TAK1通过调控p38 MAPK信号通路影响肾小管上皮细胞纤维化
辛伐他汀经ERK1-2、p38MAPK信号通路影响MC3T3-E1细胞增殖的研究
辛伐他汀经ERK1-2、p38MAPK信号通路影响MC3T3-E1细胞增殖的研究近年来，心血管疾病一直是危及人类健康的重大疾病之一。
高胆固醇水平在心血管疾病的发展中扮演着重要角色，因此降低胆固醇水平成为预防和治疗这些疾病的一个重要策略。
辛伐他汀作为一种热门的降胆固醇药物，已经广泛应用于临床。
然而，近年来研究发现辛伐他汀可能通过多种途径对骨骼进行不良影响。
辛伐他汀是一种可被肝脏代谢的他汀类药物，通过抑制凝血酶原转化酶HMG-CoA还原酶，降低胆固醇合成。
通过这一机制，辛伐他汀可以降低血液中的胆固醇水平，起到预防心血管疾病的作用。
然而，最近的研究显示辛伐他汀可能通过ERK1/2和p38MAPK信号通路对骨骼的细胞增殖产生不良影响。
MC3T3-E1是一种骨骼细胞株，常常被用于研究骨骼细胞的功能和生理过程。
因此，本研究旨在探究辛伐他汀对MC3T3-E1细胞增殖的影响，并进一步阐明其作用机制。
首先，本研究采用MTT法和克隆形成实验测定辛伐他汀对MC3T3-E1细胞增殖的影响。
实验结果显示，在一定浓度范围内，辛伐他汀可以显著抑制MC3T3-E1细胞的增殖。
此外，通过Western blot分析发现，辛伐他汀处理后，MC3T3-E1细胞中ERK1/2和p38MAPK的磷酸化水平显著下降。
进一步研究发现，在添加ERK1/2和p38MAPK的活化剂后，辛伐他汀对MC3T3-E1细胞的增殖抑制作用显著减弱。
这表明，ERK1/2和p38MAPK信号通路在辛伐他汀抑制MC3T3-E1细胞增殖中发挥了重要作用。
为了更好地阐明这一观察结果，我们还使用了特定的抑制剂来抑制ERK1/2和p38MAPK的活化。
结果显示，当ERK1/2和p38MAPK的活化被抑制时，辛伐他汀对MC3T3-E1细胞增殖的抑制作用显著增强。
总的来说，本研究结果表明辛伐他汀通过抑制ERK1/2和p38MAPK信号通路抑制了MC3T3-E1细胞的增殖。
这一发现揭示了辛伐他汀对骨骼的潜在不良影响，进一步提醒临床医生在使用辛伐他汀时要警惕其潜在的骨骼副作用。
p38_MAPK特异性抑制剂SB_239063
垦丛堡芏堕咝墨堑丛塑！！坚至；旦蔓型鲞墨！塑！！！ｔ曼！！Ｐ生！！！里！！！，鲤些型；！ｉ，！业！！！！，ｙ！！！！！型！！ｐ３８ＭＡＰＫ特异性抑制剂ＳＢ２３９０６３吕小琴综述唐法娣审棱【摘要】ｐ３８ＭＡＰＫ是细胞内的重要信号传递者．主要对炎性细胞因于和多种类型的细胞应激信号进行传导。
ＳＢ２３９０６３是ｐ３８ＭＡＰＫ特异性抑制剂，能与之结合并抑制其对转录因子或下游蛋白酶的进一步活化，减少致炎细胞因子的产生，抑制气道嗜酸粒细胞和中性粒细胞的提润、聚集和活化，因而对哮喘和ＣＯＰＤ等气道慢性炎症有治疗作用。
【关键词】ｐ３８ＭＡＰＫ；支气管哮喘；慢性阻塞性肺疾病盼６ＡＳＢ２３９０６３是第二代ｐ３８ＭＡＰＫ抑制剂，它与ｐ３８ａ和ｐ３８口有高亲和力。
因此，能与ｐ３８丝裂素活化蛋白激酶（ｍｏｔｉｇｅｎ－ａｅｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ＭＡＰＫ）结合并抑制其活性，从而减少和阻断多种炎症介质，如ＴＮＦａ、ＩＬ一１、ＩＬ一６、ＩＬ一８等的产生，抑制炎症细胞的聚集或活化。
虽然目前对ＳＢ２３９０６３的研究仍多处于实验室研究阶段，但ＳＢ２３９０６３对支气管哮喘（哮喘）和慢性阻塞性肺疾病（ｃＯＰＤ）等气道慢性炎症的潜在的治疗作用不容忽视。
１ｐ３８ＭＡＰＫ抑制剂的分子机制ＭＡＰＫ超家族广泛分布于细胞浆内，具有丝氨酸和苏氨酸双重磷酸化能力，是细胞内的重要信号传递者，参与多种生理功能的调节。
该家族信息传递的共同特征是：细胞受到刺激后通过某种中间环节激活ＭＡＰＫＫＫ。
再进一步激活ＭＡＰＫＫ，然后通过双位点磷酸化调控ＭＡＰＫ的活性。
该超家族包括四个亚家族，即ＥＲＫｌ／２，ＪＮＫ／ＳＡＰＫ，ＢＭＫｌ／ＥＲＫ５和ｐ３８ＭＡＰＫ。
其中，ＥＲＫ途径主要对细胞的生长、分裂利分化信号进行传导；ＪＮＫ／ＳＡＰＫ和ｐ３８ＭＡＰＫ途径相似，主要对炎性细胞因子和多种类型的细胞应激信号进行传导。
ｐ３８ＭＡＰＫ在体内分布广泛，具有４个亚型：ｐ３８ｎ、ｐ３８１３、ｐ３８７、ｐ３８８。
p38 MAPK通路在造血系统调节中的作用
