手性药物拆分的研究进展

手性药物拆分的研究进展

许多药物具有光学活性(opitical activeity)。一般显示光学活性的药物分子，其立体结构必定是手性(chirality)的，即具有不对称性。手性是指其分子立体结构和它的镜像彼此不能重合。互为镜像关系而又不能重合的一对分子结构称为对映体(enantiomer)。虽然对映异构体药物的理化性质基本相同，但由于药物分子所作用的受体或靶位是由氨基酸、核苷、膜等组成的手性蛋白质和核酸大分子等，后者对与之结合的药物分子的空间立体构型有一定的要求。因此，对映异构体在动物体内往往呈现出药效学和药动学方面的差异。鉴于此，美国食品药品监督管理局规定，今后研制具有不对称中心的药物，必须给出手性拆分结果，欧盟也提出了相应的要求。因此，手性拆分已成为药理学研究和制药工业迫切需要解决的问题。

目前，利用酶法、超临界流体色谱(SFC)法、化学法、高效液相色谱(HPLC)法、气相色谱(GC)法、毛细管电泳(capillary electrophoreisis，CE)法和分子烙印法拆分对映体，已成为新药研究和分析化学领域的重要课题。笔者在本文综述了近年来利用上述方法拆分手性药物的研究进展。

1酶法

酶的活性中心是一个不对称结构，这种结构有利于识别消旋体。在一定条件下，酶只能催化消旋体中的一个对映体发生反应而成为不同的化合物，从而使两个对映体分开。该法拆分手性药物已有较久的历史，反应产物的对映过剩百分率可达100％。酶催化的反应大多在温和的条件下进行，温度通常在0～50℃，pH 值接近7.0。由于酶无毒、易降解、不会造成环境污染，适于大规模生产。酶固定化技术、多相反应器等新技术的日趋成熟，大大促进了酶拆分技术的发展。脂肪酶、酯酶、蛋白酶、转氨酶等多种酶已用于外消旋体的拆分。脂肪酶是最早用于手性药物拆分的一类酶，是一类特殊的酯键水解酶，具有高度的选择性和立体专一性，反应条件温和，副反应少，适用于催化非水相递质中的化学反应，在B 一受体阻滞药、非甾体类抗炎药和其他多种药物的手性拆分中都有广泛的应用。意大利的Batlistel等用固定于载体Amberlite AD-7上的脂肪酶对萘普生的乙氧基乙酯进行酶法水解拆分，对温度、底物浓度和产物抑制等进行了研究，最后使用500 mL的柱式反应器，在连续进行了1200h的反应后，得到了l8kg的光学纯S-萘普生，且酶活性几乎无损失。另外，酯酶具有很高的工业价值，其应用前景也极为广阔。Jiaxin等利用pseudomaonas cepacia脂肪酶拆分了一类酰基取代的1．环己烯衍生物，通过酶催化酯交换反应，得到产率较高的光学纯化合物，且提供了反应过程监测方法。这种方法可推广到该类化合物系列衍生物的合成与拆分。

2 SFC法

根据手性选择剂种类不同，该分离方式主要包括氨基酸和酰氨类手性固定相、Prikle型手性固定相、环糊精型键合固定相如聚甲基异丁烯酯等。由于SFC 法尚处于发展阶段，各种参(如温度、压力、流动相的组成和密度等) 对分离度的影响机制还未完全清楚。SFC法具有简单、高效、易于变换操作条件等优点，已成为与HPLC法和GC法互补的拆分方法，因其具有独特的优越性，应用前景极为广阔。Nozal等用Chiralpak AD柱和Chiralcel OD柱在SFC条件下拆分了驱肠蠕虫药阿苯唑亚砜化合物，并研究了甲醇、乙醇、乙丙醇及乙腈等有机溶剂对立体构型的影响。结果表明，在以Chiralpak AD柱为固定相时，用2丙醇可以获得最好的拆分效果；而在Chiralcel OD柱上用甲醇效果最好。

经典的化学拆分法是利用手性试剂与外消旋体反应，生成两个非对映异构体，再利用产物的物理性质差异将其拆分。基本原理是手性主体化合物通过氢键与分子间的次级作用，选择性地与客体分子中一个对映体形成稳定的包结络和物析出，从而实现对映体的分离。经典的化学拆分法收率较低，拆分剂消耗量大，且在拆分的化合物类型上受到限制。近年来，随着对主客体化学的深入研究而发展起来的包结拆分，由于采用这种方法，主体分子与客体分子间不发生任何化学反应，只是通过分子间作用力来实现拆分，因而很容易通过柱、溶剂交换和逐级蒸馏等方法与客体分子分离，可循环使用。甾体类化合物是最优良的包结主体之一，其中胆汁酸类衍生物广泛应用于手性醇、酮及手性亚砜类化合物的拆分。

H isakazu等利用酒石酸衍生物[(R，R)-trans-4，5-bis(hydroxydiphenylmethy1) -1，4-dioxaspiro](4，4)nonane作为包结主体拆分了外消旋的甲基取代环丙烯等系列化合物，经蒸馏后，得到光学纯度为28％―75％的包结络和物。

