水稻转化方法
水稻 花粉管通道法
水稻花粉管通道法摘要水稻花粉管通道法是一种高效、实用的遗传转化方法，广泛应用于水稻遗传改良。
本文介绍了水稻花粉管通道法的原理、技术流程、优缺点以及应用前景，以期为相关研究提供参考。
一、引言水稻是全球重要的粮食作物之一，对人类生活和经济发展具有重要意义。
为了提高水稻产量和品质，科学家们不断探索新的遗传改良方法。
其中，花粉管通道法是一种具有广泛应用前景的遗传转化方法。
二、原理花粉管通道法的基本原理是利用植物的花粉管通道，将外源基因导入植物受精卵中，实现基因的转移和表达。
在花粉与卵细胞结合形成受精卵的过程中，花粉管会穿过卵细胞壁，与卵细胞融合。
此时，外源基因可以通过花粉管通道进入受精卵，并随受精卵的发育而表达。
三、技术流程1. 基因构建：首先，将目标基因与合适的载体连接，构建成表达载体。
2. 载体转化：将构建好的表达载体导入植物细胞或原生质体中，获得转基因细胞或原生质体。
3. 细胞培养：将转基因细胞或原生质体进行培养，筛选出转化成功的细胞或原生质体。
4. 植株再生：将转化成功的细胞或原生质体培养成植株，并进行表型鉴定和分子检测。
5. 遗传稳定性检测：对转基因植株进行多代繁殖，检测其遗传稳定性。
四、优缺点1. 优点：花粉管通道法具有操作简便、转化效率高、适用范围广等优点。
此外，该方法不需要组织培养和病毒载体等辅助手段，降低了实验成本和操作难度。
2. 缺点：花粉管通道法也存在一些缺点，如转化过程中可能存在基因沉默现象、转化植株的遗传稳定性有待进一步验证等。
此外，该方法对环境可能产生一定影响，需要加强安全性和可持续性方面的研究。
五、应用前景随着基因编辑技术的发展和应用，花粉管通道法在基因功能验证、新品种培育等方面具有广阔的应用前景。
未来，科学家们可以进一步优化花粉管通道法技术流程，提高转化效率和安全性，为水稻遗传改良提供更加高效、实用的方法。
同时，随着人们对食品安全和环境保护意识的提高，对转基因作物的监管和审批也将更加严格。
水稻的遗传转化
水稻的遗传转化1）种子消毒：用75%乙醇浸泡去皮的水稻种子1min（剧烈摇动），再用2.5%的次氯酸钠分别处理两次，每次15min，然后用无菌水冲洗3-5次后均匀铺于诱导培养基上，不宜过多，一个培养皿大概14-20粒。
2）水稻愈伤组织的诱导和继代培养：消毒好的成熟种子在诱导培养基上28℃暗培养25-28天。
待愈伤组织长至合适大小，在培养基中来回剧烈摇动几次，使一些小块愈伤从大的组织块上脱离，从中挑选光滑、淡黄色、较硬、大小在2-3mm的胚性愈伤，均匀铺放在继代愈伤培养基上，28℃避光培养7-8天，即可用于农杆菌转化。
3）农杆菌介导的水稻愈伤组织转化及共培养：刮取已活化3天的农杆菌，放入液体共培养培养基中，用力打散，置摇床摇培0.5-2h，使得菌液的OD600在0.1-0.15（0.125最宜）之间。
将挑选的愈伤组织小粒放入已加农杆菌的液体培养基中，轻轻摇动几次，放置15-20min。
倒去菌液，用无菌滤纸吸干均匀的铺在已加滤纸的共培养基中。
愈伤在共培养培养基中22℃条件下暗培养3天。
4）转化愈伤组织的选择培养：共培养后的愈伤先用灭菌水洗涤三次，后用含头孢500mg/L的灭菌水浸泡30min，期间轻轻摇动，之后用滤纸吸干，均匀铺放在选择培养基上，28℃暗培养10天，之后进行第二次筛选，挑选淡黄色、生长状态良好的愈伤，均匀铺放在含潮霉素和头孢的选择培养基中，28℃暗培养15天。
5）愈伤组织的分化培养：挑选黄色、圆形的愈伤组织，均匀铺放在预分化培养基上，28℃暗培养7天。
之后挑选生长状态良好、淡黄色的胚性愈伤，放入分化培养基上，28℃光照培养30-60天左右，直至转基因小苗长出。
中间每隔25天左右将愈伤转移到新鲜的分化培养基上。
6）水稻的壮苗培养与移栽：将长出的小苗去掉周围的愈伤，在无菌条件下转移到1/2MS的壮苗培养基中，使根部浅插入培养基中，28℃光照培养（14h光/10h暗）。
当苗长至瓶口、约10cm以上时，打开瓶口所覆塑料膜，瓶内加入约1/3 的水，使苗暴露于空中炼化培养。
转基因水稻的原理
转基因水稻的原理
