以及外缘基因鉴定中起到重要的作用，但许多作物难以获得这类标记。
生化标记主要是利用基因的表达产物如同工酶与贮藏蛋白，在一定程度上反映基因型差异。
它们在小麦、玉米等作物遗传育种中得到应用。
但是它们多态性低，且受植株发育阶段与环境条件及温度、电泳条件等影响，难以满足遗传育种工作需要。
以DNA多态性为基础的分子标记，目前已在作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性分析与品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用，尤其是分子标记辅助选择（molecular marker-as —sisted selection , MAS育种更受到人们的重视。
第一节分子标记的类型和作用原理一、分子标记的类型和特点按技术特性，分子标记可分为三大类。
第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction ，PCR反应)为基础的各种DNA指纹技术。
分子标记辅助育种技术
分子标记辅助育种技术分子标记辅助育种技术是在水稻、小麦、玉米、大豆、油菜等重要作物上，通过利用与目标性状紧密连锁的DNA分子标记对目标性状进行间接选择，以在早代就能够对目标基因的转移进行准确、稳定的选择，而且克服隐性基因再度利用时识别的困难，从而加速育种进程，提高育种效率，选育抗病、优质、高产的品种。
（一）发展回顾我国的农作物分子标记辅助育种的研究始于90年代初，在过去的近十年时间里，取得了重要的研究进展：1.构建了水稻等作物的染色体遗传图谱；2.构建了水稻染色体物理图谱；3.利用分子标记对我国作物种质资源遗传多样性进行了初步的研究；4.对一些重要的农艺性状进行了定位、作图与标记，相应的基因克隆已在进行。
在基因组计划开展以来的短短的几年时间内，主要农作物的遗传连锁图的绘制均已完成。
1996年我国用RFLP标记对水稻进行作图，构建了水稻12条染色体的完整连锁图。
此后，又构成了有612个标记的水稻遗传连锁图，较好地满足水稻遗传育种工作的需要。
除水稻之外，还绘制了谷子的RFLP连锁图。
构建了大豆分子标记遗传框架图、小麦野生近缘植物小伞山羊草的连锁图以及小麦的第1、第5、第6染色体部分同源群RFLP连锁图等。
1997年，利用广陆矮4号水稻品种构建的BAC文库，建立了631个长度不同的跨叠群。
用水稻遗传图谱上的RFLP标记及STS标记确定了631个跨叠群在水稻12条染色体上的位置，绘制出了水稻的染色体物理图。
该物理图长为352284Kb，覆盖了水稻基因组的92%。
我国近年来对作物的重要性状，如育性基因、抗性基因及产量性状基因的作图与标记方面开展了大量研究工作。
在育性方面，找到了与光敏核不育水稻的光敏不育基因位点连锁的RFLP标记。
定位了水稻不育系5460F的育性隐性单基因tms1，并找到与之紧密连锁（1.2cM）的RFLP标记。
定位水稻野败不育系恢复基因的两个主效基因Rfi3和Rfi4，初步确定了与其中Rfi3基因紧密连锁(2.7cM)的RFLP标记，并已转化为STS标记。
分子标记的发展及分子标记辅助育种
分子标记的发展及分子标记辅助育种分子标记辅助选择育种(Marker Assisted Selection (MAS)或Marker Assisted Breeding)是利用与目标基因紧密连锁的分子标记或功能标记），在杂交后代中准确地对不同个体的基因型进行鉴别，并据此进行辅助选择的育种技术。
通过分子标记检测，将基因型与表现型相结合，应用于育种各个过程的选择和鉴定，可以显著提高育种选择工作的准确性，提高育种研究的效率。
分子标记辅助育种示意图DNA分子标记相对同类技术来说具有很强的优越性：因为大部分标记为共显性，对隐性性状的选择十分有利；数量极多，应对极其丰富的基因组变异；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用标记分析；不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁等等。
随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术也有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴定、基因库构建、基因克隆等方面。
分子标记的类型分子标记按技术特性可分为三大类。
第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR反应)为基础的各种DNA指纹技术；第三类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入／缺失等。
分子标记是以DNA多态性为基础，因而具有以下优点：①表现稳定，多态性直接以DNA 形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响；②数量多，理论上遍及整个基因组；③多态性高，自然界存在许多等位变异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为大量重要性状基因紧密连锁的标记筛选创造了条件；④对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁；⑤部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯合体与杂合体；⑥成本不高，一般实验室均可进行。
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Simple Sequence Repeats － SSR
P1
5 repeats
P2
扩增 电泳
P2 P1
7 repeats
A
9 repeats
B
5 repeats
C
PCR C A B
13 repeats
ABC分别代表 不同的基因型
SSR多态性分析示意图
共显性标记 40
< SSR标记 > 优点： 高多态性； SSR位点在染色体上分布均匀；
所检测到的RAPD理论上可覆盖整个基因组
周期短，操作简单，灵敏度高，DNA用量少 重复性差， 扩增的片段一般小于2 kb，
不需要模板基因组DNA的任何信息.
