革兰氏染色实验步骤演示教学
革兰氏染色教学ppt课件
2.3、意义：
(1) 鉴别细菌:用此染色法可将所有细菌分为两大 类,这样可将致病菌的范围缩小,然后再进一步鉴定。 (2)选择药物:革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌在细胞 壁等结构上有很大差别,因而对抗生素的敏感性不 同。例如大多数阳性菌对青霉素敏感大多数阴性 菌对青霉素不敏感(脑膜炎球菌等除外),可供临床 实践中选用抗菌药物的参考。 (3)与致病性的关系:大多数革兰氏阳性菌的致病物 质主要为外毒素;而大多数革兰氏阴性菌的致病物 质主要为内毒素.
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细菌结构模式图
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2.7实验原理：
① G+细菌的细胞壁
• G+细菌细胞壁具有较厚(20-80nm)而致 密的肽聚糖层，多达20层，占细胞壁成分 的60%~90%，它同细胞膜的外层紧密相 连 ；有的G+细菌细胞壁中含有磷壁酸。细 胞生长中有自溶素(酶类)起作用，磷壁 酸对自溶素有调节功能，阻止胞壁过度降 解和壁溶。如果细胞壁的肽聚糖层被消溶， G+ 细 胞 成 为 原 生 质 体 ( protoplasts) ， 细 胞壁不复存在，而只存留细胞膜。除链球 菌外，大多数G+细菌细胞壁中含极少蛋白
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2.4具体操作步骤：
2.4.1涂片： 左手持菌液试管，右手持接种环， 用接种环从试管培养液中取一环菌，从酒 精灯外焰穿过，于载玻片中央涂成薄层( 事先在背面做好标记圆圈)即可，或先滴 一小滴无菌水于载玻片中央，用接种环从 斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混合 均匀，涂成一薄层。拔或塞试管塞时，应 将试管口通过火焰略加烧灼，最后将接种 环在火焰上烧灼灭菌。
革兰染色
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一、染色标本的制备
1、涂片：载玻片上滴加生理盐水一滴，接种环取待检 菌培养物少许，研入无菌生理盐水中，形成一个极薄的 均匀的菌膜，直径在1cm左右为宜。如果时液体培养物 则直接取少许菌液涂成菌膜。
革兰氏染色操作方法过程
革兰氏染色操作方法过程革兰氏染色是一种常用的细菌染色方法，用于区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
操作步骤如下：1. 取一支细菌培养液，用无菌棉签蘸取适量的细菌样品。
2. 在显微镜片上滴加一滴细菌样品。
3. 用锡夹夹住显微镜片，将显微镜片通过火焰杀菌，以消毒细菌样品。
4. 将显微镜片上的细菌样品放置于乙醇中，浸泡1-2分钟，进行固定。
5. 取出显微镜片，倾倒掉乙醇，用水冲洗显微镜片，以去除残留的乙醇。
6. 滴加革兰氏染色液（由紫色的结晶紫和碘酒混合制成），使其完全覆盖细菌样品。
7. 静置1分钟，将显微镜片冲洗至水清。
8. 将显微镜片放入去结晶紫酒的洗涤液中，浸泡20-30秒，进行除色。
9. 冲洗干净后，加入洗净的碱性碘液，浸泡20-30秒，进行碘固定。
10. 将显微镜片放入无菌水中，冲洗干净。
11. 用酒精洗液将显微镜片沥干。
12. 将显微镜片放入苏木精洗涤液中，浸泡20-30秒，进行染色。
13. 冲洗干净后，用水洗涤。
14. 用酒精洗液将显微镜片沥干。
15. 将显微镜片放入氯仿中，浸泡1-2分钟，清洗细胞。
16. 用酒精洗液将显微镜片沥干。
17. 将显微镜片放入醋酸乙酯中，浸泡1-2分钟，清洗细胞。
18. 用酒精洗液将显微镜片沥干。
19. 将显微镜片倒置在玻璃片上晾干。
20. 最后，在显微镜下观察染色结果。
革兰氏阳性菌为紫色，革兰氏阴性菌为粉红色。
注意事项：- 操作中要使用无菌试剂和器皿，以防止细菌污染。
- 染色液的配制和保存要按照说明书进行。
- 操作过程中要注意不要受伤，避免染色液和化学物品溅到皮肤或眼睛上。
- 染色后，显微镜片要彻底干燥，以便观察。
《革兰氏染色法》课件
将脱色后的涂片用番红染液复染，时间约为1-2分钟。番红是 一种酸性染料，可以和蛋白质结合，使菌体或细胞呈现红色 。
番红复染的作用是使菌体或细胞呈现红色，使其更加明显， 有助于观察和鉴别。同时，番红还可以与结晶紫形成鲜明的 对比，使观察更加准确。
冲洗与干燥