转基因水稻的原理是通过将具有特定基因的外源DNA导入到水稻细胞中，并使其正常表达，在水稻中产生所需的特定性状。
转基因水稻的原理主要包括以下几个步骤：
1. 基因选择：选择具有所需特性的基因，这些基因可以来自同一物种或其他物种。
例如，选择具有抗虫性、抗草木得、耐盐碱等性状的基因。
2. 基因克隆：将选定的基因从其原始来源中克隆出来，通常使用PCR等分子生物学技术来扩增目标基因序列。
3. 插入载体：将目标基因插入携带基因转移所需的DNA片段的载体中。
常用的载体是冠状病毒、细菌或酵母等。
4. 基因转移：将插入载体的基因导入到水稻细胞中。
目前常用的方法有农杆菌介导转化和基因枪转化等。
转化过程中，目标基因被导入水稻细胞的染色体中。
5. 基因整合和表达：插入的基因在水稻细胞中整合到染色体上，并在细胞的遗传物质DNA中被正常复制和遗传。
转基因水稻的这些细胞和后代可以继续表达改良后的特性。
6. 选育和鉴定：基于获得的转基因水稻植株，进行纯系选育和鉴定，确保其稳
定性和所需特性的遗传传递。
通过这些步骤，转基因水稻可以获得具有所需特性的水稻品种，以提高水稻的抗病虫害、抗逆性、增加产量等特性，进而提高农作物的生产效益。
水稻遗传转化体系Protocol
水稻遗传转化体系ProtocolIntroduction1．水稻的遗传转化研究历史与现状20 世纪80年代末, 水稻的遗传转化首获成功。
1988 年, 3 个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用“电击法”或“PEG 介导法”等方法将外源3]。
1991 年, 基因枪转化的方法在水稻中基因导入到水稻中并获得再生植株[1~获得成功[4],随后成为水稻遗传转化的常用方法之一。
1993 年，Chan 等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。
Hiei 等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体, 建立了农杆菌介导的粳稻高效转化体系, 使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常用的方法。
此后, 粳稻的转化方法被进一步优化, 使粳稻的遗传转化周期大幅缩短[7]。
虽然Hiei等[6]建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻的转化不再困难, 但是许多籼稻的转化依然存在障碍, 主要是转化效率低下。
因此, 一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化, 使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。
最近, Hiei 和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据他们的结果, 采用幼胚作为外植体, 籼13 个稻的转化可以在两个半月内完成，且转化效率非常高(一个幼胚可以得到5~独立的转化植株)。
2. 转基因技术在水稻上的研究与应用[11]a. 转基因抗虫水稻对于水稻最主要的害虫——螟虫(二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等)在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源. 目前,最有希望和前途的方法就是利用转基因技术把外源抗虫基因引入水稻中创造出新的抗虫品种。
虽然水稻中已经发现和鉴定了19 个抗褐飞虱的基因[12], 但是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异, 抗性品种往往推广数年后就会失去抗性。
b. 转基因抗病水稻见抗水稻病毒研究c. 转基因抗旱水稻d. 转基因营养高效利用水稻e. 转基因优质水稻f. 转基因高产水稻g. 转基因抗除草剂水稻3.转基因技术在水稻抗病毒基因工程上的应用随着RNA干扰技术（包括siRNA和miRNA介导的RNA干扰）在抗病毒18 ]，结合RNA干扰技术和水稻遗传转化技术基因工程上的广泛研究和应用[13~来研究水稻，获得对水稻病毒高抗的品系越来越受研究人员的重视，成为国内外水稻病毒研究的热点。
