革兰氏阴性杆菌微生物学检验的标准操作程序
微生物限度检查法操作规程
1.目的建立微生物限度检查法操作规程。
2.适用范围本规程适用于原辅料、包装材料、制剂（非规定灭菌）、药妆、空气洁净℃等各类微生物限度检查。
3.编制依据《中国药品检验标准操作规范》2010年版《中华人民共和药典》2010年版二部药品微生物学检验手册4.责任4.1 QC质检员对本规程的实施负责。
4.2 QC主管对本规程的有效执行承担监督检查责任。
5.正文5.1微生物限度检查系指非规定灭菌制微生物污染限度的一种检查方法，包括活菌数及控制菌的检查。
5.2药品生产洁净室（区）的空气洁净℃划分为四个级别，不同级别间微生物最大允许数、尘粒最大允许数不同。
5.3微生物限度检查室和操作人员的一般原则5.3.1检查的全部过程均应严格遵循无菌操作，防止再污染。
5.3.2进入微生物限度检查室的操作人员，面部暴露部位不得化妆；患传染病及体表有伤口人员禁止入内。
5.3.3操作人员进微生物限度检查室前应在缓冲间用规定的消毒液进行手部消毒，更衣，戴帽，戴口罩及换鞋，进入微生物限度检查室后，再用75%酒精消毒手部。
5.3.4使用净化工作台前，应先用规定的消毒液（3月轮换一次）擦工作台与各操作开关，然后开紫外灯及空气过滤器30分钟后，方可使用。
物品通过传递窗进入。
5.4培养基及供试液的制备5.4.1培养基的制备方法5.4.1.1细菌培养基：称取营养琼脂培养基34g，加1L纯化水溶解，115℃灭菌，40分钟后，备用。
5.4.1.2霉菌培养基：称取虎红琼脂培养基30g，加1L纯化水溶解，115℃灭菌，40分钟后，备用。
5.4.1.3控制菌的培养（详见中华人民共和国药典2010版二部）。
5.4.2器皿的准备：直径90ml的平皿，10ml、1ml的刻℃吸管，200ml的三角烧瓶及胶塞等，均应包扎好后，再经121℃高压蒸气灭菌30分钟。
5.4.3供试液的制备方法：5.4.3.1液体供试品：取供试品10ml，加入90ml的稀释剂中，混匀，作为供试液；5.4.3.2固体、半固体或粘稠液供试品：称取供试品10g，置pH7.0蛋白胨-氯化钠无菌缓冲溶液100ml中，混匀后，作为供试液。
微生物生化和血清学试验标准操作规程
触酶试验标准操作规程1.目的规范触酶试验标准操作规程。
2．原理具有触酶(过氧化氢酶)的细菌，能催化过氧化氢，放出新生态氧，继而形成分子氧，出现气泡。
3．试剂3％过氧化氢溶液。
4．质控金黄色葡萄球菌ATCC 25923阳性，肺炎链球菌ATCC 4961 9阴性。
5．操作步骤取3％过氧化氢溶液0．5 ml，滴加于不含血液的细菌琼脂培养物上，或取1～3 ml滴加入盐水菌悬液中。
6．结果判断培养物出现气泡者为阳性。
7．注意事项7．1细菌要求新鲜。
7．2不宜用血琼脂平板上的菌落作触酶试验，因红细胞内含有触酶，可能出现假阳性。
7．3需用已知阳性菌和阴性菌作对照。
8．临床意义在革兰阳性球菌中，链球菌触酶试验阴性，葡萄球菌及微球菌均阳性，因此可用于革兰阳性球菌的初步分群。
氧化酶试验标准操作规程1．目的l规范氧化酶试验标准操作规程。
{2.原理氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的酶。
具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。
3 . 试剂盐酸二甲基对苯二胺(或四甲基对苯二胺)0.1g，加蒸锱水10ml，置于棕色瓶内可用一周。
冰箱保存，或分装于棕色瓶内密封。
4. 质控铜绿假单胞菌ATCC27853阳性，大肠埃希菌ATcc 25922阴性。
5.操作步骤去洁净的滤纸一小块，蘸取菌苔少许，加1滴10g／L盐酸二甲基对苯二胺溶液于菌落上，观察颜色变化。
6．结果判断立即呈粉红色并迅速转为紫红色者为阳性。
7. 注意事项7．1 试剂在空气中易氧化，故应经常更换新试剂，或配置时试剂内加入0．1％维生素c以减少自身氧化。
7. 2 不宜采用含葡萄糖培养基上的菌落(葡萄糖发酵可抑制氧化酶活性)。
7．3实验时应避开含铁的培养基等含铁物质，因本实验过程中，遇铁时会出现假阳性。
8 . 临床意义8. 1 用于奈瑟菌属﹑非发酵等细菌的鉴定。
如果肠杆菌科不进行本试验，则可能将氧化8．2所有的革兰阴性菌均应进行氧化酶试验，如果肠杆菌科不进行本试验，则可能将氧化酶阳性的嗜水气单胞菌错误地鉴定为大肠埃希杆菌或沙雷菌。
Biolog微生物鉴定步骤
Biolog微生物鉴定步骤一检测原理Biolog微生物鉴定系统测试的是微生物在鉴定板中利用或氧化化和物的能力。
