感受态制备蓝白斑筛选
蓝白斑筛选
一、1、蓝白筛选的原理LacZ'是lacZ基因的突变型，编码半乳糖苷酶N端的146个氨基酸（全长1201氨基酸）。
MCS也在这个区域内。
这类载体的适合宿主细胞必须是Z基因突变型，只具有Z基因C端的序列。
当两个Z基因的突变产物在一起时可产生蛋白质间的互补，称α互补。
如pUC系列的载体一般采用DH5α、JM109。
因为pUC系列的质粒具有lacZ的α片段，而具有lacZ△M15基因型的DH5α、JM109等能表达与α片段互补的ω片段，因此当不带有外源基因的质粒pUC导入宿主细胞，具有lacZ的β-半乳糖苷酶活性，而插入外源基因的pUC质粒导入宿主细胞，则不具有β-半乳糖苷酶活性。
当将具有α互补的细菌培养在含IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，本身无色）的培养基上时，因β-半乳糖苷酶能将X-gal底物水解产生兰色物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的5-溴-4-氯靛兰），因此菌落为兰色。
相反，不互补则产生白色菌落。
如果在MCS位点上插入DNA片段导致插入突变，则不能产生α互补，因此菌落是白色的。
从而通过菌斑的颜色即可选择出具有插入外源基因的质粒的大肠杆菌。
2、影响转化率的几个重要因素⑴、受体细胞转化的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，它可容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
另外还应根据载体的性质及实验的目的选择合适的宿主。
此外，受体细胞生长状态和密度也很重要。
不要使用经过多次转接或储存于4℃的培养菌。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，密度过高或不足均会影响转化率。
⑵、载体DNA和重组DNA方面载体本身性质决定了转化的高低，不同的载体DNA转化同一受体细胞，其转化效率不同。
载体的空间构象也有明显影响，超螺旋结构的载体质粒往往有较高的转化率，经体外酶切连接操作后的载体DNA或重组DNA由于空间上难以恢复，其转化率常比cccDNA低两个数量级。
蓝白斑筛选步骤
1.取目的基因DNA10ul，加入到100ul的感受态细胞中，轻轻混匀，并置于冰上放置30min。
2.将感受态细胞于42 ℃水浴中热休克90s后迅速置于冰上放置2min。
3.加入800ulLB液体培养基（-AMP），37 ℃，200r/min摇菌液60min。
4.将摇菌后的转化菌液3000rpm离心3min，吸取LB液体上清液700ul弃除，留200ul液体在离心管内，轻轻吹打沉淀，然后取每组连接反应转化原液取200μl+40ul X-gal溶液+4ulIPTG溶液混匀，用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。
5.倒置平板于37℃继续培养12-16小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。
放于4℃数小时,使显色完全。
6.用无菌枪头挑取白色单菌落接种于含Amp 50μg/ml的5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时。
感受态细胞的制备、转化及重组质粒的筛选
5. 4℃，4000 rpm离心4 min，弃去上清液，加入 50 μl预冷的0.1mol／L CaCl2溶液，加入10 μl重组质 粒DNA溶液，轻轻混匀，小心悬浮细胞后置于冰上 25-30min。
6. 将上述混合物转移到42℃水浴锅中，热休克90s （不要摇动EP管！），然后将EP管迅速转移到冰 上，冷却2-5min。
6. 将上述混合物转移到42℃水浴锅中，热休克90s （不要摇动EP管！），然后将EP管迅速转移到冰 上，冷却2-5min。
7. 向上述管中加入400μl 的LB液体培养液，然后 37℃，100 rpm，振荡培养约45-60 min。
8. 取100 μl转化细胞至含有适当抗生素的LB平板 上，用灭菌的玻璃棒（一定要冷却后再涂菌！） 涂布均匀，室温放置待菌液完全被吸收后，倒置 培养皿，37℃培养过夜。
激活 IPTG
非代谢性的乳糖启动子诱导剂
含有X-gal和IPTG的培养基