水稻遗传转化步骤
实验流程：种子灭菌（ms+, 28天，暗培养，28℃）---愈伤继代（ ms,7天，28℃自然光照）--转化共培养（co,暗培养3天，上面放一层滤纸19℃，很重要！）---第一次选择（S500，暗培养15天，28℃）---第二次选择（S500，暗培养15天，28℃）---第三次选择（选抗性愈伤，S250，暗培养7天，28℃）---预分化（m,暗培养8天，28℃）---第一次分化（f,先暗培养2天，28℃，后光照13天）---第二次分化（ f，光照15天）---壮苗（1/2，光照，时间不定）种子灭菌：（1）用75%酒精泡5分钟，倒出酒精，加2.5%次氯酸钠摇10分钟以上（2）倒出次氯酸钠，再加2.5%次氯酸钠15-20分钟，猛烈摇动，在超净台上倒去次氯酸钠，用灭菌水洗10次以上，然后放于滤纸上吸干，接种于ms+培养基。
共培养处理：种子愈伤处理28天左右，挑优质愈伤继代培养一次，挑颗粒用农杆菌浸泡15分钟，共培养三天后，挑无褐色愈伤颗粒，用灭菌水洗三次，放入NBL中，摇床摇2小时（200rpm），滤纸吸干后放入筛选培养基S中。
培养基配制；接种培养基（ms+）MS大量，微量，有机，2，4-D（2mg/L）Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l, 脯氨酸2.8g/l, 水解酪蛋白0.3g/l, phytagel3g/l接种继代培养基（ms）MS大量，微量，有机，2，4-D（1mg/L）Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l，Phytagel 3g/l共培养培养基（co，pH5.3）N6大量，B5微量，B5有机，2，4-D（1mg/L）Fe-EDTA，硝酸银1ml/l，肌醇（0.1g/l），蔗糖30g/l，葡萄糖10g/l，phytagel（3g/l），灭菌后加AS20mg/lNBL：就是co加上头孢500mg/l，不加AS选择培养基S500N6大量，B5微量，B5有机，2，4-D（1mg/L）Fe-EDTA，硝酸银1ml/l，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l, 脯氨酸0.5g/l, 水解酪蛋白0.3g/l, phytagel3g/l灭菌后加头孢500mg/l，潮霉素50mg/l抗性愈伤继代培养基（S250）N6大量，B5微量，B5有机，2，4-D（1mg/L）Fe-EDTA，硝酸银1ml/l，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l, 脯氨酸0.5g/l, 水解酪蛋白0.3g/l, phytagel3g/l灭菌后加头孢250mg/l，潮霉素50mg/l成熟培养基（m）N6大量，B5微量，B5有机，NAA1mg/l，Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l, 脯氨酸0.5g/l, 水解酪蛋白0.3g/l, phytagel3g/l灭菌后加头孢250mg/l，潮霉素50mg/l，ABA3mg/l，BA2mg/l分化培养基（f）N6大量，B5微量，B5有机，NAA0.5mg/l, Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l,水解酪蛋白0.3g/l, phytagel4.6g/l灭菌后加BA3mg/l壮苗培养基（1/2）MS大量，微量，有机，Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l，Agar5.8g/l 注：2，4-D浓度为2mg/l，溶于0.1NNaOH或酒精硝酸银浓度为0.85mg/ml，避光保存。
水稻基因遗传转化方法研究进展