• 将染色完成的涂片用清水冲洗干净，然后晾干或用吸水纸吸干 水分。冲洗的目的是去除染色过程中残留的染料和媒染剂等物 质，以免对观察造成干扰。干燥的目的是使涂片固定，以便于 保存和观察。
背景
革兰氏染色法的发明对于细菌学的发展起到了重要的推动作 用，为后续的细菌分类、疾病诊断和治疗提供了有力支持。
染色原理
原理
革兰氏染色法的染色原理主要是通过 一系列的脱色处理和复染，使细菌着 色，从而根据颜色差异将细菌分为革 兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。
操作流程
革兰氏染色法通常包括涂片、脱色、 媒染、染色和复染等步骤，通过这些 步骤的组合和调整，可以实现对不同 类型细菌的准确鉴别。
革兰氏染色法的结
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果与意义
革兰氏阳性菌与阴性菌的染色特性
革兰氏阳性菌
被染成紫色或蓝紫色，不易被酒 精脱色，有厚重的革兰氏染色反 应。
革兰氏阴性菌
被染成红色或淡红色，易被酒精 脱色，有较弱的革兰氏染色反应 。
染色结果的分析与解读
根据染色结果判断细菌的种类和特性，有助于临床诊断和 治疗。
通过观察染色后细菌的形态和排列，可以初步判断细菌的 致病性。
重要性
革兰氏染色法对于临床医学、生物技术和食品工业等领域具有重要意义，能够 帮助科学家和医生快速准确地鉴别不同类型的细菌，从而采取相应的治疗和预 防措施。
发展历程与背景
发展历程
革兰氏染色法由丹麦细菌学家汉斯·克里斯蒂安·革兰于1884 年发明，至今已有百余年历史。随着科学技术的不断进步， 该方法在操作流程和染料选择等方面不断得到优化和改进。
革兰氏染色课件PPT
复染
复染：将脱色后的涂片用复染液进行复染处理，以便更好地观察菌体或组织的形态和结构。
复染时应注意控制复染时间，避免过长或过短，以免影响染色效果。
冲洗和干燥
冲洗
将染色和脱色处理后的涂片用清 水冲洗干净，以便观察菌体或组 织的染色效果。
干燥
将冲洗干净的涂片放在干净的纸 巾上自然干燥，以便后续观察。
Part
固定时应注意控制火焰温度，避免过高或过低，以免影响 染色效果。
染色
染色：将涂片浸入革兰氏染色液中， 染色一定时间后取出晾干。
染色时应注意控制染色时间，避免过 长或过短，以免影响染色效果。
脱色
脱色：将染色后的涂片用脱色液进行脱色处理，以去除菌体或组织表面的色素。
脱色时应注意控制脱色时间，避免过长或过短，以免影响染色效果。
复染与初次染色要匹配
复染的颜色要与初次染色相匹配，以 便更好地观察染色效果。
其他注意事项
染色液要新鲜
染色液使用前要确保新鲜，过期 或变质的染色液会影响染色效果
。
避免交叉污染
在染色过程中要避免不同染色液之 间的交叉污染，以免影响染色结果 。
注意安全
染色过程中要注意安全，避免染色 液溅到皮肤或眼睛上，如不慎溅到 应立即用大量清水冲洗并及时就医 。
革兰氏染色还可以用于研究细菌的生 物学特性和分类学研究，有助于深入 了解细菌的生态学和进化关系。
Part
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革兰氏染色的操作步骤
涂片
涂片：将待染色的菌体或组织薄而均匀地涂在洁净的玻片上，然后晾干或烘干， 以便后续染色。
涂片时应注意避免涂层过厚，以免影响染色效果。
固定
固定：将涂片在火焰上快速通过两次，使菌体或组织固定 在玻片上，以便后续染色。
实验二细菌革兰氏染色ppt课件
五、思考题
1、讲述革兰氏染色的原理并指出E.C和B.S分别属于革兰 氏阳性或阴性？
2、观察细菌为什么要染色？为什么细菌染色多采用碱性 染料？
3、做革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？革兰氏染色 成败的关键一步是什么？
crystal violet stain
wash with water
Counterstain wi在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀， 固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
（2）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱 色
时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不足， 革
占细胞壁干重的%
革兰氏阳性细菌
革兰氏阴性细菌
含量很高（50~90）
含量很低（~10）
含量较高（＜50）
无
一般无（＜2）