细菌染色体
含有lacZ基因C端序列
β-半乳糖苷酶缺陷型菌株
插入片段到多克隆位点 lacZ‘基因被破坏
载体
无法生成 有活性的 β-半乳糖苷酶
含有X-gal和IPTG的培养基
操作步骤
1. 从LB平板上挑取新活化的E.coli单菌落。接种于
重组DNA的转化原理
转化: 是质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入 细菌的过程。
细菌处于0℃、CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀呈 球形，转化混合物中的DNA形成DNA的羟基-钙磷 酸复合物粘附于细胞表面，经42 ℃短时间热击处 理，促使细胞吸附DNA复合物，在丰富的培养基 上培养数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。
3-5ml LB液体培养集中，37℃下振荡培养12h左右， 直至对数生长后期； 2. 再将该菌悬液以1：100的比例接种于LB液体培 养基中，37 ℃振荡培养至OD600 达0.5左右。
感受态制备、蓝白斑筛选课件
细菌培养与筛选
在选择性培养基上培养细菌，通 过蓝白斑筛选获得阳性克隆。
转化效率检测
转化效率计算
通过比较转化前后的菌落数，计算转化效率。
转化效率影响因素
细菌生长状态、质粒质量、电穿孔条件等。
提高转化效率的方法
优化感受态制备和电穿孔条件、使用高拷贝质粒等。
04 实验操作注意事项
安全注意事项
01
实验操作应在生物安全 柜中进行，确保空气流 通，防止细菌和病毒的 污染。
转化效率低
可能是由于质粒DNA浓度过低或感 受态细胞状态不佳。解决方案：确保 质粒DNA浓度适中，并优化感受态 细胞的制备条件。
转化后细胞生长缓慢
可能是由于质粒DNA整合过程中对细 胞产生了毒性。解决方案：尝试使用 不同的质粒或优化质粒的整合条件， 以降低对细胞的毒性。
THANKS FOR WATCHING
实验中使用的试剂和器具应准 确计量，避免误差。
实验结束后，应及时清洗和消 毒实验器具，确保清洁卫生。
实验结果分析
实验结果应进行详细记录和分析，确 保数据的准确性和可靠性。
对于异常结果，应进行深入分析和探 究，找出可能的原因和解决方案。
数据分析应采用适当的统计方法和技 术，以得出科学结论。
实验结果应与文献报道和前人研究结 果进行比较和分析，以验证实验的可 靠性和科学性。
蓝白斑筛选操作流程
转化
将目的基因与载体混合，加入 到感受态细胞中，进行冰浴、 热激转化。
培养
将平板倒置，在37℃恒温培养 箱中培养12~16小时。
准备培养基
制备LB培养基，加入X-gal、 IPTG和Amp。
涂板
将转化后的菌液均匀涂布在含 有X-gal、IPTG和Amp的LB培 养基上。
感受态制备、蓝白斑筛选
目 录
(插入失活法) 抗药性标记选择
菌落杂交筛选法
01
添加标题
内切酶图谱鉴定
02
添加标题
PCR筛选重组子
03
添加标题
Southern印迹杂交和菌落原位杂交
04
添加标题
DNA序列分析
05
添加标题
免疫化学检测法
06
添加标题
蓝白斑实验
原理：基因载体上含有ß-半乳糖苷酶（LacZ)的基因，当外源DNA插入到载体的LacZ基因上后将造成ß-半乳糖苷酶失活，就不能分解培养基中的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-ß-D-半乳糖苷）产生蓝色产物，结果可通过大肠杆菌转化子菌落在含有X-gal-IPTG（异丙基-ß-D-硫代半乳糖苷）培养基的颜色变化直接观察出来。
制备感受态细胞和转化的常用方法
CaCl2转化程序法：传统方法,转化效率能达到5106－2107转化子/g质粒DNA，简单、快速、重复性好、菌株适用范围广。 电穿孔转化法、脂质体(liposome)法、胞核的显微注射法(microinjection)； 磷酸钙介导的转染、聚乙二醇介导的原生体转化法；
CaCl2处理
受体细菌
50-100mmol/L
CaCl2
感受态细菌
重组体转入细菌
感受态(competent)：宿主细胞处于容易吸收外源性DNA的状态，处于感受态的细胞称为感受态细胞.
正常细胞都有细胞膜（细菌还有细胞壁）作屏障，对外源分子选择性接受。在实验中通过一定的理化条件使细胞通透性增大，处于感受态。
6
Thank you！
重组DNA分子导入受体细胞的手段
01.
