molecular marker 分子标记精讲
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分子标记
生化标记
生化标记包括同工酶和等位酶标记。（以酶作为标记）
同工酶是指一个以上基因座位编码的酶的不同形式，而等位酶是指由一个基因座位的 不同等位基因编码的酶的不同分子形式。分析方法是电泳和组织化学染色法将酶的多 种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。
生化标记具两个方面的优点：一是表现近中性，对生物经济性状一
第三代分子标记技术
章丽
SNP
1.什么是SNP? 2.SNP的分类 3. SNP的检测方法
SNP: Single nucleotide polymorphism 个体间基因组DNA序列同一位置单 个核苷酸变异(替换、插入或缺失) 所引起的多态性。
2.SNP的分类
同义cSNP(synonymous cSNP) 基因编码区SNPs（cSNPs） SNP 基因周边SNPs（pSNPs） 非同义cSNP(non-synonymous cSNP) 基因间SNPs（iSNPs）
遗传多样性分析： 筛选出的13条引物共产生104条清晰条 带，其中多态性条带94条，多态百分率为 90.38% ，平均每个引物扩增条带数为8条。 结果显示，ISSR分子标记对攀枝花苏铁多 样性的研究效果很好。
最新的分子标记技术 1. RGAs 标记( Resistance Gene Analogs ,抗病基 因类似物) 2. 3. 4.
什么是遗传标记？
遗传标记genetic marker:指可追踪染色体、染 色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何 一种遗传特性。 它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性； 因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可 作为遗传标记。
遗传标记的类型
形态学标记（morphological marker）
分子标记的三个阶段
molecularmarker分子标记
molecularmarker分子标记
AFLP标记
EcoR I / Mse I酶切
EcoRI接头
C
ANN
连接 接头 PCR 预扩增 选择性 PCR
MseI接头
A NNC
molecularmarker分子标记
聚丙烯凝胶 电泳和硝酸 银染色检测
AFLP标记PAGE电泳结果
molecularmarker分子标记
新组装的杂合体。
molecularmarker分子标记
molecularmarker分子标记
分子标记的优越性
1.克服性状表现型鉴定的困难 2.允许早期选择 3.控制单一性状的多个（等位）基因的利用 4.允许同时选择多个性状 5.可进行性状非破坏性评价和选择 6.从育种进程考虑，可加快育种进程，提高
RAPD引物扩增电泳检测结果
molecularmarker分子标记
RAPD标记的主要特点：
（1）不需DNA探针，引物设计无须知道序列信息； （2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子
和纯合子； （3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等
技术； （4）样品需要量少，引物价格便宜，成本较低； （5）实验重复性较差，结果可靠性较低。
近等基因系的培育与农艺性状基因的标记
P×
F1
×
B C 1F 1
×
B C nF n N IL
molecularmarker分子标记
群体分离分析法与重要农艺性状基因的标记
群体分离分析法（bulked segregant analysis, BSA）是Michelmore等在 莴苣的抗病性研究中提出的， 简称ＢＳＡ法。 ＢＳＡ法是从近等基因系分析法演化而来的， 它省去了费时费工的选育 近等基因系过程， 克服了许多作物没有或难以创建相应ＮＩＬ的限制， 在自交和异交物种中均有广泛的应用前景。 对于尚无连锁图或连锁图饱和程度较低的植物，利用 ＢＳＡ法也是进行 快速获得与目标基因连锁的分子标记的有效方法。 此法是根据性状在 Ｆ２ 代的极端表现分成二组， 用这二组提取的 ＤＮ Ａ分别混合成 ＤＮＡ库， 用此两个 ＤＮＡ库， 筛选出与被测性状相关 的分子标记。 然后， 用此标记在分析群体中进行标记与性状间的共分离分析， 确定是 否连锁及彼此间的遗传距离， 进行基因定位。
AFLP标记
EcoR I / Mse I酶切
EcoRI接头
C
ANN
连接 接头 PCR 预扩增 选择性 PCR
MseI接头
A NNC
molecularmarker分子标记
聚丙烯凝胶 电泳和硝酸 银染色检测
AFLP标记PAGE电泳结果
molecularmarker分子标记
新组装的杂合体。
molecularmarker分子标记
molecularmarker分子标记
分子标记的优越性