华南农业大学学报 Journal of South China Agricultural University 2023, 44(6): 843-853DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202307001郭涛, 沈任佳, 王加峰. 水稻基因遗传转化方法研究进展[J]. 华南农业大学学报, 2023, 44(6): 843-853.GUO Tao, SHEN Renjia, WANG Jiafeng. Research progress on genetic transformation methods of rice[J]. Journal of South China Agricultural University, 2023, 44(6): 843-853.特约综述水稻基因遗传转化方法研究进展郭 涛 ，沈任佳，王加峰(华南农业大学 农学院/国家植物航天育种工程技术研究中心, 广东 广州 510642)摘要: 介绍水稻遗传转化方法的发展历程和科研成果，为水稻遗传转化体系的研究和应用提供借鉴。
从生物介导转化法和非生物介导转化法2类方法出发，介绍各种转化方法在水稻上的首次报道和重要进展并进行了展望。
生物介导转化法中，农杆菌Agrobacterium介导转化法通过侵染种胚、稻穗、愈伤组织和茎尖进行转化，种胚及其诱导的愈伤组织作为材料的转化体系较为成熟，稻穗和茎尖转化法则操作简便、转化再生周期短；此外，有研究尝试用根瘤菌Sinorhizobium和Rhizobium以及附着剑菌Ensifer adhaerens转化水稻。
非生物介导转化法中，物理方法转化法(基因枪法、电击法、花粉管通道法和显微注射法)是较为传统的转化方法，基因枪法应用较为成熟，花粉管通道法则取得较多育种成果；介质介导转化法中，纳米材料的应用正逐步成为研究热点。
水稻遗传转化体系的发展可从转化材料的筛选和优化介导转化的载体入手，同时将转化体系和DNA-free、单倍体诱导等技术结合起来，以提高转化效率和安全性，缩短转化再生周期。
水稻遗传转化实验报告
一、实验目的本实验旨在探究农杆菌介导法在水稻遗传转化中的应用效果，通过构建基因表达载体，将目的基因导入水稻细胞中，从而实现基因功能的验证和水稻性状的改良。
二、实验材料1. 实验材料：水稻品种为南桂占，农杆菌菌株为Agrobacterium tumefaciens EHA105，目的基因（GFP基因）载体为pBI121。
2. 试剂：农杆菌转化培养基、抗生素、潮霉素、DNA提取试剂盒、PCR试剂盒等。
3. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、显微镜等。
三、实验方法1. 目的基因的克隆：将GFP基因从质粒载体pBI121中切出，插入到农杆菌载体pBin19中，构建重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌的活化：将农杆菌菌株EHA105接种于YEB培养基中，在28℃条件下培养过夜。
3. 农杆菌转化：将活化后的农杆菌与重组载体pBin19-GFP混合，用涂布法将混合液涂布于农杆菌转化培养基上，28℃条件下培养2-3天。
4. 水稻叶片的消毒：将水稻叶片用70%酒精浸泡30秒，再用无菌水冲洗3次，然后用无菌滤纸吸干水分。
5. 农杆菌侵染：将农杆菌转化菌液滴加到水稻叶片上，用无菌滤纸轻轻擦拭叶片，使农杆菌均匀分布在叶片表面。
6. 愈伤组织诱导：将侵染后的水稻叶片放入农杆菌转化培养基中，28℃条件下培养5-7天，诱导愈伤组织形成。
7. 抗性筛选：将愈伤组织转入含有潮霉素的筛选培养基中，28℃条件下培养3-4周，筛选出转化成功的愈伤组织。
8. 转化植株再生：将筛选出的转化愈伤组织转入再生培养基中，28℃条件下培养2-3周，诱导再生植株。
9. 抗性鉴定：将再生植株种植于田间，对植株进行潮霉素筛选，筛选出抗潮霉素植株。
10. PCR检测：对筛选出的抗潮霉素植株进行PCR检测，验证GFP基因是否成功导入水稻基因组。