RAPD
(Randomly Amplified Polymorphism DNA)
10mer
序列随机
商业购买 种类无限
引物
1
2
3
4
5
4.3 SSR 标记
PCR procedure
5’ amplicon 94℃ 3’
3’ 5’
56℃ Cycle 1 2分子 72℃
Cycle 2 4 分子
Cycle 3 8分子
（三）基于PCR和限制性酶切的分子标记
AFLP ( amplified fragment length polymorphism，PCR扩增限制性内切酶酶切片段长 度多态性 )标记；
多态 性 标记 数 Polymorphic fragments 7 4 5 4 8 5 5 7 10 7 6
5`-3`序列 Sequence TTC(CCA)5 GAG(CGA)5 GTT(CGA)5 GCC(CGA)5 AAG(CGA)5 ATT(CGA)5 ATC(CGA)5 TAG(CGA)5 TTT(CGA)5 TCC(CGA)5
5`-3`序列 Sequence GGG(ACA)5 GAT(ACA)5 GAC(ACA)5 GGG(CCA)5 GAT(CCA)5 GAC(CCA)5 AGG(CCA)5 AAT(CCA)5 AAC(CCA)5 TGG(CCA)5 TAT(CCA)5
扩增 条带数 Amplified fragments 7 12 9 6 8 10 8 8 12 9 6
39
Байду номын сангаас
4.5 ISSR标记 （Inter-simple sequence repeats）
Zietkiewicz提出，检测的是两个SSR之间的一段短DNA 序列上的多态性。 原理：利用真核生物基因组中广泛存在的SSR序列，设 计出各种能与SSR序列结合的PCR引物，对两个相距较近、 方向相反的SSR序列之间的DNA区段进行扩增。
多数显性
较高 1～10 低 10～25 低 不是 低 少
共显性
较高 1～10 低 25～50 低 不是 高 少
多数显性
高 20～200 高 2～5 中等 通常是 高 中
共显性
高 多数为1 中等 25～50 低 不是 高 少
共显性
极高 多于100 高 1～50 极高 不是 高 很少
技术难度 高 通常是 高 多
引物具有一定的通用性；
共显性标记； 缺点： 可用的位点数目少 ； 设计引物的费用高，耗时长； 物种专一性；
引物的开发有一定难度。
SSR引物在大豆中的扩增谱带
Simple Sequence Repeats －SSR
玉米回交群体的 SSR 图谱 水稻25份种质的SSR分析
水稻RM163位点上的25个等位基因
（四）基于单核苷酸多态性的分子标记
SNP (single nucleotide polymorphism，单核 苷酸多态性)标记
主要类型DNA分子标记的比较
RFLP RAPD ISSR AFLP SSR SNP
遗传特点 共显性
多态性 中等 检测基因 1～3 座位数 DNA质 量要求 DNA用 量 放射性 可靠性 耗时 高 2～10
分子标记辅助选择育种
一、概念：
DNA分子标记： 指以DNA遗传多态性为基础的一类遗传标记。
二、分子标记的优点
• • • • • • • 能稳定遗传； 多态性高、揭示的信息量大； 无表型效应； 不受环境影响； 不受组织和发育阶段的影响； 表现中性 ……
三、分子标记种类
（一）基于Southern杂交的分子标记 RFLP ( restriction fragment length polymorphism，限制性内切酶酶切片段长度多态性) 标记；
（二）基于PCR的分子标记
1. 随机引物PCR标记：
RAPD（randomly amplified polymorphic DNA ， PCR 随机扩增基因组DNA多态性）标记； ISSR（inter-simple sequence repeats，简单重复序 列间区多态性）标记。
（2）特异引物PCR标记： SSR (simple sequence repeats，简单序列重复， 微卫星 ) 标记； STS (sequence tagged-site，序列标签位点 ) 标记； DD-PCR (differential display PCR，差异显示 PCR ) 标记。
SSR是一类由2-4个核苷酸为重复 单位组成的长达几十个核苷酸片段的串 联重复序列，其两侧由特异序列构成。 首先发现于人类基因组中，现已发 现存在于许多真核生物中，如哺乳动物、 鱼类、鸟类、昆虫类、单子叶植物、双 子叶植物中SSR也广泛存在。
< SSR标记 >
基本原理：以重复序列及两侧的特 异序列作模板，以与特异序列互补的特 异引物来扩增SSR等位基因，扩增产物在 高浓度的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶 上电泳检测。 多态性来源:通常是SSR结构内部重 复单元的数量变化或重复单元的序列变 异引起的。
成本
高
较低
较低
较高
中等
很高
四、分子标记的原理和遗传特点
4.1 RFLP标记
1980年，Botstein和White等构建了人类遗传连 锁图，500多个RFLP位点，定位了Huntington病，CF
（囊性纤维化）和癌相关基因（APC，DCC 等）。
4.2 RAPD 标记
1990年，Williams和Welsh等 • 技术：随机合成10-mer引物的PCR • 依赖： 引物靶位点的突变 （显性效应） 引物靶位点间序列大片段的缺失，插入(共显性效应) • 特点： 随机序列引物 随机引物数目的增加 随机检测等位基因