1.克服性状表现型鉴定的困难 2.允许早期选择 3.控制单一性状的多个（等位）基因的利用 4.允许同时选择多个性状 5.可进行性状非破坏性评价和选择 6.从育种进程考虑，可加快育种进程，提高
RAPD引物扩增电泳检测结果
molecularmarker分子标记
RAPD标记的主要特点：
（1）不需DNA探针，引物设计无须知道序列信息； （2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子
和纯合子； （3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等
技术； （4）样品需要量少，引物价格便宜，成本较低； （5）实验重复性较差，结果可靠性较低。
近等基因系的培育与农艺性状基因的标记
P×
F1
×
B C 1F 1
×
B C nF n N IL
molecularmarker分子标记
群体分离分析法与重要农艺性状基因的标记
群体分离分析法（bulked segregant analysis, BSA）是Michelmore等在 莴苣的抗病性研究中提出的， 简称ＢＳＡ法。 ＢＳＡ法是从近等基因系分析法演化而来的， 它省去了费时费工的选育 近等基因系过程， 克服了许多作物没有或难以创建相应ＮＩＬ的限制， 在自交和异交物种中均有广泛的应用前景。 对于尚无连锁图或连锁图饱和程度较低的植物，利用 ＢＳＡ法也是进行 快速获得与目标基因连锁的分子标记的有效方法。 此法是根据性状在 Ｆ２ 代的极端表现分成二组， 用这二组提取的 ＤＮ Ａ分别混合成 ＤＮＡ库， 用此两个 ＤＮＡ库， 筛选出与被测性状相关 的分子标记。 然后， 用此标记在分析群体中进行标记与性状间的共分离分析， 确定是 否连锁及彼此间的遗传距离， 进行基因定位。
分子标记
分子标记（Molecular Markers），是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。
每一代的分子标记技术代表如下：
（1）限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）
RFLP是第一代分子标记技术，指把特定的DNA用特点的限制性核酸内切酶进行切割，将切割形成的片段进行标记之后与其他个体进行杂交，以检测不同物种间的多态性。
（2
RAPD是指把第一个生物的基因组用特定的限制性核酸内切酶进行切割，将切割后形成的片段进行扩增，以这些片段为探针来检测2个或多个物种的多态性。
SSR是第二代分子标记技术，指将人工合成或提取的2-8个核苷酸为探针，将其标记之后检测2个或多个物种的多态性。
（4
SNP是第三代分子标记技术，标记单个特殊的核苷酸，用来检测不同个体间的差异性。
检测SNP 的最佳方法是DNA 芯片技术。
对单个核苷酸的差异进行检测，SNP 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异。
分子标记ppt课件
设计出各种能与SSR序列结合的PCR引物，这些引物 的3‘端或5’端加上2－4个随机核苷酸，通过PCR反应，对 两个相距较近，方向相反的重复序列之间的DNA序列进 行扩增。所扩增的inter SSR区域的多个条带通过聚丙烯 酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辩，扩增带多 为显性表现。
5’锚定引物
• 分子标记
( molecular marker )
分子标记 广义的分子标记是指可遗传的、可检测的、与生物的表性性状连锁的
DNA序列或蛋白质。 狭义的分子标记只是指DNA标记。
DNA分子标记有其独特的优势: (1) 直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发 育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等 问题； (2) 自然界存在许多等位变异，无需人为创造，多态性高 ； (3) 遍布整个基因组，可检测的基因座位是无限的。
一个基因组的所有碱基中一般只有大约2％的碱基来 组成编码蛋白质的基因，因此测序基因组已不再是一种创 建基因目录的有效途径。大量的实验证明，cDNA的大规 模测序才是了解基因组的先驱。
EST标记技术的原理是将mRNA反转‘端或3’端进行一步法测序，一般长度为300－ 500bp，平均长度为360±120bp。所获得序列与基因数 据库已知序列比较，从而获得对生物体T标记技术也是一种相对简便和快捷鉴定大批基 因表达的技术。
M
…ACCGAATGCGC…
2 常用分子标记方法
2.1 限制性片段长度多态性标记
（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) RFLP标记是用限制性内切酶酶解具有相对性状的两个群
体的DNA，然后通过电泳和Southern杂交技术在酶切后形成的 DNA片段中发现这种不同。这种不同就是目的性状的RFLP标 记。
5’锚定引物
• 分子标记
( molecular marker )
分子标记 广义的分子标记是指可遗传的、可检测的、与生物的表性性状连锁的
DNA序列或蛋白质。 狭义的分子标记只是指DNA标记。