p38 MAPK通路在造血系统调节中的作用李德冠;樊飞跃;孟爱民【摘要】Mitogen-activated protein kinase( MAPK ) superfamily is an important signal mediating many cellular reactions. The subfamily p38 MAPK plays an important role in the regulation of hematopoietic system. Inhibition of p38 MAPK pathway can alleviate the function decline of hematopoietic cells caused by senescence or deseases. To further research the substrates of p38 MAPK pathway in hematopoietic cells will provide new ideas for the clinical application of hematopoietic stem cells and mechanisms of hematopoietic system diseases.%丝裂原活化蛋白激酶( MAPK)超家族是介导细胞反应的重要信号系统.研究发现,该超家族亚族p38 MAPK通路在造血细胞调节过程中占据重要地位,抑制p38 MAPK通路可一定程度缓解衰老或者疾病引发的造血细胞功能下降.深入研究p38 MAPK通路在造血系统中的下游作用底物,将对临床造血干细胞的应用以及造血系统疾病发病机制研究提供新的思路.【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2011(027)001【总页数】3页(P4-6)【关键词】造血系统;丝裂原活化蛋白激酶;p38;活性氧;刺激;造血干细胞【作者】李德冠;樊飞跃;孟爱民【作者单位】中国医学科学院放射医学研究所、天津市核医学重点实验室,天津,300192;中国医学科学院放射医学研究所、天津市核医学重点实验室,天津,300192;中国医学科学院放射医学研究所、天津市核医学重点实验室,天津,300192【正文语种】中文【中图分类】R-05;R329.25;R331.23;R345.57;R977.3丝裂原活化激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是哺乳细胞内广泛存在的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞重要的应激通路，在细胞生长、发育、分化、凋亡等许多生理过程中占据重要地位。
TGF—β调控癌细胞EMT机制的研究进展
TGF—β调控癌细胞EMT机制的研究进展在正常机体内或者癌症早期，TGF-β通过抑制细胞生长和促进细胞凋亡而抑制肿瘤的形成与生长。
但是，如果患者处于癌症晚期，TGF-β则会导致人体内的非肿瘤细胞变质，与肿瘤细胞联合成整体，使肿瘤血管增长的速度越来越快，促进肿瘤细胞的生长。
癌症晚期的TGF-β对肿瘤细胞的侵袭起到了扩散作用，从而使肿瘤细胞对人体的侵袭能力增强，这就导致了肿瘤细胞在人体内的快速增长。
EMT是已知的人体内恶性肿瘤细胞得以快速增长以及在人体内扩散的机制，通过对TGF-β调控EMT的相关因素进行分析，能够使人们获得在恶性肿瘤发生的早期就能够及时地诊断的办法，从而使得恶性肿瘤可以在早期就得到及时的诊断和治疗，降低人们患恶性肿瘤的死亡率。
标签：TGF-β，上皮间质转化，信号通路，癌转化生长因子-β （Transforming growth factor beta，TGF-β）属于转化生长因子-β蛋白超家族，结构相对比较复杂，功能多样。
人体内产生病变的细胞中都会有TGF-β的存在，TGF-β能够控制细胞的生长结构，提高细胞的生长率，还能对人体的内环境起到一定的调节作用，使人体内各类元素达到动态的平衡，提高人体的免疫力，使人体的免疫器官功能增强[1]。
TGF-β相关的细胞，都与癌症具有一定的联系。
在致癌方面，TGF-β具有双重作用，在癌症初期，它通过抑制细胞生长，促进细胞凋亡，阻止肿瘤生长；在癌症晚期，TGF-β通常过度表达，通过诱导肿瘤细胞上皮间质转化，增强癌细胞的侵袭力及转移能力促进肿瘤生长[2]。
上皮细胞间充质转化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）是一种上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，以细胞连接的缺失以及细胞极性的改变为特点[3]。
EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。