测试会产生特征性的紫色孔模式，组成代谢指纹。
所有必需的营养物质和生化试剂都预先加进96孔板中，四唑紫是一种氧化还原染料，指示碳源的利用情况。
.鉴定步骤非常简单，纯化分离到的菌株经扩大培养，再制成接种液加到鉴定板中。
在培养过程中，一些孔中的化学物质能被氧化并将显色物质成紫色，对照孔（A-1）和阴性孔仍然为无色。
鉴定板在相应的培养条件下培养4-6小时或16-24小时即可形成代谢模式。
系统软件自动和数据库对比，如果能找到合适的匹配，就可以得出一个鉴定结果。
二所需器材和消耗品：培养基、接种液、巯基乙酸钠、长棉签、接种棒、储液槽、八道移液器、移液器头、浊度仪、浊度标准品、控温培养箱和相应的鉴定板。
其中接种液自行配制，接种棒、储液槽可选用国产品牌代替。
三鉴定步骤：Biolog微生物鉴定样品处理步骤分离纯化培养基BUG+B通用培养基加羊血BUA+B厌氧培养基加羊血BUY酵母培养基2%ME2%的麦芽汁提取物革兰氏染色和菌落菌株形态观察革兰氏染色结果革兰氏阴性革兰氏阳性厌氧菌酵母菌丝状真菌确认实验氧化酶反应阳性氧化酶反应阴性、三糖铁实验A/A或K/A需在巧克力培养基上或需要6.5%CO2培养确认实验氧化酶反应阴性、三糖铁实验K/K或K/A w第一步：在用户自己的培养基上纯化菌株，如果菌株为冻干或冷冻样品，需要传代培养2-3代，让菌株恢复活力。
对纯化好的菌株做革兰氏染色，确定菌株是革兰氏阴性还是阳性。
观察菌落外部形态或用显微镜观察菌株形态，确定是酵母还是丝状真菌，是球菌还是杆菌。
如果是革兰氏阴性菌，还需要最终确认是肠道菌、非肠道菌或苛生菌。
方法是，氧化酶阳性或氧化酶阴性但三糖铁实验为K/K或K/A w，则该菌株为非肠道菌(GN-NENT)，氧化酶阴性以及三糖铁实验为A/A或K/A，则该菌株为肠道菌(GN-ENT)。
微生物限度检查法标准操作规程完整
3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查 供试品微生物计数中 所使用的培养基应进行适用性检查。供试品的微生物计数方法应进行方法适用性 试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。
4、菌种及菌液的制备
试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。计数培养基适用性检查和计数方法 适用性试验。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B) 10104]
大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44102])
乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)[CMCC(B) 50094]
白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]
薄膜过滤法采用的滤膜孔径不大于。滤膜直径一般为50mm。滤器及滤膜使用 前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供 试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。为发挥滤膜的最大过滤效率，应 注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要 用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量不超过100ml，总冲洗量不得超过1000m1；以免滤膜上的微生物受损伤。取照上述“供试液的制备”和“接种和 稀释”制备的供试液适量（一般取相当于1g、1ml、10cm2的供试品，若供试品 中所含菌数校对，供试液可酌情减量），加至适量的稀释液总，混匀，过滤，用 适量的冲洗液冲洗滤膜。测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨 琼脂培养基平板上；测定霉菌和酵母菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖 琼脂培养基平板上，按规定条件培养、技术。每株试验菌每种培养基至少制备1张滤膜。同法测定供试品对照组和菌液对照组菌数。
微生物学检验--操作流程及评分标准
准备
待测水样、泥土、无菌吸管，平皿，无菌生理盐水
素质要求