DNA分子标记有其独特的优势: (1) 直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发 育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等 问题； (2) 自然界存在许多等位变异，无需人为创造，多态性高 ； (3) 遍布整个基因组，可检测的基因座位是无限的。
一个基因组的所有碱基中一般只有大约2％的碱基来 组成编码蛋白质的基因，因此测序基因组已不再是一种创 建基因目录的有效途径。大量的实验证明，cDNA的大规 模测序才是了解基因组的先驱。
EST标记技术的原理是将mRNA反转‘端或3’端进行一步法测序，一般长度为300－ 500bp，平均长度为360±120bp。所获得序列与基因数 据库已知序列比较，从而获得对生物体T标记技术也是一种相对简便和快捷鉴定大批基 因表达的技术。
M
…ACCGAATGCGC…
2 常用分子标记方法
2.1 限制性片段长度多态性标记
（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) RFLP标记是用限制性内切酶酶解具有相对性状的两个群
体的DNA，然后通过电泳和Southern杂交技术在酶切后形成的 DNA片段中发现这种不同。这种不同就是目的性状的RFLP标 记。
分子标记种类及概述
分子标记概述遗传标记主要有四种类型: 形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）。
分子标记是其中非常重要的一种，他是以个体间遗传物质核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。
早在1923年，Sax等就提出利用微效基因与主基因的紧密连锁，对微效基因进行选择的设想。
但由于形态标记数目有限，而且许多标记对育种家来说是不利性状，因而难以广泛应用。
细胞标记主要依靠染色体核型和带型，数目有限。
同工酶标记在过去的二、三十年中得到了广泛的发展与应用。
作为基因表达的产物，其结构上的多样性在一定的程度上能反映生物DNA组成上的差异和生物遗传多样性。
但由于其为基因表达加工后的产物，仅是DNA 全部多态性的一部分，而且其特异性易受环境条件和发育时期的影响；此外同工酶标记的数量有限，不能满足育种需要。
近年来，分子生物学的发展为植物遗传标记提供了一种基于DNA变异的新技术手段，即分子标记技术。
与其它标记方法相比，分子标记具有无比的优越性。
它直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题；数量极多，基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；许多标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利，能够鉴别出纯合的基因型与杂合的基因型，提供完整的遗传信息。
随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。
分子标记的概念有广义和狭义之分。
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。
分子标记
的过程。
RFLP标记多态性的分子基础
Southern blotting
RFLP实验流程
移
自显影
RFLP 图谱
RFLP
显性标记 or
共显性标记
RFLP的应用：
1. 分类及遗传多样性研究
2. 遗传图谱的建立
遗传图谱(genetic map)指某一物种的染色体图谱(即连锁图谱)，
分子标记 Molecular Marker
遗传标记
遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。 1. 形态标记
形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状，如株高、
穗形、粒色或芒毛等的相对差异。形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的 外观性状，如株高、穗形、粒色或芒毛等的相对差异。
2. 细胞学标记 细胞学标记是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。染色体的
第四类为基于单核苷酸多态性的DNA标记。如：SNP标记。它是由DNA序列中因单个碱 基的变异而引起的遗传多态性。目前SNP标记一般通过DNA芯片技术进行分析。
DNA标记多态性分子基础示意图
分子标记的类型
① 基于杂交的分子标记，如RFLP（Restriction
fragment length polymorphism,即限制性长度片
Southern杂交技术才能够检测到。可见，要进行RFLP分析首先要
分离单拷贝的基因组DNA克隆或cDNA克隆，才能进行多态性分 析。 RFLP标记具有共显性、信息完整、重复性和稳定性好等优点。 但RFLP技术的实验操作过程较复杂，需要对探针进行同位素标