通过EMT，上皮细胞失去了细胞极性，失去与基底膜的连接等上皮表型，获得了较高的迁移与侵袭力、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型。
NF-κB及p38MAPK信号通路对支气管上皮细胞与中性粒细胞共培养IL-6分泌的调控作用
NF-κB及p38MAPK信号通路对支气管上皮细胞与中性粒细胞共培养IL-6分泌的调控作用唐红卫;王成彬【摘要】目的探讨支气管上皮细胞(bronchial epithelial cells,BEAS-2B)与中性粒细胞(neutrophils,NEU)联合培养时IL-6分泌的机制.方法免疫磁珠法提取外周血中性粒细胞,建立中性粒细胞与BEAS-2B细胞联合培养体系.应用Rochecobas e411检测上清液中IL-6浓度.结果 BEAS-2B和中性粒细胞联合培养时,上清液IL-6浓度为(3 691±482.3) pg/ml,与细胞单独培养[BEAS-2B(313.4±34.7)pg/ml;NEU(219.1±11.3) pg/ml]差异有统计学意义(P＜0.001);蛋白质印迹法(Westernblotting)结果显示BEAS-2B和中性粒细胞联合培养可激活BEAS-2B细胞内NF-κB及p38MAPK的信号通路;而加入NF-κB通路抑制剂MG-132,可有效抑制上清液中IL-6的分泌[(1 075.3±83.9) pg/ml vs(3 691±482.3) pg/ml,P＜0.01];p38MAPK通路抑制剂SB203580亦能抑制IL-6的分泌[(1 532.8±176.1) pg/ml vs(3 691 ±482.3) pg/ml,P＜0.01];且MG-132的抑制效果明显好于SB2035580[(1 075.3±83.9) pg/ml vs(1 532.8±176.1) pg/ml,P＜0.01];当联合使用两种抑制剂(MG-132和SB203580)时可进一步减少IL-6的分泌[(353.1±33.5) pg/ml vs(1 075.3±83.9) pg/ml,P＜0.01;(353.1 ±33.5) pg/ml vs(1 532.8± 176.1) pg/ml,P＜ 0.01].结论 BEAS-2B细胞与NEU细胞接触后激活BEAS-2B细胞体内NF-κB及p38MAPK通路,进而调控IL-6的分泌.【期刊名称】《解放军医学院学报》【年(卷),期】2014(035)007【总页数】4页(P730-732,737)【关键词】支气管上皮细胞;中性粒细胞;IL-6;信号通路【作者】唐红卫;王成彬【作者单位】解放军总医院临床检验科,北京100853;解放军总医院临床检验科,北京100853【正文语种】中文【中图分类】R562.25细胞因子(cytokines，CK)可调控炎症反应或作为炎症反应的效应分子，参与炎症细胞的发育、成熟、分化、募集、活化的各个环节，因此在气道炎症性疾病的发病机制中发挥重要作用。
p38MAPK信号传导通路与卵巢癌关系研究进展
p38MAPK信号传导通路与卵巢癌关系研究进展龙玲;周琦;张笠【摘要】丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一类丝/苏氨酸蛋白激酶,这个级联反应几乎存在于所有生物细胞内,其亚族主要包括细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶/应激激活蛋白激酶(JNK)和p38MAPK.它们主要是作为细胞外信号转入细胞核内的重要信号通路,在细胞生长和细胞增殖过程有着重要的作用.近年研究发现,p38MAPK可介导应激、炎性细胞因子及细菌产物等多种刺激引起细胞反应,也可以通过转录因子磷酸化而改变基因的表达水平,对细胞的功能调节具有重要作用,参与卵巢癌细胞的凋亡、侵袭、转移和耐药等过程,故阐明p38MAPK通路的作用机制,将为卵巢癌的诊治提供新的思路和方法.综述p38MAPK信号通路在卵巢癌发展中的作用、卵巢癌相关p38MAPK耐药机制以及p38MAPK相关新药的研究进展.