四、实验结果1. 目的基因的克隆：成功构建了重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌转化：农杆菌转化效率较高，大部分叶片出现愈伤组织。
水稻遗传转化体系Protocol
水稻遗传转化体系ProtocolIntroduction1．水稻的遗传转化研究历史与现状20 世纪80年代末, 水稻的遗传转化首获成功。
1988 年, 3 个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用“电击法”或“PEG 介导法”等方法将外源3]。
1991 年, 基因枪转化的方法在水稻中基因导入到水稻中并获得再生植株[1~获得成功[4],随后成为水稻遗传转化的常用方法之一。
1993 年，Chan 等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。
Hiei 等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体, 建立了农杆菌介导的粳稻高效转化体系, 使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常用的方法。
此后, 粳稻的转化方法被进一步优化, 使粳稻的遗传转化周期大幅缩短[7]。
虽然Hiei等[6]建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻的转化不再困难, 但是许多籼稻的转化依然存在障碍, 主要是转化效率低下。
因此, 一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化, 使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。
最近, Hiei 和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据他们的结果, 采用幼胚作为外植体, 籼13 个稻的转化可以在两个半月内完成，且转化效率非常高(一个幼胚可以得到5~独立的转化植株)。
2. 转基因技术在水稻上的研究与应用[11]a. 转基因抗虫水稻对于水稻最主要的害虫——螟虫(二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等)在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源. 目前,最有希望和前途的方法就是利用转基因技术把外源抗虫基因引入水稻中创造出新的抗虫品种。
虽然水稻中已经发现和鉴定了19 个抗褐飞虱的基因[12], 但是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异, 抗性品种往往推广数年后就会失去抗性。
b. 转基因抗病水稻见抗水稻病毒研究c. 转基因抗旱水稻d. 转基因营养高效利用水稻e. 转基因优质水稻f. 转基因高产水稻g. 转基因抗除草剂水稻3.转基因技术在水稻抗病毒基因工程上的应用随着RNA干扰技术（包括siRNA和miRNA介导的RNA干扰）在抗病毒18 ]，结合RNA干扰技术和水稻遗传转化技术基因工程上的广泛研究和应用[13~来研究水稻，获得对水稻病毒高抗的品系越来越受研究人员的重视，成为国内外水稻病毒研究的热点。
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水稻转化方法
1．愈伤组织的诱导
选取成熟良好、饱满、无霉变的籼稻种子，用糙米机或人工方法去掉种子的内外粰，保留胚的完整性。
先用75%酒精消毒1 min，再浸泡于40% NaClO+0.1% Tween 20 溶液，并置于100 rpm的摇床上消毒30 min。
在超净工作台上，消毒后的去粰种子用无菌水洗涤5次以上，洗净后转移至装有无菌吸水纸的培养皿中吸干水分，再将去粰种子接种于诱导培养基中。
培养条件为32℃，持续光照（100 mole m-2 s-1）。
30天后即可得到较好的愈伤组织用于转化。
2．农杆菌的准备
农杆菌选用水稻转化中常用的菌株Ag10。