记，即使应用非放射性的Southern杂交技术，仍然是个耗时费力
随机引物PCR产物多态性的分子基础
类型1为显性标记，是最常见的多态 性，类型2、3、4为共显性标记，但 较少见
RFLP标记多态性的分子基础
Southern blotting
RFLP实验流程
移
自显影
RFLP 图谱
RFLP
显性标记 or
共显性标记
RFLP的应用：
1. 分类及遗传多样性研究
2. 遗传图谱的建立
遗传图谱(genetic map)指某一物种的染色体图谱(即连锁图谱)，
分子标记 Molecular Marker
遗传标记
遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。 1. 形态标记
形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状，如株高、
穗形、粒色或芒毛等的相对差异。形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的 外观性状，如株高、穗形、粒色或芒毛等的相对差异。
2. 细胞学标记 细胞学标记是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。染色体的
第四类为基于单核苷酸多态性的DNA标记。如：SNP标记。它是由DNA序列中因单个碱 基的变异而引起的遗传多态性。目前SNP标记一般通过DNA芯片技术进行分析。
DNA标记多态性分子基础示意图
分子标记的类型
① 基于杂交的分子标记，如RFLP（Restriction
fragment length polymorphism,即限制性长度片
Southern杂交技术才能够检测到。可见，要进行RFLP分析首先要
分离单拷贝的基因组DNA克隆或cDNA克隆，才能进行多态性分 析。 RFLP标记具有共显性、信息完整、重复性和稳定性好等优点。 但RFLP技术的实验操作过程较复杂，需要对探针进行同位素标
记，即使应用非放射性的Southern杂交技术，仍然是个耗时费力
随机引物PCR产物多态性的分子基础
类型1为显性标记，是最常见的多态 性，类型2、3、4为共显性标记，但 较少见
5.分子标记091110
Fluorescence Staining of DNA
• EB、SYBR Green、DAPE等
Fluorescence Staining of DNA
Isotope Labeling
Introduction of Molecular markers
现有数十种分子标记技术，万变不离其宗： 现有数十种分子标记技术，万变不离其宗： 分子杂交、PCR扩增 序列分析。 扩增、 分子杂交、PCR扩增、序列分析。 第一类：分子杂交为核心 第一类： 代表：RFLP、DNA指纹 代表：RFLP、DNA指纹 第二类：PCR为核心 第二类：PCR为核心 代表：RAPD、SSR、 代表：RAPD、SSR、AFLP 第三类：DNA序列为核心 第三类：DNA序列为核心 代表：ITS测序分析 代表：ITS测序分析
• 遗传标记（Genetic markers)：是能明确反映 遗传标记（ markers)： 遗传多态性的生物特征。 遗传多态性的生物特征。 • 遗传多态性(Genetic polymorphisms)：经典遗 遗传多态性(Genetic polymorphisms)： 传学中指等位基因的变异； 传学中指等位基因的变异；现代遗传学中指的 是基因组中任何位点上的相对差异。 是基因组中任何位点上的相对差异。
Principle of RAPD
• 原理：以 PCR 为基础 , 利用人工合成的约10 b的随机 原理： 利用人工合成的约10 b的随机 序列寡核苷酸作引物 , 以生物的基因组 DNA 为模板 , 进行 PCR 扩增 , 产生不连续的 DNA 产物 , 通过琼脂 序列的多态性。 反应的每 糖凝胶电泳来检测 DNA 序列的多态性。 RAPD 反应的每 95℃的高温下变性 次循环中 , 双链 DNA 在 95℃的高温下变性 , 解开双 螺旋成为单链模板 , 然后在低温 (36 ℃) 条件下与随 多聚酶的作用下， 机引物结合 , 在 DNA 多聚酶的作用下，按碱基互补原 的方向把核苷酸链延长， 复制。 则沿 5‘至3’的方向把核苷酸链延长，完成 DNA 复制。
常用分子标记技术原理及应用-文档资料
分子标记的分类
在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经发展了 很多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分 为三大类： 第一类：是以分子杂交为核心的分子标记，包括RFLP、DNA
指纹技术等，这类分子标记被称为第一代分子标记；
第二类：是以PCR为核心的分子标记，包括随机扩增多态性 RAPD、简单序列重复SSR、扩增片段长度多态性AFLP、序列 标签位点STS等，为第二代分子标记； 第三类：是一些新型的分子标记，如：SNP标记、表达序列 标签EST标记等，也以PCR技术为基础，为第三代分子标记。
eg:蛋白质标记如种子贮藏蛋白同工酶（指由一个以上基 因位点编码的酶的不同分子形式）