%Mitogen-activated protein kinases (MAPK) is a class ofserine/threonine protein kinase. This cascade existed broadly in mammalian cells. The subfamily includes extracellular signal-regulated kinase (ERK), c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38MAPK. It is a significant signaling pathway to deliver extracellular signals into nucleus, involved in the important mechanisms of cell growth and proliferation. Recently studies found that function of p38MAPK, mediating many cell reactions induced by stress, inflammatory cytokines or bacterial products and changing the level of gene expression through phosphorylation of transcription factor and play an important role in cell functions, involved in the process of oophoroma cells apoptosis, invasion, metastasis and drug resistance. Therefore, the clarification of mechanism of p38MAPK pathwaywill provide new thoughts and methods for diagnosis and treatment of ovarian cancer. This review summarizes the function of p38MAPK signal transduction pathway in ovarian cancer, and the p38MAPK related research progress of new drugs and drug resistance.【期刊名称】《国际妇产科学杂志》【年(卷),期】2017(044)005【总页数】5页(P494-498)【关键词】p38丝裂原活化蛋白激酶类;信号传导;信号通路;卵巢肿瘤;抗药性,肿瘤【作者】龙玲;周琦;张笠【作者单位】550025 贵阳,贵州医科大学;贵州医科大学附属医院;550025 贵阳,贵州医科大学【正文语种】中文卵巢癌致死率居妇科肿瘤的首位，原因在于其活性强，转移速度快并且在检测过程中不易被发现[1]。
MAPK信号通路
MAPK信号通路2008-06-04 21:50MAPK,丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是细胞内的一类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。
研究证实，MAPKs信号转导通路存在于大多数细胞内，在将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞生物学反应（如细胞增殖、分化、转化及凋亡等）的过程中具有至关重要的作用。
研究表明，MAPKs信号转导通路在细胞内具有生物进化的高度保守性，在低等原核细胞和高等哺乳类细胞内，目前均已发现存在着多条并行的MAPKs信号通路，不同的细胞外刺激可使用不同的MAPKs信号通路，通过其相互调控而介导不同的细胞生物学反应。
1并行MAPKs信号通路的组成及其活化特点在哺乳类细胞目前已发现存在着下述三条并行的MAPKs信号通路［1］。
1．1ERK（extracellular signal-regulated kinase）信号通路1986年由Sturgill等人首先报告的MAPK。
最初其名称十分混乱，曾根据底物蛋白称之为MAP2K、ERK、MBPK、RSKK、ERTK等。
此后，由于发现其具有共同的结构和生化特征，而被命名为MAPK。
近年来，随着不同MAPK家族成员的发现，又重新改称为ERK。
在哺乳类动物细胞中，与ERK相关的细胞内信号转导途径被认为是经典MAPK信号转导途径，目前对其激活过程及生物学意义已有了较深入的认识。
研究证实，受体酪氨酸激酶、G蛋白偶联的受体和部分细胞因子受体均可激活ERK信号转导途径。
如：生长因子与细胞膜上的特异受体结合，可使受体形成二聚体，二聚化的受体使其自身酪氨酸激酶被激活；受体上磷酸化的酪氨酸又与位于胞膜上的生长因子受体结合蛋白2（Grb2）的SH2结构域相结合，而Grb2的SH3结构域则同时与鸟苷酸交换因子SOS（Son of Sevenless）结合，后者使小分子鸟苷酸结合蛋白Ras的GDP解离而结合GTP，从而激活Ras；激活的Ras进一步与丝／苏氨酸蛋白激酶Raf-1的氨基端结合，通过未知机制激活Raf-1；Raf-1可磷酸化MEK1／MEK2（MAP kinase／ERK kinase）上的二个调节性丝氨酸，从而激活MEKs；MEKs为双特异性激酶，可以使丝／苏氨酸和酪氨酸发生磷酸化，最终高度选择性地激活ERK1和ERK2（即p44MAPK和p42MAPK）。