含量较高（~20）
无
含量较高
三、实验材料
1、菌种：大肠杆菌（E.C）、枯草杆菌（B.S） 2、染料：结晶紫、复红、碘液等 3、材料：95%酒精等
Heat fixing
Staining
实验二 细菌革兰氏染色
一、实验目的
学习微生物制片、染色的基本技术 掌握细菌革兰氏染色及无菌操作技术 进一步观察细菌的基本形态
二、实验原理
C.Gram（革兰）于1884年 发明的一种鉴别不同类型 细菌的染色方法。
革兰氏染色
1、用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染
2、用碘溶液进行媒染，其作用是提高染料和细 胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。
4、当对未知菌进行革兰氏染色时，怎样能证明你的染色 技术和结果的正确性？
革兰氏染色实验步骤
革兰氏染色【2 】一．试验流程：1. 取载玻片用纱布擦干,载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致肯定菌液滴的地位）.涂菌的部位在火焰上烤一下,除去油脂.2. 涂片：液体造就基：左手持菌液试管,在酒精灯火焰邻近5cm阁下打开管盖;右手持接种环在火焰中烧灼灭菌,等冷却后从试管中沾取菌液一环,在干净无脂的载玻片上涂直径2mm 阁下的涂膜,最后将接种环在火焰上烧灼灭菌.固体造就基：先在载玻片上滴一滴无菌水,再用接种环取少量菌体,涂在载玻片上,使其薄而平均.3. 晾干：让涂片在空气中天然湿润.4. 固定：让菌膜朝上,经由过程分焰2-3次固定（以不烫手为宜）.5. 染色：将固定过的涂片放报纸上,滴加草酸铵结晶紫液,染1min.6. 水洗：用水迟缓冲洗涂片上的染色液,用吸水纸吸干.简略染色停止可不雅察细胞形态.7. 媒染：滴加1滴碘液,染1min,水洗.8. 脱色：吸去残留水,持续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色,立刻水洗.9. 复染：滴加蕃红复染3-5min,水洗.至此,革兰氏染色停止.二．染色成果：革兰氏阳性菌都呈紫色,革兰氏阴性菌都呈红色.备注：1.革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主如果金黄色葡萄球菌.表皮葡萄球菌等）.链球菌属（肺炎链球菌.草绿色链球菌.肠球菌等）.白喉杆菌.炭疽杆菌.破感冒杆菌.蜡样芽孢杆菌等,个中,金黄色葡萄球菌.肠球菌等为临床重要等病原菌.2.革兰氏阴性菌：埃希氏菌属.枸橼酸菌属.假单胞菌属（绿脓杆菌等）.莫拉菌属（卡他莫拉菌等）.奈瑟菌属（淋球菌.脑膜炎双球菌等）.不动杆菌属（鲍曼不动杆菌.罗菲不动杆菌等）.克雷伯菌属（主如果肺炎克雷伯杆菌）.沙门氏菌属.志贺氏菌属（痢疾杆菌等）.黄杆菌属.变形杆菌属.军团菌属.耶尔森菌属.嗜血杆菌属（杜克雷嗜血杆菌.流感嗜血杆菌等）.产气杆菌属.霍乱弧菌.暗沟肠杆菌等.。
革兰氏染色法课件
染色原理
革兰氏染色法的染色原理主要 基于细菌细胞壁的结构差异。
革兰氏阳性菌的细胞壁主要由 肽聚糖构成，结晶紫和碘液可 以穿透细胞壁，使其被染成紫 色或红色。
而革兰氏阴性菌的细胞壁外层 含有脂质，阻碍了结晶紫和碘 液的穿透，因此被染成淡色或 无色。
染色方法
革兰氏染色法通常包括涂片、结 晶紫初染、碘液媒染、酒精脱色 、番红复染和油镜观察等步骤。
02
革兰氏染色法的应用
在细菌分类中的应用
细菌分类
革兰氏染色法是细菌分类的重要手段之一，通过染色结果的不同可以将细菌分 为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，有助于细菌的准确鉴定和分类。
细菌鉴别
革兰氏染色法可以用于鉴别不同种类的细菌，例如肠道细菌、葡萄球菌、脑膜 炎奈瑟氏菌等，为临床诊断和治疗提供依据。
固定
将涂片在酒精灯上加热，使细菌或 真菌固定在载玻片上。
染色
将涂片浸入革兰氏染色液中，染色 1-2分钟。
实验步骤
01
02
03
04
脱色
用酒精棉擦拭涂片，去除染色 液。
复染
再次用酒精棉擦拭涂片，然后 浸入另一种染色液中，染色1
分钟。
冲洗
用清水冲洗涂片，去除染色液 和其他杂质。
干燥
用吸水纸吸干涂片上的水分， 然后自然晾干。
革兰氏染色法课件
目 录
• 革兰氏染色法简介 • 革兰氏染色法的应用 • 革兰氏染色法的优缺点 • 革兰氏染色法的改进与发展 • 革兰氏染色法实验操作流程
01
革兰氏染色法简介
定义与历史
01
革兰氏染色法是一种用于鉴别细 菌的染色技术，由丹麦医生汉斯· 克里斯蒂安·革兰于1884年发明。