2.狭义的分子标记（DNA marker)概念只是指DNA标记
能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的
DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。
分子标记（DNA marker）
分 子 标 记 的 概念：是以直接检测DNA核苷酸序列的 差异为基础的遗传标记，又叫DNA分子标记。 分子标记的特点： (相对形态，细胞，生化标记具有的优点)
几种主要的ＤＮＡ分子标记
英文缩写 RFLP STS RAPD AFLP 英文名称 Restriction fragment Iength polymorphism Sequence tagged site Random amplified polymorphic DNA Amplified frangment length Polymorphism 中文名称 限制性片段长度多态性 序列标签位点 随机扩增多态性DNA 扩增片断长度多态性
( Amplified Fragment Length Polymorphism )
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分子标记及辅助育种技术
分子标记的类型：
第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包 括RFLP、DNA指纹技术等； 第二类是以PCR为核心的分子标记技术，包括 RAPD、简单序列重复标记SSR、序标位STS、 序列特征化扩增区域SCAR等； 第三类是一些新型的分子标记，如：SNP标记、 表达序列标签EST标记等。
等。。。。。。。
分子标记辅助选 择的遗传学基础
标记辅助选择的主要方面是对目标基因的选择，有 人称之为前景选择（foreground selection）。
前景选择的可靠性主要取决于标记与目标基因间连
锁的紧密程度。若只用一个标记对目标基因进行选
择，则标记与目标基因间的连锁必须非常紧密，才
能够达到较高的正确率。
目标基因的标记筛选（gene tagging）是进行 分子标记辅助选择（MAS）育种的基础。用于 MAS育种的分子标记须具备三个条件：
①分子标记与目标基因紧密连 锁 ②标记实用性强，重复性好， 而且能够经济简便地检测大 量个体。 ③不同遗传背景选择有效。
S107CTGCATCGTG S108GAAACACCCC
S109TGTAGCTGGG
S110CCTACGTCAG S111CTTCCGCAGT S112ACGCGCATGT RAPD引物扩增电泳检测结果
RAPD标记的主要特点：
（1）不需DNA探针，引物设计无须知道序列信息； （2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子 和纯合子；
rr
r2
MM类型的分子标记所代表的目标基 因型及其频率
选择的正确率随 重组率的增加而 迅速下降。重组 值越小，其错选 率越低。
如果要求至少选到 一株目标基因型的 概率为P，则必须选 择具有标记基因型 MM的植株至少为：
n＝log（1-P）/log（1-p） 式中p＝（1－r）2
对基因组中其他部分（即遗传背景）选择，称为 背景选择（background selections）。背景选 择的对象几乎包括了整个基因组，因此，这里牵 涉到一个全基因组选择的问题，在分离群体中， 由于在上一代形成配子时同源染色体之间会发生 交换，因此每条染色体都可能是由双亲染色体重 新组装的杂合体。
（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等
技术；
（4）样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；
（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。
AFLP标记
EcoR I / Mse I酶切
连接 接头 EcoRI接头
C
MseI接头
A A N N
PCR 预扩增
N N C
选择性 PCR
聚丙烯凝胶 电泳和硝酸 银染色检测
不干扰
D RFLP标记起源于基因组DNA的自身变异，在数量上 几乎不受限制 E DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的 育种实践中。在植物分子标记辅助育种中需要将RFLP
转换成以PCR为基础的标记。
RAPD标记
S104GGAAGTCGCC S105AGTCGTCCCC
S106ACGCATCGCA
AFLP标记PAGE电泳结果
AFLP标记的主要特点：
（1）由于AFLP分析采用的限制性内切酶及选择性碱基种
类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多
的； （2）每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分 析可以同时检测到多个座位，且多态性极高； （3）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传；