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本文部分内容来自网络，本司不为其真实性负责，如有异议或侵权请及时联系，本司将予以删除！== 本文为word格式，下载后可随意编辑修改！ ==从P38-MAPK 信号通路讨论黄芩苷对Ac-LDL+LPS诱导的与动脉粥样硬化相关巨噬细胞凋亡的影响动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)相关心血管疾病的发生与AS 斑块的不稳定性密切相关。
巨噬细胞是不稳定斑块的主要细胞成分，其凋亡与As斑块的破裂相关。
研究发现巨噬细胞凋亡的结果在AS 的早期和晚期是不同的。
早期病变中，巨噬细胞的凋亡有利于抑制病变细胞泡沫化，显著降低早期病变面积。
晚期巨噬细胞凋亡与动脉粥样硬化斑块的破裂密切相关。
p38 蛋白激酶通路是已确定的 MAPKs 家族成员之一，参与细胞的生长、发育以及细胞间功能同步等多种生理过程，并与炎症、应激反应的调控密切相关。
p38 MAPK通路也参与介导凋亡的信号传导，促进巨噬细胞的凋亡。
黄芩苷(baicalin)是由黄芩的干燥根中提取的一种黄酮类化合物，是黄芩的主要有效成分之一。
近年来，大量研究发现，黄芩苷具有抗动脉粥样硬化作用。
然而对黄芩苷抗AS 的作用机制并没有明确的阐明。
通过整体及离体实验研究发现，黄芩苷对肺炎衣原体感染所致AS 病理过程具有良好的阻抑作用。
本实验以脂多糖和乙酰低密度脂蛋白双重打击诱导离体培养的巨噬细胞凋亡，观察黄芩苷对凋亡及凋亡相关P38 MAPK信号通路的影响，从巨噬细胞凋亡信号通路方面论证黄芩苷干预动脉粥样硬化的作用机制。
1 材料与方法1.1 材料RAW264.7细胞购自中山医学院细胞中心;0.25% 胰酶、DMEM 培养液、脂多糖、培养瓶、PBS、胎牛血清、青霉素、链霉素购自广州斯佳生物科技有限公司;乙酰低密度脂蛋白、脂多糖、黄芩苷、AnnexinV FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、Westernblot 检测试剂盒购自广州晨展生物公司。
1.2 巨噬细胞的收集及试验分组RAW264.7细胞株常规培养于含100 g/mL青链霉素、10% 胎牛血清的RPMI1640 完全培养液，置37 ℃、5% CO2、饱和湿度中培养，所有实验均在细胞处于对数生长期进行。
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TAK1通过调控p38 MAPK信号通路影响肾小管上皮细胞纤维化DING Wen-fei;SONG Lei;LIU Hai-yun;QIN Jian-hua;CAO Ling;GAO Li-chao;OU San-tao;WU Wei-hua【摘要】目的:探讨转化生长因子β激活激酶1(TAK1)对肾小管上皮细胞纤维化的影响及机制.方法:以肾小管上皮细胞HK-2作为研究对象,用转化生长因子β1(TGF-β1)诱导肾小管上皮细胞纤维化,以real-time PCR和Western blot检测细胞中TAK1表达的变化.用TAK1 shRNA慢病毒感染肾小管上皮细胞,以real-time PCR 和Western blot检测其对TGF-β1刺激下肾小管上皮细胞中TAK1表达的影响以检测干扰效果.ELISA法检测细胞分泌的I型胶原和III型胶原水平,Western blot法检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、结缔组织生长因子(CT-GF)和磷酸化的p38 MAPK(p-p38 MAPKThr 180/Tyr 182)的蛋白水平.用p38 MAPK激活剂处理已敲减TAK1表达的肾小管上皮细胞,检测其对细胞分泌I型胶原和III型胶原的影响及对细胞中α-SMA、CTGF和p-p38 MAPKThr 180/Tyr 182蛋白水平的影响.结果:TGF-β1可以明显上调肾小管上皮细胞中TAK1的表达水平.TAK1 shRNA 可明显下调TGF-β1刺激下的肾小管上皮细胞中TAK1的表达水平.TGF-β1处理后的肾小管上皮细胞分泌I型胶原和III型胶原增多,细胞中α-SMA、CTGF和p-p38 MAPKThr 180/Tyr 182蛋白水平升高.