让学生熟悉细菌在自然界和人体的分布情况
操
作
步
骤
1.空气中细菌的检查
（1）方法：取普通平板（或血平板）1个，选室内或室外的一处空间，在离地面1m左右高度的桌面（或台面）上，打开平板盖，让培养基暴露于空气中，10min之后，迅速盖好盖子，在底部写上标记，放35℃培养18~24h，观察结果。
2.尿囊腔接种
将蛋胚在检卵灯上照视，并在绒毛尿囊膜血管较少的地方作记号。用碘酒消毒气室蛋壳，并用钢针在记号处钻一小孔。用带18mm长针头的1ml注射器吸取病毒液，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜入尿囊腔，注入0．1ml病毒液。用石蜡封孔后于37℃孵卵器孵育72小时。
3.羊膜腔接种
将孵育10—11天的蛋胚照视，画出气室范围，并在胚胎最靠近卵壳的一侧做记号。用齿钻在气室顶端磨一三角形，用镊子揭去蛋壳和壳膜，并滴加灭菌液体石蜡一滴，用镊子，刺穿下层壳膜和绒毛尿囊膜没有血管的地方，用26号针头的注射器，刺入羊膜腔内，注入病毒液 0．1ml。将卵壳的小窗封住，于37℃孵卵器内孵育48—72小时。
扣分标准
扣分
目的
了解鸡胚培养常见的几种接种方法；
掌握鸡胚尿囊腔接种的操作技术。
用物
准备
受精卵、孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2．5%碘酒，70%酒精，镊子，剪刀，封蜡（固体石蜡加 1/4凡士林，溶化），灭菌培养皿，灭菌盖玻片等。
素质要求
要求能够对不同的病毒通过鸡胚进行培养
操
作
用物
准备
菌种、葡萄糖蛋白胨培养基，甲基红
素质要求
能利用甲基红试验对大肠杆菌进行鉴定
微生物检验实验室沙门菌属标准操作规程
微生物检验实验室沙门菌属标准操作规程1.概述沙门菌属是一大群寄生于人和动物肠道中的形态、培养特性、生化反应和抗原构造相似的革兰阴性杆菌，其血清型别繁多、抗原复杂的肠道病原菌，分为6个亚属、2200种以上的血清型。
伤寒沙门菌属亚属I，多价O抗血清D群，是临床上最为重要的沙门菌。
2.标本类型粪便、血液等额标本。
3.鉴定3.1 形态与染色：革兰阴性杆菌，菌体细长，大小为（0.7~1.5um）×（2~5um）。
有周鞭毛，无芽胞，无荚膜。
3.2 培养特性：在麦康凯琼脂平板上形成无色、透明的菌落；SS琼脂平板上呈无色、透明，但大部分菌落中央呈黑色（产H2S）；在XLD琼脂平板上也产生中央黑色的菌落（产H2S）；HE琼脂平板上菌落呈蓝绿色。
CHROMagar显色培养基上呈紫色菌落。
半固体琼脂中均匀混浊生长，无穿刺线。
3.3 生化反应：氧化酶试验阴性，TSI为K/A；发酵葡萄糖，不发酵乳糖；IMViC-+--或-+-+，H2S试验阳性或阴性，动力、赖氨酸脱羧酶和硝酸盐还原试验阳性，鸟氨酸脱羧酶、尿素酶试验阴性，氰化钾（KCN）培养基不生长。
3.4 鉴别要点：3.4.1 本菌特征：鉴别平板上无色透胆或半透明的菌落，TSI为K/A，H2S阳性或阴性，有动力，IMViC-+--或-+-+，尿素酶试验阴性。
符合上述特性者，可通过血清凝集试验）作出诊断。
3.4.2 与志贺菌属的鉴别：少数伤寒沙门菌在TSI上H2S阴性，动力不明显，易与志贺菌属混淆，可用血清凝集反应相鉴别。
3.5 操作步骤3.5.1 观察菌落特征，挑取可疑菌落，做TSI试验。
参见细菌鉴定标准操作构规程。
3.5.2 血清学鉴定参见沙门菌血清学检测标准操作规程。
3.5.3 鉴定从SS琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化法进行细菌鉴定。
4. 药敏参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSI M100-S20最新版本文件。
5. 质量控制参见质量管理程序。
《医学微生物学》三大常规的微生物学检查
《医学微生物学》三大常规的微生物学检查从临床标本中分离细菌的目的是为疾病的病原学做诊断，或查找与疾病相关的微生物，以及对抗生素的敏感性，这对于临床诊断、治疗、预后和进行流行病学调查是很有价值的。
因此，对临床标本的处理和检测应掌握以下原则。
1．临床标本的正确采集和处理对于疾病的正确诊断关系很大。
病人标本一般应在应用抗菌药物前采集。
对血液、脑脊液或穿刺液等标本，应严格按照无菌技术进行采集；对鼻咽拭子、肛拭子、粪便等标本，虽无须严格无菌操作，但也应尽量避免杂菌混入。
2．采集容器上应贴好送检号及病人姓名的标签，连同检验单一起尽早送检验室。