转化是将含有目的基因的质粒导入细菌内进行表达。
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化_实验报告
分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxx学号：xxx日期：xxx大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化1 引言在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。
体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。
感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。
本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
2 材料和方法2.1 实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA 的目的。
进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。
大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。
而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。
感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。
本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。
转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。
重组DNA的化学转化与蓝白斑筛选
重组DNA的化学转化与蓝白斑筛选实验目的1.掌握重组DNA的化学转化的实验原理及操作过程。
2.熟悉蓝白斑筛选的原理及鉴定重组转化子的方法。
实验原理1.化学转化转化是指将外源DNA导入细菌、真菌的过程，使外源DNA在宿主细胞内进行复制和表达。
将感受态细胞和外源DNA混合物冰浴后，经42℃短时间的热激处理，感受态细胞液晶结构的细胞膜表面产生裂隙，有利于感受态细胞吸收摄取DNA复合物。
因此，外源DNA通过吸附、转入、自稳进入细胞内，从而得以复制、表达。
2蓝白斑筛选蓝白斑筛选是筛选重组子的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子，主要为α-互补与抗生素基因。
在添加有X-gal、IPTG 和相应抗生素的培养基上，未含有重组质粒的菌落因为没有抗生素抗性，不能生长，而含有重组质粒的菌落是白色的，含有非重组质粒的菌落是蓝色的，以颜色为依据直接筛选重组子。
培养基中的IPTG可诱导载体Lac操纵子DNA区段合成β-半乳糖苷酶氨基端片段，该片段可与宿主细胞编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α互补）。
实现α互补的细菌涂布在含有X-gal生色底物的培养基上，可形成蓝色菌落，外源DNA插入质粒的多克隆位点后可破坏α互补作用，将产生白色菌落。
实验器材高温高压灭菌锅、超净工作台、移液器、移液器吸头、恒温摇床、恒温培养箱、三角瓶、培养皿、离心机、制冰机、涂布棒、连接体系（重组DNA pUC19-3055）等。
实验试剂（1）大肠杆菌感受态细胞。
（2）培养基：LB，LA。
（3）溶液：20mg/ml X-gal溶液（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），50mg/ml IPTG溶液（异丙基硫代半乳糖苷），100mg/ml Amp 溶液（氨苄青霉素）。
实验操作（1）从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，放置于冰上融化。
（2）将10μl的连接体系加入已融化的感受态细胞中，混匀后冰浴20min。
（3）将上述混合物置于42℃水浴锅中热激90s，随后立即冰浴3～5min。
蓝白斑筛选的原理及应用
蓝白斑筛选的原理及应用1. 前言蓝白斑筛选（Blue-white screening）是一种常用的分子生物学技术，用于检测DNA重组是否成功。
通过该技术，可以筛选出含有重组DNA的菌落，从而实现对目标基因的定位和表达。
2. 原理蓝白斑筛选的原理基于β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）的活性差异。
在该筛选系统中，包含有DNA重组产物的细菌表型为蓝色，未重组的细菌表型为白色。
具体的实验步骤如下：1.在含有相应选择性抗生素的培养基上培养细菌。
2.通过转化技术将重组的质粒DNA导入细菌宿主中。
3.将转化后的细菌涂布在含有X-半乳糖苷（X-Gal）的琼脂糖平板上。
4.在琼脂糖平板上，转化成功的细菌会表现为蓝色的菌落，未转化的细菌则为白色。
3. 应用蓝白斑筛选广泛应用于基因克隆、基因工程、蛋白质表达等研究领域。
3.1 基因克隆在基因克隆中，蓝白斑筛选常用于检测重组质粒的构建是否成功。
通过筛选出蓝色的菌落，可以快速确定重组质粒中是否含有目标基因。
3.2 基因工程在基因工程中，蓝白斑筛选被用于定位和筛选带有特定序列的质粒。
通过构建含有目标基因的质粒，将其导入细菌中，可以筛选出含有目标基因的蓝色菌落，从而实现对基因的定位和表达。
3.3 蛋白质表达蓝白斑筛选还可以用于蛋白质表达的研究。
通过将目标蛋白基因插入表达载体中，并导入细菌中进行表达，可以通过蓝白斑筛选系统筛选出表达目标蛋白的菌落。
4. 优势和局限性4.1 优势•简单易行：蓝白斑筛选是一种简单易行的筛选方法，无需复杂的仪器设备，只需要琼脂糖平板和相应的培养基。
•高效性：通过蓝白斑筛选系统，可以快速筛选出重组细菌，提高工作效率。
•直观可视化：转化成功的细菌会在琼脂糖平板上形成蓝色的菌落，使得检测结果可以直观地通过肉眼观察。
4.2 局限性•假阳性筛选：由于β-半乳糖苷酶活性的变异性，部分非重组菌落也可能呈现蓝色。
因此，在分析筛选结果时需采取其他方法进行验证。
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CaCl 2法制备感受态细胞和转化的原理
一般受体菌对重组 DNA分子的摄取能力很低，难以转化成功。 当细菌处于冰冷（0℃）0.05～0.1M的 CaCl 2低渗溶液中，菌体的细胞 膨胀成球形，细胞膜的通透性增加，对 DNA的摄取能力增强，转化效 率提高（感受态细菌）。
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三、重组体的筛选
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重组体克隆的筛选与鉴定
由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛 选和鉴定方法得到含有重组 DNA的阳性克隆。
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筛选的依据： 基因载体的特点、受体细胞的特性和外源基因的表达。 筛选的方法：
抗药性标志的选择 插入表达筛选 ? -半乳糖苷酶系统筛选（ ? -互补） (? -半乳糖苷酶能将 X-gal 转变为不溶性的深蓝沉淀）
转
转入受体菌
筛
筛选重组体
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基因工程
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一、感受态细胞及重组体转化
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重组体转入受体菌
转化（transformation ）
转染（transfection ） 转导（transduction ）
受体细胞
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重组DNA分子导入受体细胞的手段
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制备感受态细胞和转化的常用方法
CaCl 2转化程序法：传统方法,转化效率能达到5? 106－2?107转化子/? g质 粒DNA，简单、快速、重复性好、菌株适用范围广。 电穿孔转化法、脂质体 (liposome) 法、胞核的显微注射法 (microinjection) ； 磷酸钙介导的转染、聚乙二醇介导的原生体转化法；
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0.1mol/LCaCl 2
0℃
重组体
感受态细胞
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转化与感受态细胞
转化(transformation) ：在分子克隆技术中，转化特指质粒 DNA或以它为 载体构建的重组子导入细菌的过程。 区别转化、转染(transfection) 与转导(transduction)
特殊处理
受体细胞 细胞膜特性改变
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50-100mmol/L CaCl2
受体细菌
感受态细 菌
重组体转入细 菌
CaCl2处理
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感受态 (competent) ：宿主细胞处于容易吸收外源性 DNA的 状态，处于感受态的细胞称为感受态细胞 .