敲减TAK1表达可以明显抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞分泌I型胶原和III型胶原,减少细胞中α-SMA、CTGF和p-p38 MAPKThr 180/Tyr 182的蛋白水平(P<0.05).p38 MAPK激活剂处理可以逆转敲减TAK1表达对肾小管上皮细胞分泌I型胶原和III型胶原及α-SMA、CTGF和p-p38 MAPKThr 180/Tyr 182蛋白水平的抑制作用.结论:敲减TAK1表达能够通过抑制p38 MAPK信号通路而降低TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化水平.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2019(035)007【总页数】6页(P1248-1253)【关键词】肾小管上皮细胞;转化生长因子β激活激酶1;p38MAPK信号通路;纤维化【作者】DING Wen-fei;SONG Lei;LIU Hai-yun;QIN Jian-hua;CAO Ling;GAO Li-chao;OU San-tao;WU Wei-hua【作者单位】;;;;;;;【正文语种】中文【中图分类】R692.9;R363.2肾组织纤维化是常见慢性肾脏疾病发生的基础，其主要以肾小管间质纤维化和肾小球硬化为主要特征[1]。
肾小管上皮细胞损伤是肾纤维化发生的基础，转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)具有促进肾小管上皮细胞分泌纤维化因子的作用[2]，是肾组织纤维化发生的关键诱导因子之一。
转化生长因子β激活激酶1(TGF-β activated kinase 1，TAK1)是一种典型的苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶，经TGF-β的刺激而激活，参与胰岛素敏感、糖脂代谢和中枢神经系统发育等生理过程[3-4]。
TAK1参与炎症、免疫反应和纤维化等相关疾病的发生，TAK1还可以通过调控细胞内多种信号的转导和基因的转录表达发挥多种生物学作用[5]。
目前的研究显示，TAK1在肾组织纤维化发生时表达上调，并能够促进p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38 MAPK)信号通路的激活[6-7]。
为了探讨TAK1在肾小管上皮细胞纤维化过程中的作用，本研究用TGF-β1刺激肾小管上皮HK-2细胞模拟构建肾小管上皮细胞纤维化模型，检测肾小管上皮细胞纤维化因子的表达情况，为明确肾组织纤维化发生机制提供依据。
材料和方法1 材料肾小管上皮细胞HK-2购自中国上海中科院细胞库。
细胞培养液用含10%胎牛血清的DMEM/F12，细胞密度为90%时，用0.25%的胰蛋白酶消化传代，细胞在37 ℃、饱和湿度、5% CO2条件下培养。
反转录试剂盒购自Promega；ECL显色试剂盒购自Perkin-Elmer Life Sciences；抗TAK1抗体和抗磷酸化TAK1Ser412(p-TAK1Ser412)抗体购自Jackson；I型胶原检测试剂盒和III型胶原检测试剂盒购自上海玉博生物科技有限公司；抗α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗体和抗结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)抗体和抗p38 MAPK抗体购自PeproTech；抗磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPKThr 180/Tyr 182)抗体购自Santa Cruz；TGF-β1购自R&D Systems。
2 方法2.1 实验分组 HK-2细胞用含终浓度为10 μg/L和0 μg/L TGF-β1的细胞培养液培养24 h，记为TGF-β1处理组和对照(control)组，以real-time PCR和Western blot方法检测细胞中TAK1表达的变化。
2.2 Real-time PCR检测TGF-β1诱导的HK-2细胞TAK1 mRNA的表达收集HK-2细胞，在细胞中添加TRIzol裂解液，提取细胞中总RNA。