若路途较远，应冷藏保存送检；对脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等特殊标本，送检时应35℃～37℃保温。
3．人体很多部位与外界相通，存在有正常菌群，但不致病，故在涂片检查或分离培养时，应区别标本中是常居菌群的污染还是致病菌。
另外，对某些无菌的部位，如血液、骨髓、脑脊液等，如检查出细菌应视为致病菌，但必须要排除采样及操作中的污染。
4．根据标本来源和可能存在的病原菌，选定各种分离培养基和孵育环境。
如痰标本一般选用血平板，用于化脓性链球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、白喉棒状杆菌等的分离。
【血液标本检查】正常人的血液是无菌的。
当细菌侵入血流并在其中生长繁殖，产生毒素等，可引起菌血症或败血症。
细菌学检验对其诊断和治疗具有极其重要的意义。
一、标本采集l．标本采集必须严格遵守无菌操作，即应去除皮肤上的细菌，又应注意空气中的细菌。
穿刺部位以碘酒、酒精棉球消毒，用干燥的灭菌注射器抽取血液，立即注入选定的液体培养基瓶内，充分混匀以防凝固。
2．采血一般应在治疗前，并在高热、寒战时作培养。
伤寒在发病一周内即菌血症期间采血；化脓性脑膜炎，鼠疫应在发热1～2d内采血；亚急性细菌性心内膜炎也宜于发热高峰采血或多次采血，且每隔1～2h采血一次，连续3～4次，可获较高的阳性率。
3．采血量应相当于培养液的1／10，通常是50ml培养液采血5ml，这样可使存在于血液中的补体、抗体、调理素、溶菌酶等抑制因子被稀释，使之减弱或失去抑制作用。
微生物的革兰氏染色实验报告
微生物的革兰氏染色实验报告
摘要：
本实验旨在通过革兰氏染色方法来区分微生物的细胞壁类型，
进一步了解微生物的结构与分类。
首先，通过培养革兰氏阳性菌和
革兰氏阴性菌，获得纯净的微生物样本。
然后，按照革兰氏染色的
步骤进行染色，观察并比较两种类型的细菌在显微镜下的颜色和形
态特征。
实验结果显示，革兰氏阳性菌显示出紫色到紫蓝色，而革
兰氏阴性菌则呈现红色到粉色。
实验表明革兰氏染色是一种简单有
效的方法，可用于初步鉴定微生物的革兰氏阴性或阳性特征，对微
生物的分类和鉴定具有重要意义。
引言：
微生物是一类极小的生物体，包括细菌、真菌和病毒等。
通过
研究微生物可以深入了解它们的结构、生长特性以及与人类或环境
的相互作用。
微生物的分类与鉴定是微生物学研究的重要内容之一，而革兰氏染色则是微生物分类与鉴定中常用的方法之一。
革兰氏染色是以丹宁紫和碘为染料，通过染色剂与细菌细胞壁的反应来区分细菌的细胞壁类型。
革兰氏阳性菌的细胞壁由多层厚的胞外网状结构组成，可以保留紫色的染料，形成紫色。
而革兰氏阴性菌的细胞壁相对较薄，不能保留紫色的染料，在洗净后体现为红色。
实验方法：
1. 准备革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌培养物。
2. 从培养物中取一小片菌落，加入一滴蒸馏水，用炉架加热一段时间，接种于两片玻璃片上。
3. 将两片玻璃片依次在蒸馏水、丹高威液、碘酒、乙醇和伊红中浸泡。
4. 用水洗净，倒置晾干。
5. 在显微镜下观察细菌的颜色和形态特征。
实验结果：。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
革兰氏阴性杆菌微生物学检验的标准操作程序
1 检验目的
做疾病的病原学诊断，查找于疾病有关的病原菌以及了解微生物与疾病的关系，指导临床治疗及预后和流行病学的调查。
2 原理
使用梅里埃ATB微生物鉴定系统，原理见鉴定系统操作规程。
3 标本要求
（1）标本类型：血液，骨髓，脑脊液，胸水，腹水，尿液，等体液；痰液，前列腺液，脓液，组织分泌物或穿刺液等。
（2）标本采集：见标本采集手册
（3）标本储存和运输：室温放置，室温运输并立即送检。
（4）标本拒收状态：非无菌方式采集的标本或未按要求部位采取的标本。
4 容器和添加剂类型
均使用灭菌器皿盛放标本
5 试剂
（1）试剂名称：革兰氏染液、氧化酶试剂、3%触酶、血平板、中国蓝平板、SS平板、柯玛嘉平板、相关生化试剂等。
6仪器设备：
（1）接种针、接种环、酒精灯
（2）梅里埃ATB药敏鉴定仪
（3）显微镜、SPX-150B型生化培养箱、超净工作台、台式离心机、天平
7 校准程序
(送市计量质量检测研究所校准)
8 操作步骤
9质量控制：
参加我科质量管理小组组织的各项质量控制活动10患者检验结果的可报告区间
细菌鉴定到种或属，同时报告药物敏感试验结果。
11 临床意义：
为医生提供感染的病原学诊断。