将含有目的基因的表达载体通过电激转化法转入农杆菌Ag10，选取阳性菌株，再将阳性菌株划线于含合适抗生素的YEB固体平板培养基中，于28 ℃暗培养3天。
3天后，用接种针挑取米粒大小的农杆菌震荡悬浮于装有100 mL AA 浸染培养基的150 mL灭菌三角瓶中，以此作为愈伤组织的农杆菌浸染液。
特别值得注意的是，农杆菌应充分分散，而且浓度不能太大（OD600=0.1），否则后续的脱菌效果不好。
3．愈伤组织和农杆菌的共培养
挑取诱导30天并且生长良好的愈伤组织（长出的水稻芽与种子去掉）浸泡于装有100 mL 农杆菌浸染液的150 mL灭菌三角瓶中（在加入愈伤前，先加入150ml的AS,使AA液中AS的浓度为30mg/L），摇动5min。
同时，在共培养基平板上预先垫1张无菌滤纸，用1 mL 的AAM浸染培养基打湿，并除去气泡。
然后将浸染5 min后的愈伤组织用无菌滤纸吸干，置于垫了滤纸的共培养基上于25℃黑暗培养3天。
4．农杆菌的洗脱
将共培养3天后的愈伤组织置于250 mL锥形瓶中，先用无菌水洗涤4-5次，直至洗液清澈透明为止。
加入过滤灭菌的400 mg/L羧苄青霉素溶液适量，于摇床上100 rpm 震荡洗涤25 min。
然后倒掉洗液，继续用羧苄青霉素溶液洗愈伤3-5次，再加入适量羧苄青霉素溶液，于摇床上100 rpm 震荡洗涤25 min，然后倒掉洗液，继续用羧苄青霉素溶液洗愈伤3-5次，最后用无菌滤纸将愈伤组织吸干。
5．抗性愈伤组织的筛选
首先将农杆菌洗脱后的愈伤组织置于筛选剂浓度为100mg/L的
G418或50mg/L的HPT筛选培养基上, 于32℃和持续光照条件下筛
选培养30天左右，将新长的愈伤继代一次。
6．抗性愈伤组织的分化
将筛选2中新长质量较好的愈伤组织转移至分化培养基上，于32℃和持续光照条件下进行分化培养20天左右，即可得到再生植株。
7．再生植株的生根
将再生植株移栽于不添加筛选剂的生根培养基中，于32℃和持续光照条件下进行生根培养10天左右。
8．炼苗和移栽
将根生长良好的再生苗减掉苗的少部分,加入蒸馏水炼苗5天左右,洗去培养基，然后移栽于大田中。
附表说明
表1 培养基种类及成分
培养基种类成分
诱导培养基NB无机盐和有机物+水解酪蛋白0.6 g/L+脯氨酸
2.787 g/L+谷氨酰胺0.5 g/L +蔗糖30.0 g/L+植物
凝激素4.2 g/L+2,4-D 3.0 mg/L，pH5.8
AAM浸染培养
基AA无机盐+MS有机物+水解酪蛋白0.5 g/L+天冬酰胺0.3 g/L+谷氨酰胺0.9 g/L +精氨酸0.2 g/L+蔗糖68.5 g/L+葡萄糖36.0 g/L，pH5.2; 使用前加入AS 30mg/L。
共培养基NB无机盐和有机物+水解酪蛋白0.3 g/L +蔗糖30.0 g/L+葡萄糖10.0 g/L+植物凝激素4.2 g/L+2,4-D
2.0 mg/L，pH5.2；灭菌后加入AS 30mg/L。
筛选培养基NB无机盐和有机物+水解酪蛋白0.6 g/L+脯氨酸
2.787 g/L +蔗糖30.0 g/L+ +植物凝激素 4.2
g/L+2,4-D 3.0 mg/L，pH5.8；灭菌后加入羧苄青霉
素400 mg/L+潮霉素50 mg/L或G418 100 mg/L。
分化培养基MS无机盐和有机物+水解酪蛋白2.0 g/L +脯氨酸
0.3g/L+蔗糖30.0 g/L +山梨醇30.0 g/L+植物凝激
素4.2 g/L+NAA 0.2 mg/L+KT 2.0 mg/L，pH5.8；灭
菌后加入羧苄青霉素200 mg/L。
生根培养基MS无机盐和有机物+水解酪蛋白1.0 g/L +蔗糖30.0 g/L +植物凝激素4.2 g/L+NAA 0.2 mg/L，pH5.8
一．
NB+Cb(羧苄200mg/ml) 500ml培养基加1ml 使其终浓度达到400mg/L
HYg(潮霉素 50mg/ml) 500ml培养基加500ul 使其终浓度达到50mg/L
G418(100mg/ml) 500mL培养基加500ul 使其终浓度达到100mg/L
kana600ul/l(分化) 生根培养基与诱导的浓度一样。