正常细胞都有细胞膜（细菌还有细胞壁）作屏障，对外源分 子选择性接受。在实验中通过一定的理化条件使细胞通透性增 大，处于感受态。
弃上清，将管倒置于滤纸上1min ，使液体流干净 沉淀中加入冰冷的0.1mol/L CaCl 2 100μl，重悬菌体。
冰浴10min
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冰浴10min 后 每管加入质粒5? l 轻轻旋转试管，混匀混合物，在冰浴上放置 20min 试管放入420C的水浴中，放置90s，不要摇动试管 迅速将试管转移到冰浴，冷却 1~2min
含pUC119 -u6 的白 色菌落
? 感受态细胞的制备 ? 质粒转化入大肠杆菌及初步筛选
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? 复习：基因克隆示意图
载 体 DNA
＋
(限制性内切酶切开 )
目的基因
＋
宿主细胞
重组体
已转化的宿主细胞
繁殖 阳性克隆株
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基因克隆操作过程：
分Байду номын сангаас
分离载体和目的基因
切
限制酶切载体与目的基因
接
拼接重组体
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抗 药
插(
性入
标失
记活
选法
择)
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目录
菌落杂交筛选法 内切酶图谱鉴定 PCR筛选重组子 Southern印迹杂交和菌落原位杂交 DNA序列分析 免疫化学检测法
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蓝白斑实验
原理：基因载体上含有? -半乳糖苷酶（LacZ) 的基因，当外源DNA插 入到载体的LacZ 基因上后将造成? -半乳糖苷酶失活，就不能分解培养 基中的X-gal(5- 溴-4-氯-3-吲哚-? -D-半乳糖苷）产生蓝色产物，结果可 通过大肠杆菌转化子菌落在含有 X-gal-IPTG （异丙基-?-D-硫代半乳糖 苷）培养基的颜色变化直接观察出来。
转化是将含有目的基因的质粒导入细菌内进行表达。 转染是将含有真核生物基因的噬菌体感染细胞 ; 转导则是指病毒从被感染的细胞 (供体)释放出来，再
次感染另一细胞(受体时)，发生供体细胞与受体 细胞之间的DNA转移及基因重组。
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转化方法
? CaCl2诱导转化 ? 电穿孔 ? PEG介导转化 ? 人工体外包装
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二、感受态细胞制备及重组体 转化的实验操作及注意事项
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细菌转移到一冰冷的1.5ml的EP 管，40C，4000rpm ×5min
弃上清，沉淀中加入冰冷的0.1mol/L CaCl 2 300μl，重悬菌体，冰浴20min 40C，4000rpm ×5min
同时在转化体系中的 DNA形成的抗DNase的羟基-钙磷酸复合物能 粘附于细菌表面，经过 42℃短时间热休克（ heat shock ）处理，促进感 受态细胞吸收 DNA复合物。在丰富培养基上生长 1小时后，球状细胞复 原并分裂增殖，重组子中的基因在转化细菌中得到表达，在选择性培 养(selective culture) 平板上即可筛选出所需的转化子。
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取出试管后，每管加入LB培养基800? l， 置于370C摇床（100~150r/min），温和震荡45min 用无菌弯头玻璃铺菌器将200? l菌液铺于含Amp的琼脂平板表面
室温放置20min，使液体被吸收（发汗） 倒置平皿，370C培养，12小时可见菌落生长
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冠满—卵螨全杀 干净彻底
α
U
互
6
补
的
检
测
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目录
原位 杂交
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目录
Southern 印迹
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目录
鸡的β肌球蛋白的克隆和检出
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目录
预期结果
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pUC119
pUC119 -u6
含空载体pUC119 的蓝色菌落