4 HPLC法

HPLC法包括直接法和间接法。直接法的分离原理是手性药物对映体之一与手性固定相或手性流动相之间发生分子间的三点作用，同时另一对映异构体则发生两点作用，形成暂时的非对映异构体的结合物质，前者较后者稳定，通过洗脱使两

对映异构体分离；间接法是利用手性药物对映体混合物在预处理中进行柱前衍生组成一对非对映异构体，根据其在理化性质上的差异，应用HPLC法在非手性柱上得以分离。直接法的优点是在分离前不需要进行衍生化反应，可根据手性固定相和手性流动相选择不同溶剂体系作流动相；间接法的缺点是手性药物需要有被衍生化的基团，需要有高光学纯度的手性试剂，各对映体衍生化速率和平衡常数应一致，衍生化和色谱过程中不能发生消旋化，优点是可采用通用的非手性柱分离，通过衍生化可提高检测灵敏度，分离条件简单，分离效果好。随着CSP 技术的发展，目前已有几十种商品化的CSP柱可用于对映体的分离测定。Bourqne 等报道了氨基甲酸酯类固相衍生化试剂用于手性氨类或醇类药物的测定，衍生化产物为3，5-二硝基苯甲酰氨或酯，可在Pirkle型萘脲类CSP上进行对映体的分离；另外，近20 a来，国外有关CMP的研究较多，其中对氨基酸的拆分，在CMP 中加入的手性试剂有蛋白质、环糊精类、氢键型手性试剂、配位基手性试剂、手性离子对试剂等。目前国内报道较多的为应用环糊精类与配位基手性试剂。

5GC法

在气相色谱仪中选择适当的吸附剂作固定相(通常是手性固定相)，使之选择性地吸附外消旋体中的一种异构体，可以快速分离手性化合物。研究表明，手性固定相与异构体之间的作用有氢键作用、偶极结合作用及三点作用。在气相色谱分析中利用对映体转变成非对映体进行快速分离，也就是两个对映体分别与手性固定相结合的强度不同而达到分离的目的。手性化合物的直接气相色谱分离，其关键问题是必须找到一个合适的手性固定相，如高聚物固定相、均三氮苯型固定相、菊酰胺型固定相、光学活性金属络合物固定相等。该方法的最大优点在于简便、快速，分离效果较好。GC法适用于酸和碱外消旋体的拆分。对于既非酸又非碱的外消旋体的拆分，就要设法在分子中引进酸性基团，然后按拆分酸的方法拆分。Sloehing等人采用N-TFA-L-脯氨酰-L-脯氨酸环己酯固定相在气相色谱上成功地进行了TFA-D，L-脯氨酸的拆分，随后又分离了2-三氟甲基-3-甲基4-烷烯基-咪唑．5-酮等-系列手性化合物。

CE法是根据带电荷离子在毛细管中以电场力为推动力，按淌度差别进行分离的技术，具有分离效率高、分离速度快、实验成本低、仪器操作简单、操作模式多等特点。CE法在药物分析中有广泛的应用，现就CE的不同操作模式分别介绍如下。

6.1 毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis，CZE)

CZE的原理是在毛细管内充入缓冲溶液，由于各成分所带电荷不同而以不同的速度在区带内迁移，中性物质在电场中不移动。CZE主要用于分离带电离子和易电离的物质。赵新峰等采用CZE方法在50％的硼砂缓冲液中以氢氯噻嗪为内标，测定洋地黄中梓醇的含量，方法简便，灵敏度高，重现性好。

6.2胶束电动色谱(micellar electrolinetic chromatography，MEKC)

MEKC的原理是在缓冲液中加入溶解度大于临界胶束溶解度(CMC)的表面

活性剂，胶束相类似于色谱中的固定相，缓冲液的电渗流相当于色谱中的流动相，基于溶质在胶束相与水相间分配的不同以及电泳淌度差异而得以分离。该方法将电泳技术与色谱技术结合了起来。自从Terakes等将胶束引入CE以来，许多电中性化合物的分离成为可能，大大拓宽了CE的应用范围，同时也使MEKC得到快速发展和普及。Lans等报道了美沙酮和其原始代谢产物具有立体选择性，并用B—CD作固定相分离了它们在尿液中的异构体。

6.3毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis，CGE)

CGE的原理是将凝胶移到毛细管内作支持物，利用分子筛的原理，不同的药物主要靠分子形状、分子量不同而分离，常用于蛋白质和多肽的分离。

6.4毛细管电色谱(capillary eleclrochromatography，CEC)