较高。
简单重复间序列（ISSR）标记
SNP标记
SNP密度高，分布广，平均约每1000对碱基出现 一个SNP。 两个无关个体间约有300万个SNPs。
其它分子标记技术
DAF (DNA amplification fingerprinting，DNA扩增指纹)
AP-PCR (arbitrary primer PCR) SCAR (sequence characterized amplified region，序列 特异性扩增区) STS (sequence tagged site，序列标签位点)、 SSCP (single strand confirmation polymorphism，单链 构象多态性)、 CAPS (cleave amplified polymorphic sequence)。
供体
M R
受体
m r
目标基因与DNA标记间的遗传距离位p
亲本中DNA标记的带型 M—抗性标记 R—抗性基因 m—感病标记 r—感病基因 F1杂种中DNA标记的带型 在F2分离群体中分子标记类型 即MM,Mm,mm
M
m
R
r
利 用 MAS 的 遗 传 基 础 （以 RFLP 为 例）
RR Rr
(1-r)2 2r(1-r)
DNA提取 基 用DNA限制性内切酶消化 本
凝胶电泳分离，转移到滤膜上
步
Southern杂交
骤 放射性自显影或酶学检测
RFLP标记的特点
A 无表型效应，不受环境条件和发育阶段的影响。
B
C
等位基因之间是共显性的，在配制杂交组合时不受
杂交方式的影响。 在非等位的RFLP标记之间不存在上位效应，因而互
（4）分辩率高，结果可靠；
（5）目前该技术受专利保护。
（简单重复序列） SSR标记
SSR标记的主要特点：
（1）数量丰富，广泛分布于整个基因 （2）具有较多的等位性变异； （3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子； （4）实验重复性好，结果可靠；
（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端
的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也
分子标记的特点：
（1）直接以DNA的形式表现，表现稳定 （2）数量多
（3）多态性高
（4）表现为中性，不影响目标性状的表达； （5）许多标记表现为共显性的特点，能区别 纯合体和杂合体。 （6）成本不太高
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ RFLP标记
植物基因组DNA上的 碱基替换、插入、缺失
或重复等，造成某种限
制性内切酶酶切位点的 增加或丧失，从而产生 限制性片断长度多态 性。
分子标记的优越性
1.克服性状表现型鉴定的困难 2.允许早期选择 3.控制单一性状的多个（等位）基因的利用 4.允许同时选择多个性状 5.可进行性状非破坏性评价和选择 6.从育种进程考虑，可加快育种进程，提高 育种效率
开展分子标记辅助选 择应具备的主要条件
A：与目标基因紧密连锁的分子 标记 B: 简便快捷的标记检测方法
分子标记的类型：
第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包 括RFLP、DNA指纹技术等； 第二类是以PCR为核心的分子标记技术，包括 RAPD、简单序列重复标记SSR、序标位STS、 序列特征化扩增区域SCAR等； 第三类是一些新型的分子标记，如：SNP标记、 表达序列标签EST标记等。
等。。。。。。。
分子标记辅助选 择的遗传学基础
标记辅助选择的主要方面是对目标基因的选择，有 人称之为前景选择（foreground selection）。
前景选择的可靠性主要取决于标记与目标基因间连
锁的紧密程度。若只用一个标记对目标基因进行选
择，则标记与目标基因间的连锁必须非常紧密，才
能够达到较高的正确率。
目标基因的标记筛选（gene tagging）是进行 分子标记辅助选择（MAS）育种的基础。用于 MAS育种的分子标记须具备三个条件：
①分子标记与目标基因紧密连 锁 ②标记实用性强，重复性好， 而且能够经济简便地检测大 量个体。 ③不同遗传背景选择有效。
S107CTGCATCGTG S108GAAACACCCC
S109TGTAGCTGGG
S110CCTACGTCAG S111CTTCCGCAGT S112ACGCGCATGT RAPD引物扩增电泳检测结果
RAPD标记的主要特点：
（1）不需DNA探针，引物设计无须知道序列信息； （2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子 和纯合子；
rr
r2
MM类型的分子标记所代表的目标基 因型及其频率
选择的正确率随 重组率的增加而 迅速下降。重组 值越小，其错选 率越低。
如果要求至少选到 一株目标基因型的 概率为P，则必须选 择具有标记基因型 MM的植株至少为：
n＝log（1-P）/log（1-p） 式中p＝（1－r）2