以总RNA作为模板，合成cDNA，体系包括0.5 μL AMV reverse transcriptase、0.5 μL random primer、1 μL dNTP mixture、2 μL sample RNA、2 μL RT buffer和0.5 μL RNase inhibitor，添加RNase free H2O至3.5 μL，按照42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min进行逆转录。
qPCR的反应体系为2.5 μL 10×PCR buffer、0.5 μL dNTP mixture、0.5 μL引物、0.5 μL Taq mix DNA polymerase、2.5 μL cDNA，添加RNase free H2O至25 μL。
TAK1的上游引物序列为5’-ATTCCACAGATACAATGGCTC-3’，下游引序列为5’-TGTAGTAACAATGCGATTTGCC-3’；GAPDH的上游引物序列为5’-AGGGCATCTTGGGCTACAC-3’，下游引物的序列为5’-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3’；由南京金斯瑞公司合成。
扩增条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，72 ℃ 5 min，共35个循环。
内参照为GAPDH，根据反应的Ct值计算TAK1的表达水平。
2.3 Western blot检测TGF-β1诱导的HK-2细胞TAK1蛋白的表达将HK-2细胞收集以后，在细胞中添加PBS洗涤2次，加入含有PMSF的RIPA裂解溶液，反复吹打混合后，将细胞放在冰上混合孵育30 min。
采用BCA法进行定量检测以后，将蛋白同1/5体积的loading buffer混合，100 ℃煮沸变性。
将蛋白样品加入到上样孔中，每孔中添加30 μg蛋白样品，以120 V的电压电泳约2 h后，将凝胶从玻璃板中间取出。
把PVDF膜放在甲醇中孵育10 s后转膜，转膜在4 ℃中进行。
把PVDF膜放在新配置的5%牛血清白蛋白中，室温结合2 h。
将抗TAK1和p-TAK1抗体按照1∶600稀释，将PVDF膜放在稀释的I抗反应液中，置于摇床上反应过夜。
将 II 抗按照1∶2 000稀释后，将PVDF膜放置于其中，在室温中孵育2 h。
以ECL法发光以后，扫描图像。
用ImageJ分析条带的灰度值。
GAPDH为内参照。
2.4 慢病毒感染 HK-2细胞按照每孔加入5×104个细胞接种到6孔板中，放在培养箱中孵育培养，细胞融合度为40%左右时，按照MOI=20添加慢病毒载体，同时添加适量的polybrene(终浓度为5 mg/L)，混合培养12 h以后，把旧培养液吸除，添加新鲜的细胞培养液，继续培养72 h，观察荧光表达情况，用1 mg/L的嘌呤霉素筛选稳定感染的细胞系。
把稳定感染阴性对照慢病毒(sh-NC)和TAK1 shRNA慢病毒(sh-TAK1)的HK-2细胞用含终浓度为10 μg/L TGF-β1的细胞培养液培养，分别记为TGF-β1+sh-NC组和TGF-β1+sh-TAK1组。
以real-time PCR和Western blot方法检测TGF-β1、TGF-β1+sh-NC和TGF-β1+sh-TAK1各组HK-2细胞培养24 h后TAK1表达水平的变化。
同时，采用Western blot方法检测HK-2细胞中α-SMA、CTGF、p-p38MAPKThr 180/Tyr 182和p38 MAPK的蛋白水平。
阴性对照慢病毒和TAK1 shRNA慢病毒由上海翊圣生物科技有限公司构建。
2.5 细胞分泌I型胶原和III型胶原水平的检测取各组HK-2细胞，培养24 h以后按照ELISA法检测培养液上清中I型胶原和III型胶原含量，步骤同试剂盒说明书。
2.6 p38 MAPK通路激动剂anisomycin对下调TAK1的肾小管上皮细胞纤维化的影响取稳定感染TAK1 shRNA的HK-2细胞，以含有p38 MAPK通路激动剂anisomycin (10 μmol/L)和TGF-β1 (10 μg/L)的细胞培养液培养，记为TGF-β1+sh-TAK1+anisomycin组，培养24 h后，ELISA法检测培养液上清中I型胶原和III型胶原含量，Western blot方法检测各组细胞中α-SMA、CTGF、p-p38 MAPKThr 180/Tyr 182和p38 MAPK蛋白的水平。
3 统计学处理采用SPSS 21.0软件分析实验数据。
所有实验重复3次，数据按照均数±标准差(mean±S D)表示，两组数据间比较用t检验，多组差异比较用单因素方差分析，各组均数间的两两比较用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。