该法是综合了HPLC法和CE法的优点而发展起来的一种新型微分离技术，需要选择合适的手性固定相、合适pH值的缓冲液、合适的电压和温度对对映体进行拆分。该法具有高效、高选择性、高灵敏度和速度快等特点，已成为手性分离的一个强有力的工具。手性药物异丙嗪属抗心率失常药，噻利洛尔和卡替洛尔均为p一受体阻滞药，沙丁胺醇为止咳平喘的呼吸系统药，以上药物均为市场急需的药物，且目前销售的药物均为外消旋体。有采用HPLC法和CE进行这类药物手性拆分的报道。有学者以大环内酯类抗生素万古霉素为手性固定相，甲醇：冰醋酸：三乙胺(100：0.1：0.1)(V/V/V)作为流动相，使上述4种手性药物得到分离，其中异丙嗪、卡替洛尔、塞替洛尔达到了基线分离。

7分子烙印法

分子烙印技术(molecularim printing technology，MPT)是20世纪末出现的一种高选择性分离技术，由于MPT模仿了生物界的锁匙作用原理，使制备的材料具有极高的选择性，因而受到全球众多研究人员的重视，很快在许多相关领域如手性分离和底物选择性分离、固相萃取、化学或生物传感器、不对称催化和模拟酶等方面得到了应用。

手性固定相分离对映体或立体异构体手性分离是MPT应用取得较大进展的领域。有学者采用MPT手性固定相成功分离了氨基酸衍生物、氨基酸、镇静药苯二氮革、氨基酸乙内酰脲等的对映体，并使用原位方法制备的MPT分离萘乙胺对映体，单分散MPT分离萘普生、布洛芬、普萘洛尔等。也有学者把手性固定相接到了分离性能较好的膜上，或将MPT手性固定相用于CEC及TLC中。此外，MPT也被用于某些几何异构体的分离，如分离立体异构体辛可尼丁和辛可宁的球形MIP和CEC固定相，以及分离位置异构体的MPT等。对如何制备亲水性的

MPT，实现亲水性溶质的手性分离，以及如何制备球形(单分散)MPT，避免MPT 在合成后的粉碎、筛分、沉降造成的损失及提高柱效等，是当前需要解决的问题。

在分离科学的应用领域，一个重要的方面是从复杂体系中选择性地萃取所需成分，固相萃取(SPE)是其中最为有效的方法，而特异性好的MPT可以用作高度专一性的固相萃取材料。将MIP作为SPE材料(MISPE)的合作研究工作用于环境样品和农用化学品的富集是十分有效的，如萃取硝基酚、芳香硝基化合物、苯达松除草剂、莠去津除草剂，纯化、预浓缩和测定U O 2+2：等，富集倍数通常>100，并可在线连接HPLC法进行直接分析。MISPE也用于某些药物的富集，如作为双氯醇胺分析的预浓缩手段、选择性地识别和分离青霉素，从肠液中清除胆固醇，分离复杂体系如体液样品中的雌二醇和双酚A等。MISPE也被用于某些化学毒剂的监测，如测定烟草中的尼古丁，萃取和分析茶碱。在环境监测中，MISPE也有独特的用途，如许多氯代酚的乙酸或丙酸衍生物是广为使用的除草剂，如2，4D，2，4，5T等，采用MPT可以制备富集它们的吸附剂。目前已有利用分子烙印技术分离中草药活性组分的报道，采用非共价法，在极性溶剂中，以丙烯酰胺为功能单体，以强极性化合物槲皮素为模板，制备了分子烙印聚合物EFG用于直接从中草药中分离提取具有特定药效的化合物。

专家预言。有望在2011年前实现M1P传感器商业化。近年来，MPT在分析和传感器中用作模拟抗体的报道很多。如对鸟苷单环磷酸(cGMP)、β-雌二醇、L-色氨酸、D-果糖产生专一响应的MPT荧光传感器；通过染料罗丹明B和分析物在MPT上的竞争性置换检测分析物的MPT荧光传感器；测量血清和尿中咖啡因的MPT传感器；对茶碱响应，对咖啡因几乎没有响应的MPT传感器；测定肾上腺素、苯巴比妥、甲氧苄氨嘧啶、3-羟基黄酮、PAH的MPT传感器；具有对映体选择性的MPT压电传感器；MPT传感器测量体液中的激素，如吲哚-3-乙酸、植物激素等；分析除草剂2，4-D、莠去津的MPT传感器；监测地下水中的甲苯和三氯乙烯的MPT光纤传感器；基于F11R的MPT光学传感器；测定气相中2-甲基异冰片的MPT压电传感器；用多个模板分子烙印可同时检测多个分子的MPT传感器；第一个气体MPT传感器等。

目前在药物对映体拆分分析应用中，采用的主要手段是气相色谱和高效液相色谱法，但其手性柱费用高、易污染，且手性衍生化常带进副产物，故以上方法仍需进一步改进。而SFC法正处于发展阶段，各种参数的影响虽尚未完全清楚，但随着其理论和技术的日臻完善，SFC法在手性药物分析的应用上将得到进一步发展。HPLC法和EC法效率较高，但需要选择合适的手性固定相和手性流动相；酶法和化学法在生产方面有较明显的优势，酶法操作简便且不易污染；而分子烙印技术有着良好的应用前景。随着对各种对映体拆分机制更为深入的研究。手性拆分技术必将更加完善。

微生物与生化药学

刘达文 201040020