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革兰氏染色 ppt课件
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2.5固定的目的 ① 杀死微生物，固定其细胞结 构； ② 保证菌体能牢固地粘附在载 玻片上，以免水洗时被水冲掉； ③ 改变菌体对染料的通透性， 一般死细胞原生质容易着色。
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2.6实验现象：
染色后菌体呈蓝紫色的，称为“革兰阳 性菌”；菌体是伊红色，称“革兰阴性 菌”。无论阳性菌还是阴性菌，都有杆 菌和球菌。葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿 假单胞菌是临床最为常见的病原菌。葡 萄球菌属于革兰阳性菌，大肠杆菌属于 革兰阴性菌。除大肠杆菌以外，临床较 常见的肠杆菌科细菌还有变形杆菌属， 沙门菌属、克霉白菌属；铜绿假单胞菌 是临床常见的较耐药革兰阴性杆菌。
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细菌结构模式图
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2.7实验原理：
① G+细菌的细胞壁
G+细菌细胞壁具有较厚（20-80nm）而致密的肽聚糖层， 多达20层，占细胞壁成分的60%～90%，它同细胞膜的外层 紧密相连 ；有的G+细菌细胞壁中含有磷壁酸。细胞生长中 有自溶素（酶类）起作用，磷壁酸对自溶素有调节功能， 阻止胞壁过度降解和壁溶。如果细胞壁的肽聚糖层被消溶， G+细胞成为原生质体（protoplasts），细胞壁不复存在， 而只存留细胞膜。除链球菌外，大多数G+细菌细胞壁中含 极少蛋白质。
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革兰氏染色实验步骤
革兰氏染色
一．实验流程：
1、取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。
涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。
2、涂片：
液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。
固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。
3、晾干：让涂片在空气中自然干燥。
4、固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。
5、染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。
6、水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。
简单染色结束可观察细胞形态。
7、媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。
8、脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。
9、复染：滴加蕃红复染3-5min，水洗。
至此，革兰氏染色结束。
二．染色结果：革兰氏阳性菌都呈紫色，革兰氏阴性菌都呈红色。
备注：
1.革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）、链球菌属（肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等）、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽孢杆菌等，其中，金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要等病原菌。
2.革兰氏阴性菌：埃希氏菌属、枸橼酸菌属、假单胞菌属（绿脓杆菌等）、莫拉菌属（卡他莫拉菌等）、奈瑟菌属（淋球菌、脑膜炎双球菌等）、不动杆菌属（鲍曼不动杆菌、罗菲不动杆菌等）、克雷伯菌属（主要是肺炎克雷伯杆菌）、沙门氏菌属、志贺氏菌属（痢疾杆菌等）、黄杆菌属、变形杆菌属、军团菌属、耶尔森菌属、嗜血杆菌属（杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等）、产气杆菌属、霍乱弧菌、阴沟肠杆菌等。