对基因组中其他部分（即遗传背景）选择，称为 背景选择（background selections）。背景选 择的对象几乎包括了整个基因组，因此，这里牵 涉到一个全基因组选择的问题，在分离群体中， 由于在上一代形成配子时同源染色体之间会发生 交换，因此每条染色体都可能是由双亲染色体重 新组装的杂合体。
（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等
技术；
（4）样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；
（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。
AFLP标记
EcoR I / Mse I酶切
连接 接头 EcoRI接头
C
MseI接头
A A N N
PCR 预扩增
N N C
选择性 PCR
聚丙烯凝胶 电泳和硝酸 银染色检测
不干扰
D RFLP标记起源于基因组DNA的自身变异，在数量上 几乎不受限制 E DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的 育种实践中。在植物分子标记辅助育种中需要将RFLP
转换成以PCR为基础的标记。
RAPD标记
S104GGAAGTCGCC S105AGTCGTCCCC
S106ACGCATCGCA
AFLP标记PAGE电泳结果
AFLP标记的主要特点：
（1）由于AFLP分析采用的限制性内切酶及选择性碱基种
类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多
的； （2）每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分 析可以同时检测到多个座位，且多态性极高； （3）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传；
较高。
简单重复间序列（ISSR）标记
SNP标记
SNP密度高，分布广，平均约每1000对碱基出现 一个SNP。 两个无关个体间约有300万个SNPs。
其它分子标记技术
DAF (DNA amplification fingerprinting，DNA扩增指纹)
AP-PCR (arbitrary primer PCR) SCAR (sequence characterized amplified region，序列 特异性扩增区) STS (sequence tagged site，序列标签位点)、 SSCP (single strand confirmation polymorphism，单链 构象多态性)、 CAPS (cleave amplified polymorphic sequence)。
供体
M R
受体
m r
目标基因与DNA标记间的遗传距离位p
亲本中DNA标记的带型 M—抗性标记 R—抗性基因 m—感病标记 r—感病基因 F1杂种中DNA标记的带型 在F2分离群体中分子标记类型 即MM,Mm,mm
M
m
R
r
利 用 MAS 的 遗 传 基 础 （以 RFLP 为 例）
RR Rr
(1-r)2 2r(1-r)
DNA提取 基 用DNA限制性内切酶消化 本
凝胶电泳分离，转移到滤膜上
步
Southern杂交
骤 放射性自显影或酶学检测
RFLP标记的特点
A 无表型效应，不受环境条件和发育阶段的影响。
B
C
等位基因之间是共显性的，在配制杂交组合时不受
杂交方式的影响。 在非等位的RFLP标记之间不存在上位效应，因而互
（4）分辩率高，结果可靠；
（5）目前该技术受专利保护。
（简单重复序列） SSR标记
SSR标记的主要特点：
（1）数量丰富，广泛分布于整个基因 （2）具有较多的等位性变异； （3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子； （4）实验重复性好，结果可靠；
（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端
的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也
分子标记的特点：
（1）直接以DNA的形式表现，表现稳定 （2）数量多
（3）多态性高
（4）表现为中性，不影响目标性状的表达； （5）许多标记表现为共显性的特点，能区别 纯合体和杂合体。 （6）成本不太高
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ RFLP标记
植物基因组DNA上的 碱基替换、插入、缺失
或重复等，造成某种限
制性内切酶酶切位点的 增加或丧失，从而产生 限制性片断长度多态 性。
分子标记的优越性
1.克服性状表现型鉴定的困难 2.允许早期选择 3.控制单一性状的多个（等位）基因的利用 4.允许同时选择多个性状 5.可进行性状非破坏性评价和选择 6.从育种进程考虑，可加快育种进程，提高 育种效率
开展分子标记辅助选 择应具备的主要条件
A：与目标基因紧密连锁的分子 标记 B: 简便快捷的标记检测方法